微透析法研究麻黃湯對大鼠腦海馬區(qū)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)釋放的影響

唐映紅，王一奇，周惠芬，金 湛，何 昱

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 浙江 杭州 310053)

微透析法研究麻黃湯對大鼠腦海馬區(qū)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)釋放的影響

唐映紅，王一奇，周惠芬，金 湛，何 昱

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 浙江 杭州 310053)

目的 應(yīng)用微透析技術(shù)，研究中醫(yī)經(jīng)典方劑——麻黃湯對大鼠腦海馬區(qū)4種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)(谷氨酸Glu、甘氨酸Gly、天冬氨酸Asp、γ-氨基丁酸GABA)釋放的影響，并與麻黃藥材、麻黃生物堿的作用相對比。方法 SD大鼠分為6組：麻黃湯高劑量組(以麻黃生藥計4 g·kg-1)、中劑量組(以麻黃生藥計2 g·kg-1)、低劑量組(以麻黃生藥計1 g·kg-1)、麻黃藥材組(以麻黃生藥計2 g·kg-1)、麻黃生物堿組(麻黃堿7 mg·kg-1、偽麻黃堿2.4 mg·kg-1、甲基麻黃堿1.12 mg·kg-1)以及空白對照組。在動物清醒狀態(tài)下，微透析采樣技術(shù)從大鼠腦海馬區(qū)取樣，建立鄰苯二甲醛柱前衍生高效液相色譜-電化學(xué)法(HPLC-ECD)檢測腦透析液中4種神經(jīng)遞質(zhì)的含量。結(jié)果 4種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)在28 min 內(nèi)達(dá)到良好的分離。麻黃湯各劑量組、麻黃藥材組和麻黃生物堿組大鼠腦海馬區(qū)4種神經(jīng)遞質(zhì)的含量均增加，與空白對照組比較差異有顯著性(P<0.05)。與中劑量麻黃湯組比較，麻黃生物堿組在90 min時明顯降低了抑制性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)Gly和GABA水平。大鼠口服麻黃湯各劑量、麻黃藥材水煎液后，海馬區(qū)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Asp和Glu水平呈先增后降的趨勢，麻黃湯各劑量組大鼠Glu和Asp水平在給藥后90～120 min達(dá)峰值，隨著麻黃湯給藥劑量的增加，Asp和Glu含量亦增加。與中劑量麻黃湯組比較，麻黃水煎液組和麻黃生物堿組Glu水平分別在90 min和150 min達(dá)峰值，達(dá)峰值時Glu含量均明顯增加。結(jié)論 麻黃湯劑量與Asp、Glu含量的增加呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性。麻黃湯中其它組分抑制了麻黃和麻黃生物堿升高Glu水平的作用，同時促進(jìn)了麻黃生物堿對GABA及Gly含量的升高作用。

麻黃湯；麻黃；麻黃生物堿；腦微透析；高效液相色譜-電化學(xué)；氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)

麻黃湯為中醫(yī)經(jīng)典方劑，在臨床上有數(shù)千年的使用歷史。麻黃湯來源于張仲景的《傷寒論》，由麻黃、桂枝、杏仁、甘草組成[1]，具有發(fā)汗、止咳平喘的功效。麻黃湯發(fā)揮藥效的有效成分是其君藥麻黃中的生物堿類成分(主要為麻黃堿、偽麻黃堿和甲基麻黃堿)，現(xiàn)代藥理研究表明麻黃生物堿具有興奮中樞、鎮(zhèn)咳平喘、降血壓、收縮血管、發(fā)汗、擴(kuò)張支氣管等作用[2-5]，但同時具有一定的中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性[6]。有研究認(rèn)為麻黃堿導(dǎo)致神經(jīng)變性可能與腦中谷氨酸(Glu)神經(jīng)遞質(zhì)釋放有關(guān)[7]，Glu過度釋放對神經(jīng)細(xì)胞具有興奮性的毒性作用，對脊髓神經(jīng)元、海馬、丘腦及楔核等結(jié)構(gòu)都產(chǎn)生較強(qiáng)的興奮作用[8]。Glu、天冬氨酸(Asp)為腦中主要的興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)，γ-氨基丁酸(GABA)和甘氨酸(Gly)為腦中主要的抑制性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)。

筆者在進(jìn)行麻黃生物堿大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究時發(fā)現(xiàn)，麻黃生物堿給藥后，可引起大鼠表現(xiàn)出不同程度的興奮性，劑量越大，大鼠興奮性越高，過度興奮時容易導(dǎo)致大鼠的死亡，而這可能與腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放有關(guān)。故本實驗采用腦微透析取樣技術(shù)，結(jié)合高效液相-電化學(xué)法(HPLC-ECD)研究麻黃湯對大鼠腦海馬區(qū)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)釋放的影響，并與麻黃藥材和麻黃生物堿的作用進(jìn)行對比。

微透析是一種新型、微創(chuàng)、基于探針的生物采樣技術(shù)，能夠?qū)M織及細(xì)胞外液進(jìn)行取樣而不會對生物體造成明顯損傷[9-10]。與傳統(tǒng)的斷腦取組織勻漿法比較，微透析可在同一時間進(jìn)行多靶點取樣，收集活體動物腦內(nèi)微透析液，動態(tài)監(jiān)測腦組織樣品濃度變化，并且樣品無需復(fù)雜的處理即可進(jìn)儀器檢測，故而在腦部研究方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢[11-12]。

1 材料

1.1 儀器與試劑 Waters 2695高效液相色譜儀，2465電化學(xué)檢測器(美國Waters 公司)；Agilent Eclipse XDB-C18 (4.6 mm×150 mm，5μm)色譜柱(美國Agilent 公司)；MD1001灌注器推進(jìn)泵， 1 mL MD 0100灌注器，MD l000 流速控制器(美國BAS公司)；腦微透析套管(MAB2/6/9.14)，腦微透析探針(MAB6.14.4，截留分子質(zhì)量15 ku，膜長4 mm，瑞典Microbiotech/se AB公司)，腦立體定位儀(68025，深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，pH計(FE20，梅特勒-托利多公司)；Millipore純水儀(美國Millipore公司)；AL104電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)。

Glu對照品(批號SLBC5771V)、GABA對照品(批號BCBH1414V)，美國Sigma公司；Gly對照品(批號SM0315GA14)、Asp對照品(批號KN1123CA13)，鄰苯二甲醛(OPA，批號JM0326YA14)，上海源葉生物科技有限公司；鹽酸麻黃堿對照品(批號171241-201007)，鹽酸偽麻黃堿對照品(批號171237-201208)，鹽酸甲基麻黃堿對照品(批號171247-200301)，中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純；其余化學(xué)試劑均為分析純；自凝牙托水(批號20150427)，自凝牙托粉(批號20150117)，上海新世紀(jì)齒科材料有限公司。

1.2 實驗動物 健康♂ SD大鼠，體質(zhì)量(250 ± 20) g，SPF級，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(滬)2012-0002。

1.3 溶液的制備 人工腦脊液(ACSF)：精密稱取氯化鈉8.599 g、氯化鉀0.201 g、氯化鈣0.133 g、氯化鎂0.081 g，溶于1 L超純水中，0.22 μm過膜，使用前超聲脫氣20 min。

對照品儲備液的制備：分別精密稱取Asp、 Glu、 Gly、GABA對照品各10 mg，分別加ACSF于10 mL容量瓶中，超聲溶解，ACSF稀釋至刻度，得濃度分別為1 g·L-1的對照品儲備液。

OPA衍生溶液的制備：精密稱取440 mg硼酸鈉溶于10 mL超純水，0.22 μm微孔濾膜過膜，即得OPA溶液。精密吸取OPA溶液100 μL，加入亞硫酸鈉溶液100 μL，硼酸鈉溶液180 μL，渦旋混勻，當(dāng)天配制當(dāng)日使用。

麻黃湯制備：27 g麻黃加720 mL水浸泡20 min，先煎30 min，再和桂枝18 g、杏仁18 g、甘草9 g共煎30 min，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至以麻黃生藥計0.5 g·mL-1麻黃湯灌胃藥液。麻黃水煎液制備：27 g麻黃加720 mL水浸泡20 min，煎煮30 min，抽取濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮至以麻黃生藥計0.5 g·mL-1麻黃灌胃藥液。麻黃生物堿給藥溶液制備：精密稱取麻黃堿14 mg，偽麻黃堿4.8 mg，甲基麻黃堿2.24 mg，加生理鹽水18 mL溶解(采用HPLC法[13]測定麻黃湯中麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿的含量分別為0.35%、0.12%、0.03%，依據(jù)中劑量麻黃湯給藥劑量折算)。

1.4 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱，流動相A：12 g磷酸二氫鉀、0.177g氯化鈉、0.014 g乙二胺四乙酸二鈉(溶于100 μL 5 mol·L-1的氫氧化鈉溶液)溶于超純水中，加5 mol·L-1氫氧化鈉調(diào)pH至5.4，流動相B為甲醇，采用梯度洗脫方式0～12 min，4%B～4%B；12～14 min，4%B ～16%B；14～29 min，16%B ～16%B；29～30 min，16%B ～4%B。流速為0.6 mL·min-1，柱溫35 ℃，電化學(xué)檢測器溫度35 ℃，檢測電壓0.8 V。10 μL衍生劑加入 30 μL微透析樣品，混勻后20 μL進(jìn)液相檢測。

1.5 方法學(xué)考察

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取4個氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)對照品儲備液適量，加ACSF稀釋得到8個不同濃度的混合對照品溶液，分別為Asp、Glu、Gly：0.001、0.002、0.01、0.02、0.1、0.2、1、10 mg·L-1，GABA ：0.000 5、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、5 mg·L-1。分別精密吸取上述混合對照品溶液30 μL，加衍生劑10 μL，渦旋混勻，取20 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣檢測，色譜圖見Fig 1。以濃度X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)。Gly：Y=4 000 000X-64 862，r=0.999 9，線性范圍為0.001～10 mg·L-1；Asp：Y=1 000 000X-39 648，r=0.999 9，線性范圍為0.001～10 mg·L-1；Glu：Y=1 000 000X-47 124，r=0.999 8，線性范圍為0.001～10 mg·L-1；GABA ：Y=2 000 000X-5 976，r=1.000 0，線性范圍為0.000 5～5 mg·L-1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見Fig 2。

Fig 1 Microdialysis chromatograms of rat brain

A：Blank perfusate； B：Blank perfusate spiked with Asp, Glu, Gly and GABA；C：Perfusate sample after oral administration. 1：Asp，2：Glu，3：Gly，4：GABA

1.5.2 精密度考察 吸取質(zhì)量濃度為1 mg·L-1的Asp、Glu、Gly，0.5mg·L-1的GABA混合對照品溶液，衍生后連續(xù)進(jìn)液相測定6次，記錄峰面積，計算峰面積的RSD值。得到Asp、Glu、Gly、GABA 4種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的RSD分別為2.78%、2.38%、2.77%、2.88%。

1.5.3 穩(wěn)定性考察 取大鼠海馬區(qū)空白腦透析液30 μL，加入10 μL衍生劑，混勻，取20 μL進(jìn)液相進(jìn)行檢測，樣品連續(xù)進(jìn)樣3次，峰面積RSD值分別為Asp 3.2%、Glu 7.5%、Gly 1.2%、GABA 7.8%，Glu和GABA穩(wěn)定性較差，因此，衍生后的樣品應(yīng)立即進(jìn)液相進(jìn)行檢測。

1.5.4 重復(fù)性考察 取大鼠海馬區(qū)空白腦透析液30 μL，加入10 μL衍生劑，混勻，同法制備樣品6份，進(jìn)液相檢測，計算含量，得到Asp、Glu、Gly、GABA含量的RSD值分別為2.99%、2.51%、2.64%、2.94%。

1.6 微透析實驗

1.6.1 手術(shù) 大鼠按3 mL·kg-1劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，固定于大鼠專用腦立體定位儀上，頭部用剃毛機(jī)剃毛，75%酒精消毒，根據(jù)坐標(biāo)定位于海馬區(qū)(AP：+4.8 mm，ML：+5 mm，DV：-3 mm)，將探針套管插入海馬區(qū)，用釘子固定后再用牙科水泥固定，待大鼠恢復(fù)3～5 d，可自由飲水、進(jìn)食后方可用于實驗。

1.6.2 給藥 大鼠隨機(jī)分為6組，每組5只。麻黃湯高劑量組(MHDH，以麻黃生藥量計4 g·kg-1給藥)、麻黃湯中劑量組(MHDM，以麻黃生藥量計2 g·kg-1給藥)、麻黃湯低劑量組(MHDL，以麻黃生藥量計1 g·kg-1給藥)，麻黃組(ephedra，以麻黃生藥量計2 g·kg-1給藥)，麻黃生物堿組(ephedra alkaloids，麻黃堿7 mg·kg-1、偽麻黃堿2.4 mg·kg-1、甲基麻黃堿1.12 mg·kg-1依據(jù)中劑量麻黃湯給藥劑量折算)，空白組(Control，灌胃同體積生理鹽水)。

1.6.3 神經(jīng)遞質(zhì)的采集 清醒狀態(tài)下拔掉大鼠頭部探針套管，插入探針，以1 μL·min-1流速灌流ACSF，探針平衡2 h，灌胃后每30 min收集1份透析液，共收集3 h，收集的樣品立即轉(zhuǎn)入-72℃冰箱保存，待測。實驗結(jié)束后，取出探針，大鼠用過量水合氯醛腹腔注射處死，斷頭取腦，驗證取樣部位海馬區(qū)。

1.6.4 探針回收率的測定 將探針置入含Asp、Glu 、Gly 0.1 mg·L-1，GABA 0.05 mg·L-1的混合對照品溶液中，以1 μL·min-1流速灌流ACSF，收集體外透析液，并按1.4項下的色譜條件進(jìn)行測定，計算Asp、Glu 、Gly、GABA的體外探針回收率分別為30.3%、 35.6%、32.4%、34.9%。

2 結(jié)果

2.1 麻黃湯、麻黃藥材和麻黃生物堿對大鼠海馬區(qū)Asp釋放的影響 由Tab 1可知，與空白組比較，麻黃湯、麻黃藥材和麻黃生物堿組大鼠的海馬區(qū)Asp含量有明顯升高(P<0.05)。灌胃高劑量麻黃湯后，海馬區(qū)Asp含量呈先增后降的明顯趨勢，隨著麻黃湯給藥劑量增加，Asp含量亦增加。Asp在給藥麻黃湯、麻黃藥材和麻黃生物堿后90 min左右達(dá)峰值。

2.2 麻黃湯、麻黃藥材和麻黃生物堿對大鼠海馬區(qū)Gly的影響 由Tab 2可知，與空白組比較，麻黃湯、麻黃藥材和麻黃生物堿組在給藥后90～150 min對Gly含量有明顯影響(P<0.05)，Gly含量升高。麻黃湯高、中劑量組、麻黃組和麻黃生物堿組分別在給藥后120 min、150 min、150 min和90 min大鼠海馬區(qū)Gly含量達(dá)峰值。與麻黃湯中劑量組相比，麻黃生物堿組在給藥60 min后各時間點Gly含量低于麻黃湯中劑量各時間點，且在90 min時明顯降低了Gly含量。

2.3 麻黃湯、麻黃藥材和麻黃生物堿對大鼠海馬區(qū)Glu的影響 由Tab 3可知，各給藥組與空白組比較有差異(P<0.05)，Glu含量增加，且麻黃湯、麻黃藥材和麻黃生物堿組Glu含量呈先增后降的動態(tài)變化。麻黃湯3個劑量組均在120 min Glu含量達(dá)峰值，其中麻黃湯高劑量組Glu含量最高。麻黃藥材組和麻黃生物堿組分別在90、150 min 時Glu水平達(dá)峰值，達(dá)峰值時Glu含量均明顯增加，與相應(yīng)時間點中劑量麻黃湯組比較。

2.4 麻黃湯、麻黃藥材和麻黃生物堿對大鼠海馬區(qū)GABA的影響 由Tab 4可知，各給藥組與空白組比較，GABA含量增加(P<0.05)。與麻黃湯中劑量組比較，麻黃生物堿組GABA含量在60、120、150 min時較低。麻黃組與麻黃湯中劑量組比較，麻黃組前60 min GABA含量升高，90～150 min GABA含量下降。

Fig 2 Standard curve of Asp, Glu, Gly and GABA

GroupTime/min306090120150180Control14.09±0.8913.70±0.2313.76±0.0713.96±0.4314.65±1.0615.45±0.76MHDL14.85±1.0615.61±0.4016.63±4.1616.30±0.30*14.19±1.5515.71±1.02MHDM16.73±3.0719.47±2.97*19.17±1.55*19.77±2.01*16.04±3.2316.50±2.28MHDH20.92±2.97*23.53±3.47*42.48±8.91*31.91±8.1524.39±2.57*22.61±3.93*Ephedra15.78±3.8917.62±1.8520.56±4.7514.92±0.361#*19.47±5.7120.07±8.35Ephedraalkaloids21.85±2.11*17.92±2.1819.60±3.3718.32±1.72*17.85±1.58*16.67±2.34

*P<0.05vscontrol group in the same time;#P<0.05vsMHDM group in the same time

GroupTime/min306090120150180Control8.30±0.807.53±0.685.68±0.226.64±1.176.08±0.776.42±0.59MHDL8.40±0.808.98±1.026.94±0.3*6.36±1.175.71±0.806.45±0.96MHDM6.60±1.608.15±1.3612.87±1.17*9.41±1.7614.29±3.52*6.76±1.51MHDH8.46±0.288.77±0.659.23±1.42*11.57±1.88*9.81±1.60*7.47±0.80Ephedra7.28±0.596.73±0.9011.70±1.54*6.57±0.3116.05±4.886.02±0.74Ephedraalkaloids7.56±1.176.60±0.499.60±0.80*#6.91±1.368.92±2.077.72±1.23

*P<0.05vscontrol groupin the same time;#P<0.05vsMHDM group in the same time

GroupTime/min306090120150180Control14.44±1.8021.60±3.4016.10±2.5618.60±3.3720.59±3.8219.97±3.29MHDL17.61±3.7924.89±1.9949.97±3.46*88.29±2.30*64.30±5.28*46.15±7.98*MHDM14.61±1.6362.13±4.13*59.30±7.19*84.41±4.97*49.19±7.19*25.14±6.21MHDH24.69±3.03*60.87±10.03*78.71±5.90*127.28±10.62*101.71±5.45*70.14±11.43*Ephedra21.80±2.72*#37.39±8.90*#79.19±6.10*#38.09±3.37*#35.11±5.03*19.19±2.50Ephedraalkaloids15.81±1.8348.74±9.02*65.93±6.66*68.06±11.40*83.46±8.26*#40.39±8.54*

*P<0.05vscontrol group in the same time;#P<0.05vsMHDM group in the same time

GroupTime/min306090120150180Control10.37±1.498.80±0.4010.86±0.6310.69±1.2010.54±1.129.86±0.86MHDL13.15±1.1519.68±1.86*26.36±1.49*20.92±2.44*12.52±2.239.68±3.35MHDM10.43±1.1517.28±1.60*16.39±1.58*26.99±1.2*15.01±1.46*9.14±0.60MHDH11.92±1.1517.85±2.38*20.74±2.52*22.26±1.66*24.04±4.13*11.66±1.46Ephedra10.92±1.6918.88±2.78*14.04±2.0323.21±3.98*12.61±1.6610.95±1.58Ephedraalkaloids11.26±1.1516.05±1.23*10.32±1.17#15.90±2.87*#10.40±1.23#9.60±2.06

*P<0.05vscontrol group in the same time;#P<0.05vsMHDM group in the same time

3 討論

3.1 檢測方法與檢測條件的選擇 氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的檢測方法有高效液相色譜法[14]、氣相色譜法[15]以及毛細(xì)管電泳法[16]，其中最常用的是高效液相色譜法。高效液相的檢測模式有熒光、紫外以及電化學(xué)，而氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)無紫外吸收，樣品需經(jīng)衍生化后才能進(jìn)液相進(jìn)行檢測。考慮到氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)在大鼠腦海馬區(qū)含量低，而電化學(xué)檢測器靈敏度高，故本研究選取電化學(xué)檢測器。

流動相中加入乙二胺四乙酸二鈉可縮短4種神經(jīng)遞質(zhì)的分析時間。分析流速不能太快，流速過高導(dǎo)致物質(zhì)峰面積降低，過低導(dǎo)致分析時間過長，降低工作效率，經(jīng)綜合考慮，流速選為0.6 mL·min-1。

氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)在大鼠腦內(nèi)含量較低，本實驗選取了ECD電極電壓0.7～0.9 V范圍進(jìn)行優(yōu)化，電極電壓過低導(dǎo)致儀器靈敏度降低，電極過高時雖然能增加分析的靈敏度，但基線噪音大，故選擇0.8 V為本實驗檢測器的電極電壓。

3.2 體內(nèi)探針回收率 體內(nèi)探針回收率校正建立在體外探針回收率基礎(chǔ)上，當(dāng)體外探針相對回收率RR和相對釋放率RL相近時，可采用RL法作為體內(nèi)探針回收率的校正方法，即當(dāng)藥物在體內(nèi)幾乎檢測不到時，用含有藥物的灌流液灌流取樣部位，由此得到的回收率作為體內(nèi)探針校正方法，但神經(jīng)遞質(zhì)是內(nèi)源性物質(zhì)，不給藥時體內(nèi)也能檢測到，所以RL法無法作為神經(jīng)遞質(zhì)體內(nèi)探針校正方法[17]，故本實驗未做探針回收率考察。

3.3 麻黃湯組、麻黃組和麻黃生物堿組對神經(jīng)遞質(zhì)的影響 在一定劑量范圍內(nèi)，抑制性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)的升高可能是動物的一種自我保護(hù)、自我調(diào)節(jié)反應(yīng)，以此來對抗興奮性氨基酸神經(jīng)質(zhì)的過度釋放，保持體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的相對平衡[18]。與空白組比較，各劑量麻黃湯組、麻黃組和麻黃生物堿組大鼠的腦海馬區(qū)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)Asp、Glu、Gly、GABA水平均有明顯升高(P<0.05)，麻黃生物堿可能是麻黃湯及麻黃引起大鼠腦海馬區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)水平升高的物質(zhì)基礎(chǔ)。相對于其它3種氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)在給藥后海馬區(qū)的動態(tài)變化，Glu在給藥后含量變化最大，說明4種神經(jīng)遞質(zhì)中，麻黃湯、麻黃及麻黃生物堿對Glu的影響最大。

大鼠口服各劑量麻黃湯后，海馬區(qū)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Asp和Glu水平均隨時間呈現(xiàn)先增后降的趨勢。同時隨著麻黃湯給藥劑量的增加，Asp和Glu含量亦增加，說明麻黃湯劑量與Asp、Glu含量的增加呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性。麻黃湯各劑量組大鼠Glu和Asp水平在給藥后90～120 min達(dá)峰值。麻黃組和麻黃生物堿組的Glu水平分別在90 min和150 min達(dá)峰值，與相應(yīng)時間點中劑量麻黃湯組比較，麻黃組和麻黃生物堿組達(dá)峰值時Glu含量均明顯增加，說明麻黃湯中其它組分抑制了麻黃和麻黃生物堿升高Glu水平的作用。

大鼠口服中劑量麻黃湯及麻黃水煎液后，抑制性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)Gly含量呈現(xiàn)先升后降、再升再降的趨勢，高劑量麻黃湯及麻黃生物堿呈現(xiàn)先升后降的趨勢。與麻黃湯中劑量組相比，麻黃生物堿組在給藥60 min后各時間點Gly含量低于相應(yīng)時間點的麻黃湯中劑量組，且在90 min時明顯降低；同時麻黃生物堿組GABA水平下降，這說明麻黃湯中的其它組分抑制了麻黃生物堿對GABA及Gly含量的升高，口服麻黃湯后Gly的增加可抑制麻黃生物堿對腦產(chǎn)生的興奮性，即以麻黃湯用藥更安全。

(致謝：本實驗在浙江中醫(yī)藥大學(xué)心腦血管病研究所完成，感謝萬海同教授為本實驗提供的實驗平臺。)

[1] 魏鳳環(huán).麻黃湯組方原理的研究-PK-PD法研究組方對君藥麻黃效應(yīng)成分及藥理活性的影響[D].廣州：第一軍醫(yī)大學(xué),2004.

[1] Wei F H. Studies on compatibility principles of HED-the effect of the different compatibility groups on the effeetive components and pharmacological response of HE[D]. Guangzhou:First Military Med Univ, 2004.

[2] Cooper S D, Fletcher B L, Silinski M A, et al. Determination of L-ephedrine, pseudoephedrine, and caffeine in rat plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].JAnalToxicol, 2011, 35(6):341-8.

[3] 李樹學(xué),郝宏興,崔宏鵬,等. 甲基麻黃堿與偽麻黃堿鎮(zhèn)咳平喘作用比較研究[J]. 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2014,(13):99-100.

[3] Li S X, Hao H X, Cui H P, et al. Study on the effect of antitussive and antiasthmatic of methylephedrine and pseudoephedrine[J].InnerMongolJTraditChinMed, 2014,(13):99-100.

[4] 丁麗麗, 施松善, 崔 健,等. 麻黃化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中國中藥雜志, 2006, 31(20):1661-4.

[4] Ding L L, Shi S S, Cui J, et al. Advances in research of chemical constituents and pharmacological activities of Ephedra[J].ChinaJChinMatMed, 2006, 31(20):1661-4.

[5] 楊艷芳, 陸 毅, 吳高峰,等. 麻黃根提取物對自發(fā)性高血壓大鼠降壓作用的觀察[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2010, 30(17):1434-6.

[5] Yang Y F, Lu Y, Wu G F, et al. Experimental study on the hypotensive effect of Ephedra root extracts on the spontaneously hypertensive rats[J].ChinHospPharmJ, 2010, 30(17):1434-6.

[6] 張秀明. 麻杏石甘方藥效/毒兩性成分存效減毒整合機(jī)制研究—中樞神經(jīng)系統(tǒng)[D]. 廣州：南方醫(yī)科大學(xué), 2010.

[6] Zhang X M. Studies on conserving effect and reducing toxicity integrated mechanism of the effect/toxicity amphiprotic components from Ma-Xing-Shi-Gan prcscription-central nervous system[D]. Guangzhou:Southern Med Univ, 2010.

[7] Bowyer J F, Hopkins K J, Jakab R, et al. L-ephedrine-induced neurodegeneration in the parietal cortex and thalamus of the rat is dependent on hyperthermia and can be altered by the process ofinvivobrain microdialysis[J].ToxicolLett, 2001, 125(1-3):151-66.

[8] 張東明, 張佳民, 馬萬云,等. 急性力竭運(yùn)動對大鼠下丘腦氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)的影響[J]. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報, 2002, 23(2):230-3.

[8] Zhang D M, Zhang J M, Ma W Y, et al. Effect of exhausting exercise on amino acid neurotransmitters in hypothalamus of rats[J].ChemJChinUniv, 2002, 23(2):230-3.

[9] Saarinen J V, Harvima R J, Naukkarinen A, et al. Release of histamine and leukotriene C4, in immediate allergic wheal reaction as measured with the microdialysistechnique[J].ArchDermatolRes, 2000, 292(7):333-40.

[10] Plock N, Buerger C, Kloft C. Successful management of discovered pH dependence in vancomycin recovery studies: novel HPLC method for microdialysis and plasma samples[J].BiomedChromatogr, 2005, 19(3):237-44.

[11] 張春穎, 杜貴友, 王 巍,等. 微透析技術(shù)在腦缺血動物神經(jīng)遞質(zhì)研究中的應(yīng)用[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2004, 20(11):1209-11.

[11] Zhang C Y, Du G Y, Wang W, et al. Application of microdialysis in the study of neurotransmitters in cerebral ischemia animals[J].ChinPharmacolBull, 2004, 20(11):1209-11.

[12] 何雪輝, 楊志宏, 孫曉波. 微透析與LC-MS～n聯(lián)用測定腦組織中咪達(dá)唑侖/1′-羥基咪達(dá)唑侖及其腦內(nèi)藥代特征的研究[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2014,30(4):578-82.

[12] He X H, Yang Z H, Sun X B. Quantification of midazolam/1’ hydroxymidazolam and their pharmacokinetic characteristics in rat brain by microdialysis combined with LC-MSn[J].ChinPharmacolBull, 2014,30(4):578-82.

[13] 唐映紅, 萬海同, 陳建真,等. 麻黃湯中9個有效成分的微透析體外回收率研究[J].中國中藥雜志,2015, 40(18):3667-73.

[13] Tang Y H, Wan H T, Chen J Z, et al.Invitromicrodialysis recoveries of nine active ingredients in Mahuang decoction[J].ChinaJChinMatMed, 2015, 40(18):3667-73.

[14] 黃 翔. 基于腦微透析技術(shù)的丹紅注射液抗腦缺血藥效學(xué)研究[D]. 杭州：浙江中醫(yī)藥大學(xué), 2013.

[14] Huang X. Study on quality control of Danhong injection and study on pharmacodynamic of brain based microdialysis[D]. Hangzhou:Zhejiang Chinese Medical University, 2013.

[15] 趙艷萍, 丁曉霞, 王 勇,等. 氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)分析方法的研究進(jìn)展[J]. 甘肅醫(yī)藥, 2015,34(10):740-4.

[15] Zhao Y P, Ding X X, Wang Y, et al. Research progress on analytical methods of amino acid neurotransmitters[J].GansuMedJ, 2015,34(10):740-4.

[16] 黨紅梅, 付 敏, 馬萬云. 中藥對大鼠海馬區(qū)痕量氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)影響的初探[J]. 分析科學(xué)學(xué)報, 2005, 21(2):131-4.

[16] Dang H M, Fu M, Ma W Y. Study of influence of Chinese tradition medicine on trace amino acid neurotransmitters in hippocampus of rats by CZE-LIF[J].JAnalSci, 2005, 21(2):131-4.

[17] 張春穎, 杜貴友, 王 巍,等. 天麻鉤藤方對自由活動大鼠腦缺血海馬細(xì)胞外液遞質(zhì)氨基酸的影響[J]. 中國中藥雜志, 2004, 29(11):1061-5.

[17] Zhang C Y, Du G Y, Wang W, et al. Effects of Tianma Gouteng Fang on transmitter amino acids in the hippocampus extracellular liquids in freely moving rats subjected to brain ischemia[J].ChinaJChinMatMed, 2004, 29(11):1061-5.

[18] 魏鳳環(huán), 羅佳波, 莫志賢. 麻黃配伍前后對大鼠大腦額葉皮層氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響[J]. 山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2006, 30(5):392-4.

[18] Wei F H, Luo J B, Mo Z X. Effect of Herba ephedrae fore-and-aft compatibility on the contents of amino acids in the rat[J].JShandongUnivTraditChinMed, 2006, 30(5):392-4.

Effects of Mahuang decoction on hippocampal amino acid neural transmitter release in rats evaluated by microdialysis

TANG Ying-hong, WANG Yi-qi, ZHOU Hui-fen, JIN Zhan, HE Yu

(CollegeofPharmaceuticalScience,ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310053,China)

Aim To investigate the effect of high, medium and low doses of Mahuang decoction on the release amount of rat hippocampal neural transmitter (Glu, Gly, Asp, GABA), then compare Mahuang decontion with ephedra alkaloids and ephedra. Methods Rats were randomly divided into 6 groups and given orally with Mahuang decoction of high dose (calculated by ephedra 4 g·kg-1), medium dose (calculated by ephedra 2 g·kg-1), low dose (calculated by ephedra 1 g·kg-1), ephedra (calculated by ephedra 2 g·kg-1), ephedra alkaloids (ephedrine 7 mg·kg-1, pseudoephedrine 2.4 mg·kg-1, methylephedrine 1.12 mg·kg-1) and blank control group. Samples were obtained from the hippocampus of conscious rat by microdialysis sampling technique. The content of amino acid neurotransmitters in dialysates was detected using the established HPLC-ECD with OPA pre-column derivation method. Results Four amino acid neurotransmitters could be well separated in 28 min. High, medium and low doses of Mahuang decoction, ephedra and ephedra alkaloids significantly increased the content of these four amino acid neurotransmitters, compared with blank control group (P<0.05). Ephedra alkaloids significantly reduced the levels of inhibitory amino acid neurotransmitters GABA and Gly in 90 min, compared with the medium dose of Mahuang decoction. Excitatory neurotransmitters of ASP and Glu in hippocampus showed the trend of increase first and then decrease after oral administration of Mahuang decoction and ephedra. The levels of Glu and Asp reached peaks from 90 min to 120 min after treatment with Mahuang decoction, and also increased along with dose increase of Mahuang decoction. In comparison with the medium dose of Mahuang decoction group, the level of Glu reached peak at 90 min and 150 min in ephedra alkaloids group and ephedra group respectively, and the content of Glu significantly increased at peak time. Conclusions Increased content of excitatory amino acid neurotransmitters (Asp and Glu) shows positive correlation with the dose of Mahuang decoction. Other components in Mahuang decoction inhibits the up-regulation effect of ephedra and ephedra alkaloids on Glu, and promotes the up-regulation effect of ephedra alkaloids on GABA and Gly.

Mahuang decoction; ephedra; ephedra alkaloids; microdialysis; HPLC-ECD; amino acid neurotransmitter

時間：2017-3-4 11:50

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1150.050.html

2016-11-25，

2016-12-25

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81573868)；浙江省自然科學(xué)基金資助項目(No LR13H270001)；浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項目

唐映紅(1989-)，女，碩士生，研究方向：中藥學(xué)，E-mail:980822243@qq.com； 何 昱(1974-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，通訊作者，Tel:0571-61768145，E-mail: heyu0923@hotmail.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.025

A

1001-1978(2017)03-0426-07

R-332；R289.5；R322.81；R338.14；R341.7；R977.4