小麥黃色素含量、多酚氧化酶活性和1B/1R異位相關(guān)基因的分子標(biāo)記檢測(cè)

陳泠+高春保+佟漢文+朱展望+劉易科+張宇慶+鄒娟+鮑文杰

摘要：利用與黃色素含量、多酚氧化酶（PPO）活性和1B/1R異位系性狀相關(guān)的分子標(biāo)記對(duì)158份小麥（Triticum aestivum L.）材料進(jìn)行分析，從而了解其色澤品質(zhì)狀況，并為高白度、低PPO活性小麥育種提供優(yōu)異親本資源。結(jié)果表明，低PPO活性相關(guān)等位基因Ppo-A1b和Ppo-D1a的分布頻率分別為57.6%和67.7%，低黃色素含量相關(guān)等位變異Psy-A1b和Psy-B1b的頻率分別為47.5%和60.1%，高黃色素含量相關(guān)等位基因Psy-B1c的出現(xiàn)頻率為5.1%，1B/1R異位系的分布頻率為21.5%。158份材料中同時(shí)攜帶低黃色素含量、低PPO活性等位變異組合，且為非1B/1R異位系的材料有16份，頻率為10.1%，可用于高白度面粉小麥品種的選育。

關(guān)鍵詞：小麥（Triticum aestivum L.）；黃色素含量；多酚氧化酶（PPO）活性；1B/1R異位；分子標(biāo)記

中圖分類號(hào)：S512.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）23-6050-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.009

Abstract： In order to understand the frequency of allelic variants related to yellow pigment content，polyphenol oxidase （PPO） activity and 1B/1R translocation，158 wheat（Triticum aestivum L.） lines were explored by molecular markers. Through this work，elite wheat lines could be used as parent materials to produce new wheat materials with high whiteness and low PPO activity. The results showed that the frequencies of Ppo-A1b and Ppo-D1a related to low PPO activity were 57.6% and 67.7% respectively. Psy-A1b and Psy-B1b associated with low yellow pigment content were detected with frequencies of 47.5% and 60.1% respectively. The frequency of Psy-B1c for high yellow pigment content was 5.1%. The 1B/1R translocation was found with frequency of 21.5%. Out of all 158 wheat lines，16 elite varieties contained allelic variants of low yellow pigment content， low PPO activity and non-1B/1R translocation were selected，and the frequency of these materials was 10.1%. These materials could be used for the breeding of wheat varieties with high whiteness.

Key words： wheat（Triticum aestivum L.）； yellow pigment content； polyphenol oxidase（PPO）activity； 1B/1R translocation； molecular marker

面粉色澤是評(píng)價(jià)小麥（Triticum aestivum L.）品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，對(duì)面制品的商品性有重要影響。不同地域的人們因?qū)γ媸撤N類的喜好不同，在面粉色澤選擇上存在差異。如歐洲、美國(guó)及中東的披薩以色澤黃亮為佳。中國(guó)蒸煮類面食則以色澤白亮為優(yōu)選，因此白度高的小麥品種更受中國(guó)市場(chǎng)的歡迎。

前人的研究結(jié)果表明，影響面粉色澤及面制品顏色的因素有黃色素含量、多酚氧化酶（PPO）和脂肪氧化酶（LOX）活性。LOX可催化亞油酸、亞麻酸等一些不飽和脂肪酸，釋放出高活性的氧自由基偶聯(lián)氧化面粉及面制品中的色素進(jìn)行生物漂白，從而使面粉顏色變白。因此篩選高活性的LOX可篩選白度高的小麥品種[1]。但過(guò)高的LOX活性會(huì)氧化小麥粉中的維生素A等，造成面粉營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)降低[2]，同時(shí)LOX活性與面團(tuán)強(qiáng)度、形成時(shí)間、穩(wěn)定時(shí)間和延展性呈顯著負(fù)相關(guān)，降低了小麥品質(zhì)[3，4]。另外，LOX是影響小麥儲(chǔ)藏特性的主要因素之一[5]，降低LOX活性有利于延長(zhǎng)小麥子粒以及面制品的保存期，提高其商業(yè)價(jià)值[6-8]。前人研究還證實(shí)，LOX活性在面粉儲(chǔ)藏過(guò)程中喪失較快，且與面粉白度、亮度和黃度間的相關(guān)均不顯著，不是面粉色澤改良的關(guān)鍵因素[9]。因此在選育高白度小麥品種時(shí)，選擇LOX活性高的品種對(duì)于面粉色澤影響不大，且不利于子粒及面粉的品質(zhì)和儲(chǔ)藏。

小麥黃色素的主要成分是類胡蘿卜素[10]，而八氫番茄紅素合成酶（PSY）是類胡蘿卜素合成的限速酶，直接影響子粒胚乳的顏色[11]。He等[12，13]開(kāi)發(fā)了小麥7AL和7BL染色體上Psy-A1和Psy-B1位點(diǎn)的標(biāo)記，其中標(biāo)記YP7A、YP7B-1和YP7B-2可以區(qū)分與黃色素含量高低相關(guān)的等位變異Psy-A1a、Psy-A1b、Psy-B1a、Psy-B1b和Psy-B1c，并且證實(shí)在相同Psy等位基因情況下，非1B/1R異位系的黃色素含量更低，而標(biāo)記YP7A-2、YP7B-3和YP7B-4可區(qū)分Psy-A1c、Psy-B1d和Psy-B1e，但這些等位基因與黃色素含量的相關(guān)性目前還不清楚。

PPO活性可引起面粉及面團(tuán)在加工和貯藏過(guò)程中發(fā)生褐變，降低面制品色澤。PPO活性的主效QTL位于2AL和2DL染色體上，Sun等[14]已開(kāi)發(fā)出的序列標(biāo)志位點(diǎn)（Sequence tagged sites，STS）共顯性標(biāo)記PPO18可區(qū)分2AL染色體上的Ppo-A1a和Ppo-A1b等位基因。He等[15]開(kāi)發(fā)的互補(bǔ)顯性標(biāo)記PPO16和PPO29可區(qū)分2DL染色體上的Ppo-D1a和Ppo-D1b等位變異。

本研究利用PSY、1B/1R和PPO分子標(biāo)記對(duì)湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院部分親本小麥品種中的等位變異情況進(jìn)行檢測(cè)和分布規(guī)律分析，并從中篩選低黃色素含量、低PPO活性的非1B/1R異位系小麥品種，用于改良小麥品種面粉色澤，以期篩選出聚合低黃色素含量和低PPO活性相關(guān)的多個(gè)優(yōu)異色澤等位變異組合的非1B/1R異位系育種親本資源，以便培育出適合市場(chǎng)需要的高白度面粉的小麥品種。

1 材料與方法

1.1 材料

158份供試材料選自2015-2016年湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所親本圃，包括國(guó)內(nèi)品種（系）116份，湖北省品種（系）25份，CIMMYT材料14份，其他國(guó)外材料3份。

1.2 基因組DNA的提取

于2016年4月初在大田中取材，每個(gè)品種各選取3株材料，剪取約3 cm葉片裝于2 mL離心管中（盡量剪碎，方便后續(xù)粉碎）。取材完畢后，每管加2～3粒鋼珠，500 μL CTAB溶液，100 μL三氯甲烷與異戊醇混合溶液（體積比為24∶1，下同）進(jìn)行振蕩粉碎（30 r/min，1 min），然后65 ℃水浴30 min，室溫放置15 min。在通風(fēng)櫥中加入400 μL三氯甲烷與異戊醇混合溶液，渦旋儀振蕩30 s，12 000 r/min離心7 min，吸取上清200 μL于1.5 mL離心管中，加入2倍體積-20 ℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇，顛倒數(shù)次混勻后12 000 r/min離心2 min。沉淀經(jīng)70%乙醇洗滌2～3次后溶于100 μL TE中，-20 ℃?zhèn)溆谩Ｃ總€(gè)品種若3株材料的分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果不一致，則再取3株材料進(jìn)行檢測(cè)，以重復(fù)次數(shù)最多者為最終檢測(cè)結(jié)果。

1.3 分子標(biāo)記檢測(cè)

試驗(yàn)所用分子標(biāo)記的相關(guān)信息見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系為20 μL，含16 μL ddH2O、2 μL 10×PCR buffer（Mg2+ plus）、0.4 μL dNTPs（各10 mmol/L）、0.2 μL上游引物（20 μmol/L）、0.2 μL下游引物（20 μmol/L）、0.2 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL）和1 μL模板DNA（50～100 ng），在普通PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI Veriti型）中進(jìn)行反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后利用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。YP7B-1分子標(biāo)記的結(jié)果經(jīng)12%聚丙烯酰胺電泳后銀染后拍照分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 1B/1R異位系的分子標(biāo)記檢測(cè)

非1B/1R異位系對(duì)面粉白度具有正向作用。Scar標(biāo)記可檢測(cè)1B/1R異位系，擴(kuò)增出1 500 bp的特征條帶。經(jīng)PCR檢測(cè)，供試材料中有34份為1B/1R異位系（部分結(jié)果見(jiàn)圖1A），分布頻率為21.5%。湖北省材料和CIMMYT材料中1B/1R異位系頻率很低，僅為8.0%和7.1%（表2）。

2.2 PPO活性基因的分子標(biāo)記檢測(cè)

共顯性標(biāo)記PPO18可檢測(cè)低PPO活性基因Ppo-A1b和高PPO活性基因Ppo-A1a，分別擴(kuò)增出876 bp和685 bp的特征條帶。在158份供試材料中，有91份材料含低PPO活性基因型Ppo-A1b（部分結(jié)果見(jiàn)圖1B），頻率為57.6%；另外67份材料都獲得了685 bp片段，為高PPO活性等位變異Ppo-A1a。

PPO16和PPO29為互補(bǔ)顯性標(biāo)記，分別檢測(cè)低PPO活性基因Ppo-D1a和高PPO活性基因Ppo-D1b，獲得713 bp和490 bp的特征條帶。有107份材料為低PPO活性基因型Ppo-D1a（部分結(jié)果見(jiàn)圖1C），頻率為67.7%，另外51份材料均為高PPO活性等位變異Ppo-D1b（部分結(jié)果見(jiàn)圖1D）。值得一提的是14份CIMMYT材料全部含有低PPO活性等位基因Ppo-D1a。

2.3 黃色素含量相關(guān)基因的分子標(biāo)記檢測(cè)

共顯性標(biāo)記YP7A可擴(kuò)增低、高黃色素含量基因Psy-A1b和Psy-A1a，分別獲得231 bp和194 bp的特征條帶。供試材料中，75份材料為低黃色素含量基因型Psy-A1b型，頻率為47.5%；82份材料為Psy-A1a（部分結(jié)果見(jiàn)圖2）。但寧6E125未擴(kuò)增出條帶，該材料DNA用標(biāo)記YP7A-2進(jìn)行檢測(cè)，也未擴(kuò)增出片段大小為1 001 bp（Psy-A1c）或1 686 bp（Psy-A1a/Psy-A1b）的條帶，推測(cè)該材料在此位點(diǎn)具有不同的等位基因型。

共顯性標(biāo)記YP7B-1可檢測(cè)低、高黃色素含量Psy-B1b和Psy-B1a基因型，分別擴(kuò)增出156 bp和151 bp的特征條帶。共有95份材料為低黃色素含量Psy-B1b基因型，頻率為60.1%；另外63份材料為高黃色素含量Psy-B1a基因型（部分結(jié)果見(jiàn)圖3）。顯性標(biāo)記YP7B-2可擴(kuò)增高黃色素含量Psy-B1c基因型，獲得428 bp的特征條帶。供試材料中僅有8份材料為高黃色素含量Psy-B1c基因型，頻率為5.1%（部分結(jié)果見(jiàn)圖4）。

2.4 聚合優(yōu)異色澤等位基因材料的篩選

低PPO活性等位基因Ppo-A1b和Ppo-D1a為優(yōu)異等位基因；低黃色素含量等位基因Psy-A1b和Psy-B1b，且不含Psy-B1c的為優(yōu)異等位基因；在相同Psy等位基因條件下，非1B/1R異位系材料的黃色素含量更低，即非1B/1R異位系的為優(yōu)異材料。經(jīng)分子標(biāo)記檢測(cè)，158份供試材料中含有低PPO活性優(yōu)異等位組合Ppo-A1b/Ppo-D1a的材料有64份，分布頻率為40.5%，湖北省材料和CIMMYT材料中該優(yōu)異組合均高于總體水平，頻率分別為46%和50%。含有低黃色素含量的優(yōu)異等位基因組合Psy-A1b/Psy-B1b/non Psy-B1c的材料有47份，分布頻率為29.7%，湖北省材料和CIMMYT材料中該組合頻率分別為56%和50%，是總體水平的1.7～1.9倍。同時(shí)攜帶PPO、低黃色素優(yōu)異等位基因組合，且為非1B/1R異位系的材料有16份，組合頻率為10.1%，湖北省品種中優(yōu)異等位基因組合頻率為16%，而CIMMYT材料優(yōu)異等位基因組合頻率為28.6%，約為總頻率的2.8倍，湖北省品種的1.9倍。

3 小結(jié)與討論

利用黃色素含量、PPO和1B/1R異位系相關(guān)基因分子標(biāo)記對(duì)158份小麥品種（系）進(jìn)行色澤相關(guān)基因型的分析，結(jié)果顯示這些標(biāo)記引物擴(kuò)增效果好，條帶清晰，可應(yīng)用于分子標(biāo)記檢測(cè)。值得注意的是，用標(biāo)記YP7A和YP7A-2在寧6E125品種中未檢測(cè)到Psy-A1a、Psy-A1b或Psy-A1c基因型。Psy-A1c基因型是在CIMMYT材料中發(fā)現(xiàn)的[13]，目前用標(biāo)記YP7A-2在國(guó)內(nèi)材料中未檢測(cè)到Psy-A1c基因型[17，18]，推測(cè)寧6E125中Psy-A1位點(diǎn)存在其他不同的等位基因，有待下一步試驗(yàn)證實(shí)。另外，用標(biāo)記YP7B-1和YP7B-2檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，含Psy-B1c基因型的8份材料同時(shí)也攜帶Psy-B1b等位基因。胡鳳靈等[18]發(fā)現(xiàn)含Psy-B1c基因型的材料也同時(shí)含有Psy-B1a或Psy-B1b等位基因，其具體原因有待進(jìn)一步研究。

等位基因型Ppo-A1b和Ppo-D1a與低PPO活性相關(guān)。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)Ppo-A1b分布頻率為43.8%～53.8%[17-21]，但新疆材料Ppo-A1b頻率較低，分布頻率為16.26%～38.00%[21-23]。國(guó)內(nèi)材料Ppo-D1a分布頻率范圍為58.4%～74.6%[1，17，19，21]，而新疆材料中Ppo-D1a出現(xiàn)頻率最低為48.0%[21]，最高達(dá)86.8%[22]，差異很大。本研究結(jié)果顯示，158份材料中，Ppo-A1b分布頻率為57.6%，Ppo-D1a頻率為67.7%，與前人報(bào)道的國(guó)內(nèi)研究結(jié)果基本一致。有趣的是，14份CIMMYT材料全為優(yōu)異色澤等位基因Ppo-D1a基因型。

等位基因型Psy-A1b、Psy-B1b被證明與低黃色素含量有關(guān)，Psy-A1a、Psy-B1a和Psy-B1c則與高黃色素含量有關(guān)。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，Psy-A1b基因型出現(xiàn)頻率偏低，頻率范圍為10.8%～42.8%[18，20，21，24-26]，新疆材料中Psy-A1b頻率很低，為7.70～16.25%[21-23]；僅四川省材料中Psy-A1b頻率稍高，為53.3%[17]。等位基因Psy-B1b和Psy-B1c分布頻率研究較少，Psy-B1b頻率為52.9%～56.2%[17，18]；Psy-B1c出現(xiàn)頻率很低，最高14.0%[18]，最低為四川省的1.9%[17]。本研究結(jié)果顯示，158份材料中Psy-A1b分布頻率為47.5%，Psy-B1b頻率為60.1%，Psy-B1c頻率為5.1%，即與低黃色素含量相關(guān)基因型Psy-A1b和Psy-B1b出現(xiàn)頻率高于全國(guó)平均水平。而湖北省材料和CIMMYT材料中Psy-A1b和PsyB1b的分布頻率更高，湖北省材料分別為68.0%和76.0%，CIMMYT材料分別為64.3%和71.4%，且都不含有與高黃色素含量相關(guān)的基因型Psy-B1c。

國(guó)內(nèi)材料1B/1R異位系的分子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其頻率范圍為10.4%～34.3%[20，21，27，28]，甘肅省材料中1B/1R異位系的分布較多，為33.60%～45.19%[1，24]。本研究發(fā)現(xiàn)，158份材料中1B/1R的出現(xiàn)頻率為21.5%，與前人結(jié)果一致。而湖北省材料和CIMMYT材料中1B/1R的出現(xiàn)頻率很低，僅為8.0%和7.1%。

158份材料中低PPO活性等位基因組合 Ppo-A1b/Ppo-D1a的出現(xiàn)頻率為40.5%，與前人研究結(jié)果相似[17，19]。低黃色素含量等位基因組合Psy-A1b/Psy-B1b/non Psy-B1c的材料較少，而同時(shí)含低PPO活性和低黃色素含量等位基因組合，且為非1B/1R異位系的頻率僅10.1%，湖北省材料和CIMMYT材料中優(yōu)異色澤等位基因分布頻率高于國(guó)內(nèi)平均水平。引人關(guān)注的是，湖北省材料和CIMMYT材料中Ppo-A1b/Ppo-D1a和Psy-A1b/Psy-B1b/non Psy-B1c組合出現(xiàn)頻率差異不大，但CIMMYT材料中聚合這兩種組合的出現(xiàn)頻率卻很高，頻率為28.6%，是湖北省材料的1.9倍，可見(jiàn)湖北省材料需要提高多個(gè)優(yōu)異等位基因組合的出現(xiàn)頻率，而對(duì)于國(guó)內(nèi)材料來(lái)說(shuō)，不僅要提高各優(yōu)異色澤等位基因的出現(xiàn)頻率，更要加速多個(gè)優(yōu)異色澤等位基因的聚合。

通過(guò)分子標(biāo)記篩選，158份材料中同時(shí)攜帶低PPO活性和低黃色素含量等位基因組合，且為非1B/1R異位系的材料有16份，分別為04012、04020、04103、09P137、川麥43、川麥50、神麥2000、紫小麥（1135）、華2128、鄂麥14、鄂麥15、鄂麥16、10H0319、10H1129、10H1193和14FHBSN6418，這些材料可用于高白度面粉小麥品種的選育。

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