微波輔助酶法提取大葉梔子花總黃酮的工藝研究

劉霞+李偉+李傳靈+韓加偉+范小娜

摘要：為優(yōu)化微波輔助酶法提取大葉梔子花（Gardenia jasminoides var. grandiflora）總黃酮工藝。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，應(yīng)用中心組合設(shè)計(jì)，采用二次多項(xiàng)式逐步回歸分析對(duì)提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了微波輔助酶法提取大葉梔子花總黃酮工藝的最佳條件，即酶用量為1.8%，pH為5.0，酶解溫度為70 ℃，酶解時(shí)間為1.0 h；按此工藝條件，大葉梔子花總黃酮提取率可達(dá)2.16%。

關(guān)鍵詞：大葉梔子（Gardenia jasminoides var. grandiflora）；總黃酮；微波輔助提取法；纖維素酶解法

中圖分類號(hào)：TQ461 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）23-6219-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.055

Abstract：For optimizing the technology of extracting total flavonoids from flowers of Gardenia jasminoides var. grandiflora by microwave-assisted enzymatic method， based on single factor experiment and by application of central composite design， the technological conditions for extracting total flavonoids from flowers of Gardenia jasminoides var. grandiflora were optimized with quadratic polynomial stepwise regression analysis. It was concluded that the optimal conditions for the extraction were the enzyme dosage of 1.8%， pH 5.0， enzymolysis temperature of 70 ℃， and enzymolysis time for 1.0 h. Under these conditions， the extraction yield of total flavonoids from flowers of Gardenia jasminoides var. grandiflora was up to 2.16%.

Key words： Gardenia jasminoides var. grandiflora； total flavonoids； microwave-assisted extraction； cellulase enzymatic method

大葉梔子（Gardenia jasminoides var.grandiflora）屬于茜草科梔子屬物種[1]，又名大花梔子、荷花梔子、牡丹梔子，為常綠灌木，主要分布在江蘇、浙江、四川等地[2]。其葉大，花大而富濃香、重瓣，不結(jié)果。大葉梔子花通常被修剪成球狀植于街道旁或者公園景觀中，用于綠化造景[3]。其葉、花中含有大量的黃酮類化合物。藥理實(shí)驗(yàn)表明，黃酮類化合物有明顯的抗?jié)?、解痙、抗炎及降血脂等生物活性[4]。目前，對(duì)茜草科植物梔子果實(shí)中提取黃酮類化合物的文獻(xiàn)報(bào)道較多[5-8]，但對(duì)大葉梔子花中黃酮類化合物的提取工藝研究報(bào)道很少。以大葉梔子花為原料，對(duì)影響其黃酮提取的主要因素用響應(yīng)面試驗(yàn)，以總黃酮提取率為指標(biāo)，用方差分析法進(jìn)行分析，從而優(yōu)選大葉梔子花總黃酮的提取條件并測(cè)定其黃酮提取率，為大葉梔子花資源的合理利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大葉梔子的花采自贛州生態(tài)公園，經(jīng)贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥鑒定教研室程齊來教授鑒定。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（含量≥98%，天津一方科技有限公司）；纖維素酶（3×104 U/g，江蘇淮安百麥綠色生物能源有限公司）；無水乙醇、石油醚、鹽酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁均為分析純。

UV-6100PCS型紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；SHA-C水浴恒溫振蕩器（金壇市白塔新寶儀器廠）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市城東新瑞儀器廠）；WF-4000微波快速反應(yīng)系統(tǒng)（上海屹堯分析儀器有限公司）；FW135手提中藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；FA1104分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；202A-2電熱干燥箱（上海陽光試驗(yàn)儀器有限公司）；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取13.50 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，試驗(yàn)用現(xiàn)配的60%乙醇溶解，定容于100 mL容量瓶中，搖勻，得135.0 mg/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。再精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于10.0 mL容量瓶中。依次分別加60%乙醇稀釋至5.0 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置5 min，再加入0.3 mL的10%硝酸鋁溶液，迅速搖勻，靜置6 min，最后加入4 mL的4%氫氧化鈉溶液，混勻，用乙醇稀釋至刻度，充分搖勻。放置15 min后，以不加蘆丁的試劑作空白對(duì)照，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為509 nm。得吸光度（Y）與濃度X（mg/L）的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程Y=0.010 0X-0.000 6，R2=0.999 3。

1.2.2 大葉梔子花總黃酮的提取 大葉梔子花脫脂粉的制備：將烘干的大葉梔子花粉碎后，過60目篩，用一定比例[固液比（g/mL）=1∶30]的石油醚超聲提取30 min，棄去石油醚，濾渣揮干石油醚，干燥后冷卻備用。稱重。

酶處理：準(zhǔn)確稱取大葉梔子花脫脂粉1.0 g加20 mL去離子水，置于250 mL具塞錐形瓶中，用鹽酸溶液調(diào)pH，加入一定量纖維素酶在一定溫度下恒溫反應(yīng)一定時(shí)間后（水浴鍋中振蕩酶解160 r/min），沸水中滅活2 min，室溫下抽濾分離固體殘?jiān)蜑V液Ⅰ。

微波萃取：取20 mL 70%的乙醇溶液加入到濾渣中，移入微波快速反應(yīng)系統(tǒng)中，微波輔助處理4 min，趁熱過濾，得濾液Ⅱ，合并濾液Ⅰ和濾液Ⅱ，適當(dāng)減壓濃縮，用70%乙醇定容于50 mL的容量瓶中備用。

1.2.3 總黃酮含量測(cè)定 吸取2 mL濾液于10 mL容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線下的測(cè)定方法測(cè)吸光度，計(jì)算總黃酮提取率。

1.2.4 單因素試驗(yàn) ①酶用量。分析不同比例酶用量（1.0%、1.4%、1.8%、2.2%、2.6%）對(duì)大葉梔子花總黃酮提取率的影響；②pH。分析不同pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）對(duì)大葉梔子花總黃酮提取率的影響；③酶解溫度?？疾觳煌附鉁囟龋?5、50、55、60、65、70 ℃）對(duì)大葉梔子花總黃酮提取率的影響；④酶解時(shí)間?？疾觳煌附鈺r(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對(duì)大葉梔子花總黃酮提取率的影響。⑤微波萃取時(shí)間。考察不同微波萃取時(shí)間（2、4、6、8、10 min）對(duì)大葉梔子花總黃酮提取率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取酶用量（A）、pH（B）、酶解溫度（C）、酶解時(shí)間（D）4個(gè)對(duì)總黃酮提取率影響較大的因素，對(duì)提取工藝條件進(jìn)行響應(yīng)面分析。試驗(yàn)因素水平及編碼見表1。

1.2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 對(duì)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)優(yōu)化后的大葉梔子花總黃酮提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶用量對(duì)大葉梔子花總黃酮提取率的影響 由圖1可知，隨著酶用量的增大，總黃酮的提取率也隨之增大，當(dāng)酶用量達(dá)到2.2%時(shí)，單位底物上的酶達(dá)到飽和濃度，總黃酮提取率達(dá)到最大值。隨后增加酶的濃度，此時(shí)增加結(jié)合位點(diǎn)也無法與更多的底物反應(yīng)，總黃酮提取率反而下降，這是因?yàn)槊赣昧窟^于飽和后，包裹住試材顆粒，反而不利于黃酮類物質(zhì)的溢出[9]。故酶用量最佳為2.2%。

2.1.2 pH對(duì)大葉梔子花總黃酮提取率的影響 由圖2可知，在pH為5.5時(shí)，總黃酮提取率最大。低于此值，總黃酮的提取率隨pH增加而增大；高于此值時(shí)，總黃酮的提取率隨pH增加而減少。這是因?yàn)閜H過小或過大都能使酶變性而失活，因此選擇酶解體系的最適pH為5.5。

2.1.3 酶解溫度對(duì)大葉梔子花總黃酮提取率的影響 由圖3可知，酶解溫度在65℃時(shí)，總黃酮提取率最大。低于此值，總黃酮的提取率隨溫度增加而增大；高于此值時(shí)，總黃酮的提取率隨溫度增加反而逐漸減少。這是因?yàn)槲催_(dá)到酶活性的最適溫度時(shí)，活性無法得到充分發(fā)揮，但溫度過高也會(huì)導(dǎo)致酶失活以及變性[10]。因此，65 ℃是大葉梔子花總黃酮提取的適宜酶解溫度。

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)大葉梔子花總黃酮提取率的影響 由圖4可知，隨著酶解時(shí)間的增加，總黃酮提取率先逐漸增大，酶解時(shí)間達(dá)到1.5 h時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最大值；隨后，繼續(xù)增加酶解時(shí)間，提取率反而逐漸下降，故將最佳酶解時(shí)間定為1.5 h。

2.1.5 微波萃取時(shí)間對(duì)大葉梔子花總黃酮提取率的影響 由圖5可知，隨著微波萃取時(shí)間延長(zhǎng)，大葉梔子花總黃酮提取率先增加后下降。當(dāng)微波萃取時(shí)間為4 min時(shí)，提取率達(dá)到最大值。隨后繼續(xù)增加微波處理時(shí)間，總黃酮提取率呈下降趨勢(shì)，主要是因?yàn)榉磻?yīng)體系受熱時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致黃酮類結(jié)構(gòu)破壞，致使提取率下降。因此確定微波萃取最佳時(shí)間為4 min。

2.2 回歸模型的建立及方差分析

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6.0軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，得出方差分析結(jié)果（表3）和響應(yīng)曲面圖（圖6）。

通過多元回歸擬合分析得到大葉梔子花總黃酮提取率（Y）與酶用量（A）、pH（B）、酶解溫度（C）、酶解時(shí)間（D）之間的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=46.235 0-4.183 3×A-4.981 7×B-0.899 8×C+1.207 5×D+0.85×A×B-0.021 3×A×C+0.787 5×A×D-0.036×B×C-0.11×B×D-0.087×C×D-0.041 7×A2+0.498 3×B2+0.010 1×C2+1.088 3×D2。

由表3可以看出，回歸方程P<0.01，表明該回歸模型達(dá)到極顯著水平。模型的確定系數(shù)達(dá)0.980 5，說明該模型能解釋98.05%響應(yīng)值的變化。失擬項(xiàng)不顯著（P=0.125 4>0.05），表明方程對(duì)試驗(yàn)擬合良好，試驗(yàn)誤差小。pH和酶解溫度對(duì)總黃酮提取率影響極顯著（P<0.01），酶用量對(duì)總黃酮提取率的影響顯著（P<0.05），酶解時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著（P>0.05）?？疾煲蛩亻g的交互作用，由表3方差分析可知，在試驗(yàn)所建立的數(shù)學(xué)回歸模型中，AB、AD、BC和CD之間存在極顯著的交互作用，即酶用量與pH、酶用量與酶解時(shí)間、pH與酶解溫度和酶解溫度與酶解時(shí)間的交互作用對(duì)總黃酮提取率有極顯著的影響（P<0.01）。根據(jù)Design-Expert 8.0.6.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行最優(yōu)化分析，確定最佳工藝參數(shù)：酶用量為1.8%，pH為5.0，酶解溫度為70 ℃，酶解時(shí)間為1.0 h，在此條件下預(yù)測(cè)總黃酮的提取率為2.23%。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證模型的可靠性和穩(wěn)定性，在最佳工藝條件：酶用量為1.8%，pH為5.0，酶解溫度為70℃，酶解時(shí)間為1.0 h，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)（平行3次）。結(jié)果表明，總黃酮的提取率為2.16%（n=3）。

3 小結(jié)與討論

微波輔助提取又稱微波萃取，是利用微波瞬間穿透物料里外同時(shí)加熱進(jìn)行萃取的一種新技術(shù)。與傳統(tǒng)的回流萃取、索氏萃取和超聲波萃取等方法相比，具有設(shè)備簡(jiǎn)單、適用范圍廣、萃取率高、速度快、省時(shí)、省試劑、污染小、安全、節(jié)能等特點(diǎn)[11]。纖維素酶法能有效水解植物細(xì)胞壁上的纖維素，促進(jìn)黃酮類物質(zhì)溶出，從而提高提取率。因此采用纖維素酶解與微波萃取相結(jié)合的方法可以獲得理想的效果。

本研究采用微波輔助酶法提取大葉梔子花中總黃酮，工藝處理?xiàng)l件較溫和，通過試驗(yàn)得出的最佳工藝參數(shù)：酶用量為1.8%，pH為5.0，酶解溫度為70 ℃，酶解時(shí)間為1.0 h，該條件下總黃酮提取率為2.16%（n=3），試驗(yàn)結(jié)果略高于響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)的平均水平，說明最佳工藝條件合理，提取效果較好。該研究結(jié)果可為大葉梔子花資源的合理開發(fā)利用提供參考價(jià)。

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