鹽脅迫下唐古特白刺葉片的掃描電鏡觀察

史嬋，楊秀清，閆海冰

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山西 太谷 030801)

鹽脅迫下唐古特白刺葉片的掃描電鏡觀察

史嬋，楊秀清，閆海冰*

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山西 太谷 030801)

[目的]為研究唐古特白刺的耐鹽堿性，[方法]采用掃描電子顯微鏡對(duì)不同鹽分脅迫下一年生唐古特白刺實(shí)生幼苗葉片進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)的觀察。[結(jié)果]結(jié)果表明，在四組鹽分脅迫下，白刺葉表面均有蠟質(zhì)出現(xiàn)，且主要表現(xiàn)為各鹽分高濃度脅迫下氣孔周圍蠟質(zhì)增多，且葉片細(xì)胞褶皺明顯。與對(duì)照相比，四組鹽分脅迫下葉表皮氣孔長(zhǎng)度、寬度、面積下降，氣孔密度增大。隨鹽分濃度的增加，堿性鹽和中性鹽在300 mmol·L-1脅迫下氣孔開(kāi)度即大幅降低，且堿性鹽脅迫下降低值最大；混合鹽堿和單鹽脅迫下氣孔開(kāi)度先增加后降低，且單鹽300 mmol·L-1時(shí)達(dá)最高值。[結(jié)論]研究結(jié)果表明堿性鹽對(duì)白刺傷害較大，低濃度單鹽有利于白刺生長(zhǎng)，白刺幼苗可通過(guò)調(diào)節(jié)氣孔開(kāi)度、氣孔密度及氣孔周圍蠟質(zhì)的形成或泌鹽表現(xiàn)出一定的耐鹽特性。

鹽分脅迫；葉表面；葉表皮氣孔；唐古特白刺

唐古特白刺(Nitrariatangutorum)為蒺藜科(Zygophyllaceae)白刺屬(NitrariaL.)落葉灌木類資源，是一種耐鹽堿性極強(qiáng)的生態(tài)抗逆兼果肉經(jīng)濟(jì)型植物。白刺多生長(zhǎng)在干燥、鹽堿、多風(fēng)、植被稀少的嚴(yán)酷環(huán)境中[1]。長(zhǎng)期的生物演化和環(huán)境脅迫使其逐漸形成了自身特有的對(duì)逆境的生態(tài)防御機(jī)制，在形態(tài)構(gòu)造上表現(xiàn)出特有的一些對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)特征。研究白刺在逆境脅迫下的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化是白刺抗逆性研究的基礎(chǔ)。氣孔作為高等陸地植物表皮所特有的結(jié)構(gòu)，是植物與環(huán)境氣體交換的通道。植物葉片表皮上氣孔的閉合、分布以及發(fā)育過(guò)程對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)過(guò)程至關(guān)重要[2～5]。本研究采用掃描電子顯微鏡對(duì)不同鹽分脅迫下唐古特白刺葉表面及葉表皮氣孔特征變化進(jìn)行了系統(tǒng)觀察，為研究白刺的生理生態(tài)學(xué)特征、確定白刺的鹽堿耐受性范圍以及白刺在鹽堿地土壤改良和植被恢復(fù)中的開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源及實(shí)生苗培育

白刺種子采自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市磴口縣境內(nèi)烏蘭布和沙漠東北部(海拔1 036 m, 40°32′N, 106°28′E)白刺產(chǎn)地的野生種。在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)苗圃(海拔800 m, 37°30′N，112°35′E)進(jìn)行播種育苗。試驗(yàn)地深翻后，按10 cm以上表層壤土∶細(xì)沙∶腐熟牛糞 = 4∶2∶1的比例混合形成輕沙壤土，0.5% KMnO4溶液進(jìn)行土壤消毒后，做低床開(kāi)溝，將預(yù)先浸泡并消毒的種子進(jìn)行條播。播溝深5 cm，溝間距30 cm，種子均勻播撒后，覆土并整平床面，進(jìn)行播后常規(guī)管理。

1.2 鹽脅迫處理及取材方法

待白刺幼苗出土長(zhǎng)出6～8片真葉時(shí)，挑選長(zhǎng)勢(shì)較好且均勻一致的植株，直接將其根部浸于預(yù)先配置好脅迫處理液的三角瓶中進(jìn)行脅迫處理。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置4種鹽分(中性鹽NaCl∶Na2SO4(1∶1)、堿性鹽NaHCO3∶Na2CO3(1∶1)、混合鹽堿NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3(1∶1∶1∶1)和單鹽NaCl)以及每種鹽分的4個(gè)濃度梯度，分別為200、300、400、500 mmol·L-1(4種濃度梯度下白刺株高增長(zhǎng)比例及生物量均低于對(duì)照)，處理植株共16株。待脅迫處理12 h后有植株葉片開(kāi)始萎蔫，植株間有差異表現(xiàn)時(shí)取白刺幼苗中上部第2節(jié)完好葉片，切成適當(dāng)?shù)男《蝹溆?，同時(shí)取未脅迫處理的葉片作為對(duì)照。

1.3 掃描電鏡樣品的制備與觀察

用蒸餾水將將取下的樣品表面沖洗干凈，迅速置于3%戊二醛固定液(0.1 mol·L-1, pH 7.2磷酸鹽緩沖液配制)中，真空泵抽氣使材料下沉后，0～4 ℃下固定2 d。用相同的磷酸緩沖液沖洗3次，系列乙醇30%、50%、70%、80%、90%、95%逐級(jí)脫水，每級(jí)15 min，100%乙醇脫水兩次，每次20 min，然后叔丁醇置換，JEOL JFD-320冷凍干燥，干燥后的材料用電膠帶粘在樣品臺(tái)上，用JEOL JFC-1600離子濺射鍍膜儀噴鍍鉑金，噴鍍好的材料放入JEOL JEM-6490 LV 掃描電子顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察、拍照并記錄。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

用Digital Micrograph軟件測(cè)量氣孔器大小，每枚葉片在顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)獨(dú)立視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

各項(xiàng)指標(biāo)和圖像數(shù)據(jù)等所有數(shù)據(jù)均為重復(fù)測(cè)定的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(重復(fù)次數(shù)>3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽脅迫對(duì)白刺葉片表皮細(xì)胞的影響

白刺葉片下表皮氣孔密度大于上表皮，這符合荒漠植物葉片氣孔分布特征下多上少，此特征可以減弱植物的蒸騰作用，避免植物體內(nèi)過(guò)多水分散失，這是荒漠植物對(duì)環(huán)境的一種適應(yīng)[6]。不同鹽分脅迫下，白刺葉片表皮細(xì)胞與對(duì)照相比發(fā)生不同程度的變化。由圖1可以觀察到白刺葉表皮有蠟質(zhì)，氣孔保衛(wèi)細(xì)胞為腎形，表面平滑，氣孔呈橢圓形，氣孔外拱蓋，并且內(nèi)層明顯。

圖1 未脅迫下的葉表面Fig.1 Leaf surface without stress

由圖2可以看出，在中性鹽脅迫下，白刺葉片細(xì)胞褶皺，濃度達(dá)到300 mmol·L-1時(shí)，氣孔周圍蠟質(zhì)明顯增加，氣孔微張。

圖2 1、2、3、4表示中性鹽200、300、400、500 mmol·L-1脅迫下的葉表面Fig.2 1, 2, 3, 4 indicate leaf surface under neutral salt stress of 200, 300, 400, 500 mmol·L-1

由圖3可以觀察到，堿性鹽濃度達(dá)到500 mmol·L-1時(shí)，保衛(wèi)細(xì)胞下陷。

圖3 5、6、7、8表示堿性鹽200、300、400、500 mmol·L-1脅迫下的葉表面Fig.3 5, 6, 7, 8 indicate leaf surface under alkaline salt stress of 200, 300, 400, 500 mmol·L-1

圖4可以發(fā)現(xiàn)，表皮細(xì)胞在混合鹽堿濃度為400 mmol·L-1急劇皺縮，當(dāng)濃度達(dá)到500 mmol·L-1時(shí)，氣孔口被蠟質(zhì)覆蓋，氣孔周圍蠟質(zhì)增多。

圖4 9、10、11、12表示混合鹽堿200、300、400、500 mmol·L-1脅迫下的葉表面Fig.4 9, 10, 11, 12 indicate leaf surface under mixed salt stress of 200, 300, 400, 500 mmol·L-1

在圖5中可以觀察到，在單鹽脅迫條件下，氣孔周圍被蠟質(zhì)覆蓋，當(dāng)濃度為500 mmol·L-1時(shí)，表皮細(xì)胞皺縮嚴(yán)重，氣孔微張。

圖5 13、14、15、16表示單鹽200、300、400、500 mmol·L-1脅迫下的葉表面Fig.5 13, 14, 15, 16 indicate leaf surface under simple salt stress of 200, 300, 400, 500 mmol·L-1

圖6 不同鹽脅迫下氣孔長(zhǎng)度變化Fig.6 Stomata length change under different salt stress

圖7 不同鹽脅迫下氣孔寬度變化Fig.7 Stomata width change under different salt stress

圖8 不同鹽脅迫下氣孔面積變化Fig.8 Stomatal area under the different salt stress

圖9 不同脅迫下氣孔密度變化Fig.9 Stomatal density under different stress 注：圖6～圖9中，A代表中性鹽 NaCl∶Na2SO4(1∶1)，B代表堿性鹽 NaHCO3∶Na2CO3(1∶1)，C代表混合鹽堿 NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3 (1∶1∶1∶1)，D 代表單鹽NaClNote: In Fig.6～Fig.9, A indicate neutral salt stress NaCl∶Na2SO4(1∶1)， B indicates alkalic salt stress NaHCO3∶Na2CO3(1∶1),C indicates salt-alkaline mixed stress NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3 (1∶1∶1∶1), D indicates simple salt stress NaCl

2.2 不同鹽分脅迫下氣孔長(zhǎng)度、寬度及面積的變化

由圖6～圖8可見(jiàn)，白刺葉面氣孔的長(zhǎng)度、寬度、面積變化相似，均低于對(duì)照。其中，中性鹽NaCl∶Na2SO4(1∶1)脅迫下，隨著鹽分濃度升高，白刺葉片氣孔長(zhǎng)度、寬度及氣孔面積呈降低趨勢(shì)，僅在500 mmol·L-1時(shí)表現(xiàn)出驟增；堿性鹽NaHCO3∶Na2CO3(1∶1)脅迫下，上述3指標(biāo)隨鹽分濃度升高整體呈下降趨勢(shì)，且在300 mmol·L-1脅迫下即呈現(xiàn)最大幅度降低值；混合鹽堿NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3(1∶1∶1∶1)脅迫下，氣孔長(zhǎng)度在300 mmol·L-1時(shí)達(dá)最高值，氣孔寬度和氣孔面積在400 mmol·L-1達(dá)到最高值，之后各指標(biāo)均呈下降趨勢(shì)；單鹽NaCl脅迫下，氣孔長(zhǎng)度、寬度及面積均在300 mmol·L-1時(shí)達(dá)到最高值，之后各指標(biāo)呈下降趨勢(shì)。

2.3 不同鹽分脅迫下氣孔密度的變化

圖9結(jié)果表明，不同鹽分脅迫下葉片氣孔密度均高于對(duì)照。中性鹽濃度為300 mmol·L-1時(shí)，氣孔密度最大為128個(gè)·mm-2，之后密度變化趨勢(shì)下降，當(dāng)濃度達(dá)到400 mmol·L-1時(shí)密度變化趨勢(shì)又緩慢升高。在堿性鹽脅迫條件下，隨鹽分濃度增大氣孔密度先上升后下降再上升趨勢(shì)，且在300 mmol·L-1脅迫下密度呈最低值 (為57個(gè)·mm-2)。在混合堿脅迫下氣孔密度先降低，在300 mmol·L-1時(shí)密度最小，在400 mmol·L-1時(shí)密度最大。單鹽脅迫條件下，氣孔密度在500 mmol·L-1脅迫濃度時(shí)達(dá)最大。

3 討論

3.1 不同鹽分脅迫下白刺葉表面結(jié)構(gòu)特征

植物對(duì)環(huán)境的變化都有一定的響應(yīng)能力和自我調(diào)節(jié)機(jī)制，能夠通過(guò)自身的形態(tài)變化和生理生化反應(yīng)來(lái)適應(yīng)不斷變化的環(huán)境[6]。白刺在不同鹽分脅迫處理下，葉表面均有蠟質(zhì)出現(xiàn)，且主要表現(xiàn)為各鹽分高濃度脅迫下蠟質(zhì)增多。葉表面上存在的蠟質(zhì)這種形態(tài)結(jié)構(gòu)特征可以解釋為對(duì)水分需求的平衡，由于蠟質(zhì)具有保水作用可減少非氣孔的蒸騰作用[7]，這與成鐵龍的研究結(jié)果類似[8]，而且有研究表明葉表面的蠟質(zhì)可能具有一定的泌鹽能力[9]。

3.2 逆境下白刺氣孔器特征

植物葉表面的氣孔是葉片與外界環(huán)境進(jìn)行氣體、水分交換的主要通道，對(duì)植物的光合、呼吸、蒸騰等生理活動(dòng)起著重要的調(diào)節(jié)作用，鹽脅迫引起氣孔特性改變[10～14]。白刺葉片氣孔長(zhǎng)寬與氣孔活動(dòng)密切相關(guān)，保衛(wèi)細(xì)胞之間距離增加，氣孔開(kāi)度大，反之保衛(wèi)細(xì)胞距離縮短，氣孔開(kāi)度變小甚至關(guān)閉。在中性鹽脅迫下，氣孔長(zhǎng)寬變化均為先降低后增加，這表明中性鹽濃度的升高導(dǎo)致氣孔開(kāi)度降低，是植物通過(guò)降低氣孔開(kāi)度以減少蒸騰作用，緩解水分缺失。濃度達(dá)到500 mmol·L-1時(shí)氣孔開(kāi)度增大說(shuō)明白刺具有耐鹽性，可能通過(guò)蠟質(zhì)向外泌鹽或其他方式將鹽分排出體外。在堿性鹽脅迫下，白刺葉片氣孔開(kāi)度在300 mmol·L-1時(shí)即大幅下降，這表明堿性鹽在低濃度即對(duì)白刺葉片細(xì)胞傷害嚴(yán)重，但同時(shí)也表明白刺在高濃度堿性鹽脅迫下仍具有調(diào)節(jié)能力，具有緩解高濃度下植物細(xì)胞水分虧缺的能力。在混合鹽堿鹽脅迫下，氣孔閉塞，有些氣孔皺縮變形，氣孔口有絲狀物質(zhì)出現(xiàn)，這可能是混合鹽堿脅迫影響氣孔生理功能。在單鹽脅迫下，氣孔開(kāi)度在300 mmol·L-1時(shí)最大，這表明在單鹽濃度300 mmol·L-1范圍內(nèi)，白刺的耐鹽性最強(qiáng)，隨著濃度的升高，葉表面嚴(yán)重皺縮但是氣孔仍張開(kāi)，這表明在單鹽下雖然植物失水，但仍然具有很強(qiáng)的調(diào)節(jié)自身滲透勢(shì)的能力。

不同鹽分脅迫下氣孔密度均高于對(duì)照，這可能是由于鹽脅迫造成葉片萎蔫，導(dǎo)致所測(cè)單位氣孔數(shù)量增加，密度增加，這與李偉的研究結(jié)果相同[15]。

4 結(jié)論

(1)掃描電鏡下不同鹽分脅迫處理后白刺葉表面特征表現(xiàn)為：葉表面均有蠟質(zhì)出現(xiàn)，且主要表現(xiàn)為各鹽分高濃度脅迫下氣孔周圍蠟質(zhì)增多，且葉片細(xì)胞褶皺明顯。

(2)與對(duì)照相比，4組鹽分脅迫下葉表皮氣孔長(zhǎng)度、寬度、面積下降，氣孔密度增大。隨鹽分濃度的增加，堿性鹽和中性鹽在300 mmol·L-1脅迫下氣孔開(kāi)度即大幅降低，且堿性鹽脅迫下降低值最大；混合鹽堿和單鹽脅迫下氣孔開(kāi)度先增加后降低，且單鹽300 mmol·L-1時(shí)達(dá)最高值。

(3)綜合研究表明，研究中4種鹽分隨脅迫濃度的變化對(duì)白刺表皮細(xì)胞造成不同程度的傷害。堿性鹽對(duì)白刺傷害較大，低濃度單鹽有利于白刺生長(zhǎng)，白刺幼苗可通過(guò)調(diào)節(jié)氣孔開(kāi)度、氣孔密度及氣孔周圍蠟質(zhì)的形成或泌鹽表現(xiàn)出一定的耐鹽特性。

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(編輯：梁文俊)

Microscopic structure of leaves inNitrariatangutorumunder salinity stress

Shi Chan, Yang Xiuqing, Yan Haibing*

(CollegeofForesty,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

[Objective]For the purpose to gain insight into the salinity tolerance ofNitrariatangutorum.[Methods]We used scanning electron microscope to observe microscopic structure of leaves in annualNitrariatangutorumseedlings, which were under different salt stress.[Results]The results indicated that all the leaf surface of white thorn under different salt stresses had wax, the higher salt concentration, the more wax behind stomata, and the more obviously blade cell folding. Compared with control, the length, width and area of stomata located on the leaf blade surface were decreased, but the stoma density was increased. With the increasing of salt stress concentration, stoma aperture reduces by huge amounts, even starting at 300 mmol·L-1stress of alkaline and neutral salinity, and the reduction value under alkaline salinity stress was significant. Stoma aperture increased firstly and then decreased under mixed and single salinity stress, and peaked at 300 mmol·L-1stress of single salinity.[Conclusion]Our research indicated that the alkaline salt damaged white thorn more strongly than other salt stress. The single salt with low concentration benefited the growth of white thorn. White thorn performs salinity tolerance characterized by adjusting stoma aperture and density, forming wax which surrounded the stomata or salt secretion.

Salinity stress， Leaves blade， Leaves blade stoma，Natrariatangutorum

2016-05-13

2016-09-28

史嬋(1993-)，女(漢)，河北石家莊人，碩士研究生，研究方向：森林培育

*通信作者：閆海冰，副教授，碩士生導(dǎo)師。Tel: 0354-6288263；E-mail: yhb5188@126.com

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31470631)；山西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2013011030-3)

S718.5

A

1671-8151(2017)01-0035-05