頭花蓼有效組分中沒食子酸、原兒茶酸在模式生物斑馬魚中的代謝研究

孫慧園，覃小麗，梅朝葉，李勇軍，鄭 林，黃 勇

(1.貴州省藥物制劑重點實驗室，2.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，3.民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，4.國家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550004)

頭花蓼有效組分中沒食子酸、原兒茶酸在模式生物斑馬魚中的代謝研究

孫慧園1,2,4，覃小麗1,2，梅朝葉1,2，李勇軍2,3，鄭 林1,2，黃 勇1,2

(1.貴州省藥物制劑重點實驗室，2.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，3.民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，4.國家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550004)

目的 采用模式生物斑馬魚研究頭花蓼有效組分中沒食子酸、原兒茶酸的代謝產(chǎn)物及其代謝轉(zhuǎn)化形式，探討模式生物斑馬魚用于研究藥物代謝的可行性及合理性。方法 采用UHPLC-Q-TOF/MS聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合Metabolite ToolsTM、質(zhì)量虧損過濾(MDF)等代謝產(chǎn)物分析技術(shù)，對各成分暴露于模式生物斑馬魚24 h后的藥液以及模式生物斑馬魚體內(nèi)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行篩查分析。結(jié)果 沒食子酸、原兒茶酸經(jīng)斑馬魚作用后，主要以甲基化、硫酸化反應(yīng)為主。在斑馬魚體內(nèi)外藥液檢測到?jīng)]食子酸原形成分和2個甲基硫酸化產(chǎn)物，以及原兒茶酸原形成分、2個甲基硫酸化產(chǎn)物、2個硫酸化產(chǎn)物。結(jié)論 頭花蓼有效組分中沒食子酸、原兒茶酸經(jīng)斑馬魚代謝后存在Ⅱ相代謝產(chǎn)物，這與大鼠體內(nèi)的代謝機制高度一致，提示斑馬魚對頭花蓼有效組分的代謝具有合理性，為闡明該藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了實驗依據(jù)。

頭花蓼；沒食子酸；原兒茶酸；斑馬魚；UHPLC-Q-TOF/MS；代謝

斑馬魚(zebrafish)又名花條魚，是輻鰭亞綱(Actinopterygii)鯉科(Cyprinidae)短擔(dān)尼魚屬(Danio)的一種熱帶淡水魚[1]。因斑馬魚具有個體小、繁殖周期短、胚胎透明易于觀察、飼養(yǎng)簡便等優(yōu)點[2]，使其成為一種理想的生物模型。且斑馬魚和人類之間的基因同源性高達(dá)87%，在分子、細(xì)胞和組織水平上，斑馬魚和哺乳動物高度相似，這意味著用斑馬魚開展藥物實驗所得到的結(jié)果在多數(shù)情況下也適用于人體。同時，斑馬魚實驗是一個整體動物實驗，它能準(zhǔn)確反映待測藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝及排泄等動態(tài)生理過程[3-5]，這為斑馬魚用于藥物代謝提供了遺傳和生理基礎(chǔ)。

頭花蓼(PolygonumcapitatumBuch.-Ham. ex D. Don)又名太陽草、水繡球、紅酸桿，系蓼科(Polygonaceae)蓼屬(Polygonum)多年生草本植物[6]，在《苗族醫(yī)藥學(xué)》、《中華本草·苗藥卷》、《貴州植物志》、2003版《貴州省中藥、民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中均有收載[7]，具有活血散瘀、清熱利濕、利尿通淋的功效，臨床上主要用于治療腎盂腎炎、泌尿系統(tǒng)結(jié)石、膀胱炎等疾病[8]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)[9]，頭花蓼的化學(xué)成分主要為揮發(fā)油、黃酮類及酚酸類等化合物?；趯嶒炇仪捌趯︻^花蓼治療泌尿系統(tǒng)感染的研究中發(fā)現(xiàn)，頭花蓼的藥理活性主要與酚酸類成分密切相關(guān)[10]，但是目前對頭花蓼中酚酸類成分的代謝研究較少。因此，本實驗以模式生物斑馬魚為體內(nèi)代謝模型，以頭花蓼提取物中具有代表性的，且被證明有活性的2個酚酸類成分[11-12](沒食子酸、原兒茶酸)為研究對象，研究2個酚酸類成分在斑馬魚體內(nèi)的代謝過程，分析2個酚酸類成分在斑馬魚體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，為闡明該藥在體內(nèi)發(fā)揮療效的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與實驗動物 UHPLC-Q-TOF/MS(超高壓液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀，包括1290 Infinity二元泵、高性能自動進(jìn)樣器、二級管陣列檢測器、柱溫箱、代謝分析軟件Metabolite Tools、質(zhì)量虧損過濾MDF功能等)；EL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；MTN-2800D氮吹濃縮裝置(天津奧特塞恩斯儀器有限公司)；Allegra 64R低溫高速離心機(美國Beckman Coulter 公司)；CQ 250A-TS超聲波清洗機(上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠)。

沒食子酸對照品(批號M32-110518)、原兒茶酸對照品(批號1198-101018)：中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心。甲酸為色譜純、乙腈為色譜純(德國Merck 公司)；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。斑馬魚成魚，野生型(Tuebigen系后代)，由南京大學(xué)模式生物研究所提供。

1.2 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18 RRHD(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，柱溫：45 ℃，流動相：0.1%甲酸水(A)- 0.1%甲酸乙腈(B)梯度洗脫，洗脫表見Tab 1。進(jìn)樣體積為2 μL。

Tab 1 The two components chromatographic conditions

1.3 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，掃描方式為負(fù)離子掃描，錐孔電壓：80 V，毛細(xì)管電壓3 KV，霧化氣(N2)壓力：1.2 bar，離子源溫度：110℃，氣體體積流量：50 L·h-1，流速：8.0 L·min-1，溫度200℃，脫溶劑氣體積流量：550 L·h-1，脫溶劑氣溫度：300℃，四級桿電子能量為8.0 eV，掃描范圍為m/z 50～1 000，校正模式選用：Enhanced Quadratic，準(zhǔn)確質(zhì)量測定采用甲酸鈉校正標(biāo)準(zhǔn)液，數(shù)據(jù)分析：Data Analysis軟件、Metabolite ToolsTM(包括Metabolite Predict及Metabolite Detect)軟件、質(zhì)量虧損過濾(MDF)。

1.4 給藥與取藥方法 給藥方法：取15條成年斑馬魚，♂♀均有，隨機分成3組，每組5只，分別置于30 mL含有0.4% DMSO純凈水溶液(空白魚組)、含有0.11 g·L-1沒食子酸的0.4% DMSO純凈水溶液(藥物魚組)、含有0.11 g·L-1原兒茶酸的0.4% DMSO純凈水溶液(藥物魚組)的棕色瓶中。同時分別設(shè)30 mL不含魚的0.4% DMSO純凈水溶液(空白溶液組)、不含魚但含有0.11 g·L-1沒食子酸的0.4% DMSO純凈水溶液 (空白藥物組)及不含魚但含有0.11 g·L-1原兒茶酸的0.4% DMSO純凈水溶液 (空白藥物組)。

取藥方法：藥物魚組分別于斑馬魚暴露藥液后0、2、4、6、8、12、18、24 h時間點每條魚取藥液0.4 mL，各時間點藥液分別混合，于-70℃冰箱放置。于末次取樣時間點24 h，同時將魚取出，用純凈水迅速洗滌3次，處死，去除魚鰭和魚磷，稱重，于-70℃冰箱放置?？瞻佐~組、空白溶液組及空白藥物組于0、24 h同法取樣。

1.5 樣品處理 藥液處理：將不同時間點藥液各2 mL，于37℃下N2吹干，殘留物加200 μL 體積分?jǐn)?shù)為0.5的甲醇溶解，15 000 r·min-1離心5 min，取上清液，采用UHPLC-Q-TOF/MS進(jìn)樣分析。

斑馬魚體處理：取各組24 h斑馬魚分別混合，剪碎，取1 g，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9% NaCl溶液5 mL勻漿，5 000 r·min-1離心10 min，取上清液，加4倍量甲醇渦旋混勻除蛋白，3 500 r·min-1離心10 min，再取上清液用N2吹干，殘留物加200 μL體積分?jǐn)?shù)為0.5的甲醇溶解，15 000 r·min-1離心5 min，上清液采用UHPLC-Q-TOF/MS進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果

通過UHPLC-Q-TOF/MS聯(lián)用技術(shù)，在正、負(fù)離子模式同時檢測沒食子酸、原兒茶酸經(jīng)斑馬魚作用后的藥液及魚體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，研究發(fā)現(xiàn)負(fù)離子模式較正離子模式靈敏，因此本次研究運用負(fù)離子模式對斑馬魚作用后的藥液及魚體內(nèi)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測。運用Metabolite Detect軟件處理后，分別得到?jīng)]食子酸和原兒茶酸的空白藥物、空白魚代謝24 h后的體外藥液、給藥魚代謝24 h后的體外藥液、給藥魚代謝24 h與空白魚代謝24 h后的體外藥液差異圖譜、空白魚體、給藥魚體、給藥魚體與空白魚體差異圖譜，見Fig 1和Fig 3。

2.1 沒食子酸在斑馬魚中的代謝產(chǎn)物鑒定分析

2.1.1 原型成分鑒定 由Metabolite Detect軟件得到的差異圖譜(Fig 1)中可知，在1.6 min處存在m/z 169.013 5[M-H]-峰的化合物，與沒食子酸對照品相同，由此確定TR1.6 min的M1為沒食子酸。

2.1.2 甲基硫酸化代謝產(chǎn)物鑒定 由Metabolite Detect軟件得到的差異圖譜(Fig 1)中可知，在2.2、2.3 min處分別存在m/z 262.987 0、262.987 6[M-H]-峰的化合物，顯示183.030 2[M-H-SO3-CH2]-的主要碎片離子峰，由SmartFormula預(yù)測的化學(xué)式分別為C8H7O8S、C8H7O5，推測TR2.2、2.3 min的M2、M3為沒食子酸甲基硫酸化代謝產(chǎn)物[13]。

2.1.3 沒食子酸代謝產(chǎn)物及可能的代謝途徑 見Fig 2。

2.1.4 沒食子酸代謝產(chǎn)物信息匯總表 經(jīng)Metabolite Detect軟件處理后，檢測到?jīng)]食子酸在模式生物斑馬魚中的體內(nèi)外代謝產(chǎn)物，見Tab 2。

2.2 原兒茶酸在斑馬魚中的代謝產(chǎn)物鑒定分析

2.2.1 原型成分鑒定 由Metabolite Detect軟件得到的差異圖譜(Fig 3)中可知，在2.5 min處存在m/z 153.019 8[M-H]-峰的化合物，與原兒茶酸對照品相同，由此確定TR2.5 min的M3為原兒茶酸。

Fig 1 Base peak chromatograms of zebrafishinvitrosolution and
invivoafter combination being exposed to zebrafish for 24 h and different chromatograms from gallic acid in negative mode

A:Blank drug; B:Invitrosolution of blank zebrafish; C:Invitrosolution of zebrafish with drug; D: Different chromatograms of C and D; E:Invivoof blank zebrafish; F:Invivoof zebrafish with drug; G:Different chromatograms of F and G

Fig 2 The major metabolites of gallic acid and possiblebiotransformation pathways in vitro and in vivo zebrafish

1:methylation and sulfate conjugation; Z:invivoof zebrafish;S:invitrosolution of zebrafish

2.2.2 甲基硫酸化代謝產(chǎn)物鑒定 由Metabolite Detect軟件得到的差異圖譜(Fig 3)中可知，在2.7、2.9 min處分別存在m/z 246.993 8、246.991 2[M-H]-峰的化合物，顯示167.035 1[M-H-SO3]-、153.020 1[M-H-SO3-CH2]-、109.030 1[M-H-SO3-CH2-COO]-的主要碎片離子峰，推測TR2.7、2.9 min的M4、M5為原兒茶酸甲基硫酸化代謝產(chǎn)物[14]。

2.2.3 硫酸化代謝產(chǎn)物鑒定 由Metabolite Detect軟件得到的差異圖譜(Fig 3)中可知，在2.0、2.2 min處分別存在m/z 232.976 6、232.975 1[M-H]-峰的化合物，顯示153.020 1[M-H-SO3]-的主要碎片離子峰，由SmartFormula預(yù)測的化學(xué)式分別為C7H5O7S、C7H5O4，且其保留時間較原兒茶酸縮短，親水性增加，推測TR2.0、2.2 min的M1、M2為原兒茶酸硫酸化代謝產(chǎn)物[14]。

2.2.4 原兒茶酸代謝產(chǎn)物及可能的代謝途徑 見Fig 4。

2.2.5 原兒茶酸代謝產(chǎn)物信息匯總表 經(jīng)Metabolite Detect軟件處理后，檢測到原兒茶酸在模式生物斑馬魚中的體內(nèi)外代謝產(chǎn)物，見Tab 3。

3 討論

本實驗運用具有高通量、高重復(fù)性、離子傳輸效率高等優(yōu)勢的UHPLC-Q-TOF /MS技術(shù)進(jìn)行體外代謝實驗研究。以模式生物斑馬魚為動物模型，分別考察頭花蓼有效組分中具有代表性且與其藥理活性密切相關(guān)的2個酚酸類成分(沒食子酸、原兒茶酸)的代謝規(guī)律；通過沒食子酸和原兒茶酸在斑馬魚和大鼠體內(nèi)的代謝途徑比較，酚酸類化合物在生物體內(nèi)主要以甲基硫酸化、葡萄糖醛酸化、硫酸化形式存在[15]。結(jié)合Metabolite Predict、MetaboliteDetect、MDF及SmartFormula等數(shù)據(jù)處理技術(shù)，分析生物樣品中的代謝產(chǎn)物，在斑馬魚魚體組織中能檢測到?jīng)]食子酸、原兒茶酸的原型成分，表明頭花蓼有效組分中沒食子酸、原兒茶酸均能吸收進(jìn)入斑馬魚體內(nèi)；同時檢測到?jīng)]食子酸及原兒茶酸的甲基硫酸化和硫酸化產(chǎn)物，這與沒食子酸和原兒茶酸在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物基本一致[13-15]，揭示沒食子酸和原兒茶酸在斑馬魚體內(nèi)的代謝途經(jīng)類似現(xiàn)有模型的Ⅱ相代謝反應(yīng)。這為探討模式生物斑馬魚用于頭花蓼有效組分中多成分代謝研究的可行性及合理性提供了可靠的實驗依據(jù)，也為闡明該藥對在體內(nèi)發(fā)揮療效的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制提供了科學(xué)依據(jù)。

Fig 3 Base peak chromatograms of zebrafishinvitrosolution
andinvivoafter combination being exposed to zebrafish for 24 h
and different chromatograms from protocatechuic acid in negative mode

A:Blank drug; B:Invitrosolution of blank zebrafish; C:Invitrosolution of zebrafish with drug; D:Different chromatograms of C and D; E:Invivoof blank zebrafish; F:Invivoof zebrafish with drug; G:Different chromatograms of F and G

Tab 2 Summary of in vitro and in vivo metabolites identification of gallic acid after being exposed to zebrafish for 24 h with mass defect filtering

Z:invivoof zebrafish; S:invitrosolution of zebrafish

Tab 3 Summary of in vitro and in vivo metabolites identification of protocatechuic acid after being exposed to zebrafish for 24 h with mass defect filtering

Z:invivoof zebrafish;S:invitrosolution of zebrafish

Fig 4 The major metabolites of protocatechuic acid and

possible biotransformation pathwaysinvitroandinvivozebrafish

1: methylation and sulfate conjugation;2: sulfate conjugation;Z:invivoof zebrafish;S:invitrosolution of zebrafish

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Metabolism study of the gallic acid and protocatechuic acid of effective fractions ofPolygonumcapitatumby model organism zebrafish

SUN Hui-yuan1,2,4,QIN Xiao-li1,2,MEI Chao-ye1,2,LI Yong-jun2,3,ZHENG Lin1,2,HUANG Yong1,2

(1.GuizhouProvincialKeyLaboratoryofPharmaceutics,Guiyang550004,China; 2.SchoolofPharmacy,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China; 3.EngineeringResearchCenterfortheDevelopment
andApplicationofEthnicMedicineandTCM,MinistryofEducation,Guiyang550004,China;4.NationalEngineeringResearchCenterofMiao’sMedicines,Guiyang550004，China)

Aim Model organism zebrafish was used to study metabolites and metabolite profile of the gallic acid and protocatechuic acid of effective fractions ofPolygonumcapitatum, and discuss the feasibility and rationality of the model organism zebrafish in the study of drug metabolism. Methods The two components were exposed to model organism zebrafish after 24 h of solution treatment by using ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight tandem mass spectrometry technology(UHPLC-Q-TOF MS) method with mass defect filter (MDF), and the data was treated with data mining software(Metabolite ToolsTM). Results After zebrafish metabolism, the main reactions of gallic acid and protocatechuic were methylation sulfated. In addition to the two parent compounds, six phase II metabolites were identified, including four methyl sulfate products and two sulfation products. Conclusions The metabolism of the gallic acid and protocatechuic acid of effective fractions ofPolygonumcapitatumby zebrafish presents phase Ⅱ metabolites, which is highly consistent with the metabolic mechanism of rats. Thus it indicates the rationality of the methods. At the same time, it also provides the experimental basis for clarifying the substance basis of the drug.

Polygonumcapitatum; gallic acid; protocatechuic acid;zebrafish;UHPLC-Q-TOF/MS; metabolism

時間：2017-3-4 11:50

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1150.038.html

2016-10-22,

2016-12-27

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81260688)；貴州省研究生卓越人才計劃項目(黔教研合ZYRC字[2014]012)；現(xiàn)代藥物研究開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心(黔教合協(xié)同創(chuàng)新字[2013]04)；民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用產(chǎn)學(xué)研基地建設(shè)(黔科合KY字[2013]122)；貴州省優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)對象專項資金(黔科合人字(2015)11號)

孫慧園(1993-)，女，碩士生，研究方向：藥物代謝動力學(xué)，Tel:0851-6908899，E-mail:644265205@qq.com; 黃 勇(1976-)，男，博士，教授，研究方向：中藥活性成分及新藥開發(fā)，通訊作者，Tel:0851-86908468，E-mail:mailofhy@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.019

A

1001-1978(2017)03-0388-06

R-332；R284.1；R289.5；R318