馬鈴薯M病毒生物學特性研究

張威，白艷菊，文景芝，范國權(quán)，高艷玲，呂典秋，申宇，邱彩玲，張抒，袁紅梅

（1.東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院植物脫毒苗木研究所，哈爾濱 150086；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所，哈爾濱 150086）

馬鈴薯M病毒生物學特性研究

張威1,2，白艷菊2，文景芝1*，范國權(quán)2，高艷玲2，呂典秋2，申宇2，邱彩玲2，張抒2，袁紅梅3

（1.東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院植物脫毒苗木研究所，哈爾濱 150086；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所，哈爾濱 150086）

測定馬鈴薯M病毒（Potato virus M，PVM）寄主范圍，并作PVM接種條件優(yōu)化試驗。結(jié)果表明，PVM僅侵染15種指示植物中的4種，各種植物癥狀表現(xiàn)不同。莧色黎（Chenopodium amaranticolor）和千日紅（Gomphrena globosa L.）接種葉片上產(chǎn)生枯斑，可作為PVM枯斑寄主；36號煙（Nicotiana occidentalis“pi”）系統(tǒng)發(fā)病，新生葉片產(chǎn)生皺縮、泡斑、葉邊緣卷曲等癥狀，植株長勢矮小，可作為PVM系統(tǒng)侵染鑒定寄主；PVM系統(tǒng)侵染番茄（Lycopersicon pimpinellifolium）速度快，但無癥狀，番茄可作為PVM繁殖寄主。PVM雖可侵染不同生育期寄主，以接種中上部葉位侵染效果最好，但在不同寄主不同葉位分布并不一致，番茄體內(nèi)中部葉片病毒含量相對較高，在莧色黎上則分布較均勻。明確PVM最適培養(yǎng)溫度為23～29℃。最高稀釋度64倍時（OD405=0.201）仍可成功侵染莧色黎。為PVM純毒源擴繁及制備該病毒抗血清提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

馬鈴薯；病毒；PVM；生物學特性

馬鈴薯M病毒（Potato virus M，PVM）自然寄主范圍較窄，主要侵染茄科植物，包括馬鈴薯、番茄、洋金花及人參果等[1]，其中，最主要寄主是馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）。PVM 1923年于美國首次分離得到[2]。自然條件下，PVM可機械傳播，也可通過蚜蟲以非持久性方式傳播[3-5]。目前PVM在世界范圍內(nèi)馬鈴薯種植區(qū)普遍存在[6-8]，造成馬鈴薯產(chǎn)量損失達15%～45%[6]，如與其他病毒復(fù)合侵染將會帶來更大產(chǎn)量損失[9-10]。因此，PVM是世界各國種薯生產(chǎn)過程中重要檢測防控目標之一，也是馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)達國家種薯認證嚴格控制有害生物[11]。

目前，尚無有效化學藥劑防治PVM病毒。雖然利用莖尖分生組織培育脫毒種薯是防治PVM有效方法[12]，但脫毒種薯生產(chǎn)需病毒檢測。血清學DAS-ELISA技術(shù)是大規(guī)模馬鈴薯病毒檢測最常用方法[13-14]，其廣譜性強、準確性高、操作簡便。目前中國馬鈴薯病毒檢測主要依靠進口試劑盒（美國Agdia和英國Adgen），檢測成本高，試劑盒國產(chǎn)化勢在必行。

PVM病毒提純是試劑盒生產(chǎn)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，快速、大量獲得PVM純毒源是PVM提純基礎(chǔ)。本文開展PVM對15種指示植物寄主范圍測定并在此基礎(chǔ)上研究接種條件等生物學特性，為PVM分離鑒定及PVM血清學檢測，試劑盒制備奠定基礎(chǔ)，為PVM病毒病防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

指示植物15種：千日紅（Gomphrena globosa L.）、本氏煙（Nicotiana benthamiana）、黃苗榆煙（Nicotiana samsun）、番茄（Lycopersicon pimpinellifolium）、莧色藜（Chenopodium amaranticolor）、心葉煙（Nicotiana glutinosa）、指尖椒（Capsicum annum）、45號煙（Nicotiana occidentalis）、36號煙（Nicotiana occidentalis“pi”）、德莫尼煙（Nicotiana debneyi）、洋酸漿（Physalis floridana）、假酸漿（Nicandra physaloides）、白花刺果蔓陀蘿（Datura stramonium）、茄子（Solanam melongena）和黃花煙（Nicotiana rustica）。

馬鈴薯毒源材料“2008-C-131”經(jīng)電鏡和DASELISA方法檢測，確認除PVM外不含有PVX、PVY、PVS、PLRV、PVA、PVV、PMTV、PAMV、TMV、AMV和TRV 11種馬鈴薯病毒，DAS-ELISA檢測OD值為3.654。

1.2 方法

1.2.1 指示植物種植與接種

智能溫室內(nèi)按照草炭：珍珠巖：爐灰=3：1：1比例配制基質(zhì)，混勻后121℃濕熱滅菌30 min，冷卻后裝在口徑25 cm花盆中，灌透水后種子均勻撒播，覆土0.5～1.0 cm[15]。待苗長至2～3 cm時分苗。

待接種植株葉片上均勻撒少許碳化硅細粉，然后用棉簽沾PVM病毒汁液[毒源：接種緩沖液（含10 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液，pH 7.5，32 mmol·L-1Na2SO3）=1 g：3.3 mL]摩擦接種，接種1 h后清水沖掉碳化硅細粉[16]。

1.2.2 DAS-ELISA檢測

馬鈴薯病毒檢測試劑盒（Agdia Inc.,Elkhart, ID,U.S.）對接種后指示植物葉片作DAS-ELISA檢測，檢測流程參考說明書。酶聯(lián)儀（SpectraMax Plus384,Molecular Devices）在405 nm處讀取檢測樣品OD值。

1.2.3 PVM寄主范圍測定

將PVM病毒汁液接種到15種指示植物上，每天分別對接種葉片和新生葉片取樣，連續(xù)取樣20 d，樣品保存于-70℃統(tǒng)一作PVM病毒DAS-ELISA檢測。當接種葉片檢測結(jié)果為陽性時，表明接種成功；當新生葉片檢測結(jié)果為陽性時，表明植株開始系統(tǒng)侵染并處于發(fā)病初期；當新生葉片OD405達3.0以上，表明植株系統(tǒng)侵染達發(fā)病高峰期。每天觀察記錄癥狀，出現(xiàn)典型癥狀時拍照。

1.2.4 PVM接種條件優(yōu)化

PVM最適接種時期：在26℃條件下，分別對出苗20、40和60 d枯斑寄主和系統(tǒng)侵染寄主接種，15 d后枯斑寄主取接種葉片、系統(tǒng)侵染寄主取頂葉數(shù)第4片葉作DAS-ELISA檢測，確定最適接種時期。

PVM最適接種葉位：在26℃條件下，同時接種成株期枯斑寄主和系統(tǒng)侵染寄主每天取不同葉位葉片作DAS-ELISA檢測，根據(jù)OD405確定最適接種葉位。在枯斑寄主接種15 d后和系統(tǒng)侵染寄主達到系統(tǒng)發(fā)病高峰期時，根據(jù)OD405評價不同葉位病毒濃度。

PVM最適培養(yǎng)溫度：模擬自然環(huán)境溫度變化區(qū)間，在人工氣候箱中分別設(shè)定15、17、20、23、25、27、29和31℃培養(yǎng)條件，每天光照16 h，黑暗8 h，接種8葉期系統(tǒng)侵染寄主。接種液在人工氣候箱中平衡3～5 min后開始接種，每隔1 d對第4片葉取樣，根據(jù)OD405確定最適接種溫度。

PVM稀釋限點：將毒源“2008-C-131”（OD405為3.654）加3.3倍接種緩沖液研磨[16]，再用接種緩沖液2n稀釋（DAS-ELISA測試OD405），在26℃條件下，接種8葉期枯斑寄主，第4、8、12天取該接種葉片，根據(jù)OD405確定PVM可侵染寄主植物稀釋限點。

以上試驗每個處理3次重復(fù)。最適接種葉位試驗接種全部葉片，其他試驗接種頂葉數(shù)第2片葉。以接種緩沖液植株為陰性對照。溫室溫度24～31℃，每天光照16 h，黑暗8 h。于2016年6～9月開展試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 PVM寄主范圍測定

千日紅接種PVM后第4天接種葉片褪綠、產(chǎn)生褐色大塊枯斑，未發(fā)生系統(tǒng)侵染（見圖1）。莧色黎接種PVM后第2天接種葉產(chǎn)生褪綠、密集微小枯斑，未發(fā)生系統(tǒng)侵染（見圖2）。番茄接種PVM后雖無發(fā)病癥狀，但第3天即可在接種葉片中檢測出病毒，第5天在新生葉片檢測出病毒，表明病毒系統(tǒng)侵染，第9天新生葉片檢測OD405達3.313，系統(tǒng)侵染達高峰期。36號煙接種PVM后第2天接種葉片檢測出病毒，第12天新生葉片檢測出病毒，表明病毒開始系統(tǒng)侵染，第16天新生葉片檢測OD405達3.431，系統(tǒng)侵染達高峰期。發(fā)病癥狀明顯，具體表現(xiàn)為接種葉片第3天枯萎，第7天死亡；新生葉片產(chǎn)生皺縮、泡斑、葉邊緣卷曲等癥狀，植株長勢矮?。ㄒ妶D3）。

圖1 PVM侵染千日紅癥狀Fig.1Symptoms of PVM infected Gomphrena globosa L.

圖2 PVM侵染莧色黎癥狀Fig.2Symptoms of PVM infected Chenopodium amaranticolor

圖3 PVM侵染36號煙癥狀Fig.3Symptoms of PVM infected Nicotiana occidentalis"pi"

其他11種指示植物連續(xù)取樣20 d，但無論接種葉片還是新生葉片均未檢測出病毒，說明PVM不侵染這些指示植物。

2.2 PVM接種條件優(yōu)化

2.2.1 PVM最適接種時期

PVM接種出苗20、40和60 d莧色黎和番茄，DAS-ELISA檢測OD值均呈陽性，略有差異，可見PVM可侵染不同生育期番茄和莧色黎。

2.2.2 PVM最適接種葉位

PVM接種莧色黎，從頂葉至底葉DAS-ELISA檢測OD405可見，不同葉位均在第2～3天感染PVM，發(fā)病時間基本一致。接種15 d OD405顯示，第1～12葉病毒濃度略有差異，第13～15葉病毒濃度有下降趨勢（見圖4）。PVM接種番茄，從頂葉至底葉OD405可見，不同葉位均在第3天感染PVM，感病時間一致。當達到系統(tǒng)侵染高峰期時，第1～6葉病毒濃度呈上升趨勢，第7～12葉片是整個植株病毒濃度相對較高區(qū)域，第14和15葉OD405呈陰性，未檢測出病毒?？梢姡瑢τ诜押颓{色黎，PVM接種中上部葉片時效果更好。

2.2.3 PVM最適培養(yǎng)溫度

從DAS-ELISA檢測結(jié)果可看出，PVM在17～31℃溫度范圍內(nèi)均可成功接種番茄，17和20℃條件下接種后第9天開始系統(tǒng)感染，23～29℃時接種第5天開始系統(tǒng)感染，31℃時接種第7天開始系統(tǒng)感染。而低于23℃和高于29℃時接種感染較慢。由此可見，23～29℃是PVM最適培養(yǎng)溫度范圍（見圖5）。

圖4 PVM在寄主不同葉位OD405Fig.4OD405of PVM at the different leaf position of the host

圖5 PVM在不同接種溫度條件下接種番茄后OD405Fig.5OD405of PVM inoculated Lycopersicon pimpinellifolium under different inoculation temperatures

2.2.4 PVM稀釋限點

從DAS-ELISA檢測結(jié)果可看出，毒源1、2、4、8倍稀釋液接種莧色黎后第4天開始感病，而16、32、64倍稀釋液接種莧色黎均在第8天開始感病，128倍稀釋液接種莧色黎一直未感病?？梢姡琍VM稀釋限點為64倍（OD=0.201）（見圖6）。

圖6 PVM毒源不同稀釋度侵染莧色黎OD405Fig.6OD405of PVM inoculated Chenopodium amaranticolor under different dilutions

3 討論與結(jié)論

中國是世界馬鈴薯生產(chǎn)大國，總面積和總產(chǎn)量均居世界首位，然而單產(chǎn)水平卻落后于發(fā)達國家，原因與病毒病關(guān)系密切[17-20]。在世界范圍內(nèi)侵染馬鈴薯病毒有40余種[21-22]，其中PVM是主要病毒之一[23-25]。雖然PVM單獨侵染產(chǎn)量損失不大，但如果與其他病毒復(fù)合侵染會加重病毒病危害。從田檢普查結(jié)果可見，PVM檢出率雖低于PVY和PVS，但卻呈逐年上升趨勢[26-27]。因此，為提高馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)，馬鈴薯須經(jīng)脫毒后才可用于生產(chǎn)，而莖尖脫毒不徹底，種苗、種薯攜帶病毒，生產(chǎn)過程中再感染病毒等均會影響生產(chǎn)。因此，病毒檢測應(yīng)貫穿于脫毒種薯生產(chǎn)全過程。

DAS-ELISA方法是病毒檢測比較常用方法，主要應(yīng)用試劑盒作病毒檢測。其中，病毒提純是試劑盒生產(chǎn)基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，前提條件需系統(tǒng)了解該病毒生物學性狀。首先將該病毒接種不同寄主植物分離和純化，得到純病毒，將其接種到繁殖寄主上大量擴繁，再病毒提純、制備抗血清。吳凌娟等研究指示植物鑒定及分離馬鈴薯X病毒（Potato virus X，PVX）方法，為PVX抗血清制備提供技術(shù)保證[28]。徐潔僅測定PVM等8種病毒寄主范圍，簡單介紹影響接種效果環(huán)境因素[15]。范國權(quán)等系統(tǒng)研究PVM提純和抗血清制備技術(shù)，而對如何獲得大量PVM純病毒無詳細闡述[29]。目前，尚缺乏PVM生物學特性系統(tǒng)研究。

本文系統(tǒng)研究PVM寄主范圍和最適接種條件等生物學特性。15種指示植物中，PVM可侵染4種，在徐潔研究[15]基礎(chǔ)上擴展了PVM寄主范圍，明確不同寄主用途。PVM在莧色藜和千日紅接種葉片上產(chǎn)生枯斑癥狀，可作為鑒定PVM枯斑寄主，用于分離和純化PVM；PVM可系統(tǒng)侵染36號煙，癥狀明顯，作為PVM系統(tǒng)侵染鑒定寄主；PVM快速系統(tǒng)侵染番茄，番茄植株高帶毒而不表現(xiàn)任何癥狀，植株長勢與陰性對照無差異，適宜作PVM繁殖寄主。中部葉片病毒含量最高，取中部葉片提純PVM可得到較高病毒粒體濃度。PVM成功侵染不同生育期番茄和莧色黎，以接種中上部葉片效果更好。PVM最適培養(yǎng)溫度為23～29℃，低于23℃和高于29℃時接種發(fā)病較慢，接種效率低。本試驗PVM稀釋限點為64倍，此時OD405僅為陽性臨界值0.201，可成功侵染莧色黎，但PVM毒源濃度越高，接種發(fā)病越快，病毒含量越高。毒源稀釋64～128倍是否侵染莧色黎，有待進一步試驗。

綜上，本文研究PVM生物學特性，明確PVM寄主范圍、PVM最適接種時期、最適接種葉位、最適培養(yǎng)溫度和稀釋限點，可為分離、純化和擴繁PVM提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，簡化試驗過程，提高試驗效率，并為PVM遺傳多樣性研究奠定基礎(chǔ)。

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Study on the biological characteristics ofpotato virus M

/ZHANG Wei1,2,BAI

Yanju2,WEN Jingzhi1,FAN Guoquan2,GAO Yanling2,LV Dianqiu2,SHEN Yu2,QIU Cailing2, ZHANG Shu2,YUAN Hongmei3(1.School of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Institute of Virus-free Seedling Research,Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150086,China;3.Institute of Industrial Crops,Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150086,China)

In this study,the host range ofpotato virus M(PVM)was determined,and on the basis of this,PVM inoculation conditions were optimized.The results showed that PVM only infected four indicator plants among the 15 species tested,and the symptoms were different.On the inoculated leaves of Chenopodium amaranticolorandGomphrena globosaL.expressed lesion,so they could be used as the lesion host of PVM.TheNicotiana occidentalis"pi"expressed systemic symptom,on the new leaves of which expressed crinkling,bubble spot,leaf curl and dwarf,so it could be used as the identification host ofsystemic infection.Lycopersicon pimpinellifoliumcould be systemically infected.The speed was fast,but did not show symptoms,so it could be used as the breeding host of PVM.Although PVM could infect the host plants of different growth stages,the leaves at mid-upper positions got the best infection result.However, the concentration of PVM was inconsistent between the leaves of different positions,with the virus content in leaves being relatively high in the middle part of theLycopersicon pimpinellifolium,while the distribution in Chenopodium amaranticolorbeing even.The optimal culture temperature of PVM was 23-29℃.The highest dilution of 64 times(OD405=0.201)could still successfully infestChenopodium amaranticolor.These results may provide the basic data for the preparation of the virus antiserum by the expansion of pure PVM.

potato;virus;PVM;biological characters

S432.41

A

1005-9369（2017）01-0001-06

2016-11-26

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項資金資助項目（CARS-10-P14）；哈爾濱市科技創(chuàng)新人才專項資金項目（2015RQQYJ031）

張威（1981-），女，助理研究員，博士研究生，研究方向為植物病理學。E-mail:449254339@qq.com

*通訊作者：文景芝，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為植物病理學。E-mail:jzhwen2000@163.com

時間2017-1-9 15:46:08[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170109.1546.014.html

張威,白艷菊,文景芝,等.馬鈴薯M病毒生物學特性研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2017,48(1):1-6.

Zhang Wei,Bai Yanju,Wen Jingzhi,et al.Study on the biological characteristics ofpotato virus M[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(1):1-6.(in Chinese with English abstract)