石油降解菌篩選鑒定及耐受性分析

劉宇程，王姍鎰，馬麗麗，陳明燕，張紅杰，楊國(guó)通

（1.西南石油大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，成都 610500；2.中聯(lián)煤層氣有限責(zé)任公司，北京 100011；3.中海油能源發(fā)展股份有限公司工程技術(shù)分公司油田作業(yè)支持公司，天津 300000）

石油降解菌篩選鑒定及耐受性分析

劉宇程1，王姍鎰1，馬麗麗1，陳明燕1，張紅杰2，楊國(guó)通3

（1.西南石油大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，成都 610500；2.中聯(lián)煤層氣有限責(zé)任公司，北京 100011；3.中海油能源發(fā)展股份有限公司工程技術(shù)分公司油田作業(yè)支持公司，天津 300000）

試驗(yàn)從污泥中篩選3株高效石油烴降解菌m1，m2，m3，對(duì)原油最高降解效率達(dá)73%，16S rDNA鑒定結(jié)果表明，m1為Citrobacter檸檬酸細(xì)菌屬，m2為Tatumella塔特姆菌屬，m3為Kluyvera克呂沃爾氏菌屬。分析3株石油降解菌耐受性，結(jié)果表明，m2耐強(qiáng)堿性；m1、m2耐較高濃度鹽；m2在高濃度Cr中生長(zhǎng)；m3在高濃度Hg、Cd、Pb中較好生長(zhǎng)。

石油降解菌；篩選；鑒定；耐受性分析

油氣泄露等廢棄物無害化處理產(chǎn)生大量污泥[1-2]，污泥中含苯系物、酚類、蒽、芘等惡臭有毒物質(zhì)[3]，對(duì)環(huán)境危害明顯[4]，如不及時(shí)處理，有害物質(zhì)滲入土壤，破壞土壤結(jié)構(gòu)、通透性及土壤微生物群種類和分布[1,3]。目前此類污泥處理主要有物理、化學(xué)和生物處理法[5]。物理處理法僅降低污泥濃度，無法徹底去除污染物[6]?；瘜W(xué)處理法有溶液淋洗萃取法[7-8]、電化學(xué)法[9]和化學(xué)氧化法等[10-11]，污泥處理效率高，但會(huì)產(chǎn)生二次污染物，處理成本較高[7]。生物處理技術(shù)發(fā)展較晚[12-13]，但成本低、無二次污染、處理效果好，是污泥處理首選[14-15]。

生物處理技術(shù)主要利用微生物處理，石油降解菌利用污染物中石油類物質(zhì)作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生長(zhǎng)，達(dá)到降解石油類物質(zhì)作用。對(duì)石油類物質(zhì)有分解能力菌種包括細(xì)菌、放線菌、霉菌、酵母菌等[16]。石油類污染物具有疏水特性，不利于細(xì)菌對(duì)污染物分解。革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外層含有豐富多糖、類脂和脂多糖等物質(zhì)，細(xì)胞壁周圍有兩親分子層，利于油類物質(zhì)吸附和降解。革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁主要成分是肽聚糖，無脂類物質(zhì)，不利于油類物質(zhì)吸附，無法使油類物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)被降解。石油類污染物降解細(xì)菌多屬革蘭氏陰性菌，主要包括產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）[17]，黃桿菌屬（Flavobacterium）[18]，芽孢桿菌屬（Bacillus）[19]等。

彭鴿威等篩選一株高效原油降解菌X3，比較不同濃度下原油對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)和降解率影響，研究pH和鹽濃度對(duì)該菌株降解原油能力影響，對(duì)原油有72.6%降解率[20]。陳梅梅等篩選一株耐鹽石油降解菌，高鹽度條件下對(duì)石油具有較好降解效果，達(dá)56.12%[21]。試驗(yàn)表明，復(fù)合菌種比單一菌種降解石油類物質(zhì)效率更高。Khanna等從受原油污染土壤中篩選一株石油降解菌YSL28，對(duì)原油降解率為46.9%，降解效率較低[22]。Verma等篩選一株石油降解菌Bacillus sp.SV9，對(duì)含油污泥降解率為59%，降解率較低，不利實(shí)際應(yīng)用[23]。

本文針對(duì)石油降解率低、菌種單一等問題，篩選污水處理廠污泥，并觀察篩選的高效石油降解菌形態(tài)，通過生理生化鑒定和16S rDNA分離鑒定，研究3株石油降解菌鹽含量、pH、Hg、Cd、Pb、Cr、As耐受能力，探究篩選菌種處理污染物適應(yīng)能力，進(jìn)一步選育修復(fù)污染物優(yōu)勢(shì)菌株。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

污泥取自于陜西省榆林市神木縣大牛地氣田污水處理廠。石油污染土壤和老化油均取自吐哈油田。城鎮(zhèn)生活污水廠污泥取自四川省成都市新都區(qū)金海污水處理廠活性污泥。土壤取自四川省新都市西南石油大學(xué)校內(nèi)。

1.2 試驗(yàn)主要藥品和培養(yǎng)基

主要藥品：牛肉膏，蛋白胨，氯化鈉，Tris，DNA小量試劑盒，瓊脂糖，50×TAE緩沖液等。

主要培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：用于篩選后菌種富集和培養(yǎng)，主要成分牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，用于保存菌種和稀釋涂布等制備固體培養(yǎng)基時(shí)加入15～20 g瓊脂；篩選（基礎(chǔ)）培養(yǎng)基：NH4NO34.0g，K2HPO4·3H2O 5.2 g，KH2PO46.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，微量元素溶液1 mL（CaCl2755 mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 1 000 mg，EDTA 1 400 mg），適量原油，去離子水1 000 mL。所有培養(yǎng)基均于121℃下滅菌20 min。

1.3 石油降解菌篩選和鑒定

1.3.1 石油降解菌馴化篩選

稱取10 g污泥、石油污染土壤、老化油、活性污泥、土壤分別加到裝有100 mL無菌水250 mL錐形瓶中，于28℃、160 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。制成污泥懸濁液后靜置。配置500、1 000、1 500、2 000 mg·L-1石油濃度梯度，依次對(duì)菌株馴化。

移取10 mL土壤懸濁液接種于石油梯度為500 mg·L-1100 mL富集培養(yǎng)基中，28℃、160 r·min-1恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。然后取10 mL加入石油濃度為1 000 mg·L-1培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接3次。得到在高濃度石油污染環(huán)境中生長(zhǎng)菌株，選取具有良好降解性能菌種[24]。將所得菌種活化后接至以石油為唯一碳源無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速180 r·min-1，溫度30℃，培養(yǎng)7 d后，觀察三角瓶中原油降解情況，選出降解率較高菌株作復(fù)篩試驗(yàn)。再將初篩中降解率較高菌種活化后接至以石油為唯一碳源無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速180 r·min-1，溫度30℃，培養(yǎng)7 d后，測(cè)定菌株原油降解率。

1.3.2 石油降解菌鑒定

鑒定3株石油降解菌形態(tài)及生理生化特性。生理生化鑒定包括革蘭氏染色、M-R試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、明膠試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)。

本文采用16S rDNA鑒定細(xì)菌種屬：使用Axy-Prep細(xì)菌基因組DNA小量試劑盒（DNeasy，Qiagen，德國(guó)）提取菌株DNA，具體步驟詳見說明書，采用引物27F（5'AGAGTTTGATC CTGGCTCAG 3'）和1492R（5'GGTTACCTTGTTACG ACTTT 3'）擴(kuò)增DNA，PCR反應(yīng)體系為50 μL，具體試驗(yàn)步驟和程序采用：DNA模板1 μL，Colorless Master Mix 25 μL（Promega公司，美國(guó)），Primer 27 F和Primer 1492 R引物各1 μL（10 μmol·L-1）和22 μL無核酸酶純水[25]。PCR擴(kuò)增條件如下：94℃下預(yù)變性10 min，進(jìn)入循環(huán)，94℃變性1 min 10個(gè)循環(huán)，65～55℃變性1 min（每個(gè)循環(huán)降低1℃），53℃退火90 s，72℃延伸2 min；94℃變性1 min 30個(gè)循環(huán)；55℃退火1 min，72oC延伸2 min，最后4℃保存。PCR產(chǎn)物提交成都飛騰博川（瑞信）生物公司DNA測(cè)序。NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih. gov）對(duì)比測(cè)得基因序列，找出與該序列相似同源序列，使用MEGA 6.0對(duì)基因序列構(gòu)建和分析系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 菌種耐受性分析

1.4.1 菌株對(duì)鹽含量耐受性試驗(yàn)

將三株菌株分別制成菌懸液，取100 μL菌懸液分別接種于50 mL含NaCl液體培養(yǎng)基，NaCl含量分別為0、2%、4%、5%、6%、7%、8%、10%，于30℃、140 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)3 d，可見光分光光度計(jì)于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定細(xì)菌懸浮液光密度（OD600），確定三株菌株耐鹽性。

1.4.2 菌株對(duì)pH耐受性試驗(yàn)

將三株菌株分別制成菌懸液，取100 μL菌懸液分別接種于50 mL不同pH液體培養(yǎng)基中；由于在工業(yè)生產(chǎn)中，被污染土壤多為堿性土壤，通過添加1 mol·L-1NaOH溶液使液體培養(yǎng)基pH分別為8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5，于30℃、140 r·min-1下恒溫振蕩培養(yǎng)3 d，可見光分光光度計(jì)于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定細(xì)菌懸浮液OD值，確定三株菌株對(duì)pH耐受性。

1.4.3 菌株對(duì)Hg、Cd耐受性試驗(yàn)

將三株菌株分別制成菌懸液，取100 μL菌懸液分別接種于50 mL含Hg、Cd液體培養(yǎng)基中，Hg、Cd含量分別為0～5 mg·L-1，于30℃、140 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)3 d，可見光分光光度計(jì)于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定細(xì)菌懸浮液光密度值（OD600），確定三株菌株對(duì)Hg、Cd耐受性。

1.4.4 菌株對(duì)Pb、Cr耐受性試驗(yàn)

將三株菌株分別制成菌懸液，取100 μL菌懸液分別接種于50 mL含Pb、Cr液體培養(yǎng)基中，Pb、Cr含量分別為0、20、40、60、80、100 mg·L-1，于30℃、140 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)3 d，可見光分光光度計(jì)于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定細(xì)菌懸浮液光密度值（OD600），確定三株菌株對(duì)Pb、Cr耐受性。

1.4.5 菌株對(duì)As耐受性試驗(yàn)

將三株菌株分別制成菌懸液，取100 μL菌懸液分別接種于50 mL含As液體培養(yǎng)基中，As含量分別為0、5、10、20、25、30 mg·L-1，于30℃、140 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)3 d，可見光分光光度計(jì)于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定細(xì)菌懸浮液光密度值（OD600），確定三株菌株對(duì)As耐受性。

2 結(jié)果與分析

2.1 石油降解菌篩選

挑選不同來源（污泥、鉆井泥漿、老化油、土壤）馴化后在石油無機(jī)鹽平板上長(zhǎng)勢(shì)較好32株菌作初篩（見圖1）。菌株編號(hào)1～10為大牛地污水廠污泥，11～12為油田鉆井泥漿，13～14為石油污染土壤，15為老化油，16為土壤。通過原油降解試驗(yàn)，篩選出16株能將石油作為唯一營(yíng)養(yǎng)源、生長(zhǎng)迅速，原油降解明顯菌株進(jìn)一步復(fù)篩。

按正常工作條件選擇電氣設(shè)備時(shí)，需要考慮電氣設(shè)備的安裝環(huán)境條件以及相關(guān)電氣設(shè)備要求。包括電氣裝置所處位置、環(huán)境溫度、防火防爆等要求，此外，還包括電氣裝置對(duì)電流、電壓等方面的要求，最后還需對(duì)其進(jìn)行短路校驗(yàn)。

圖1 菌株初篩平板Fig.1Strain screening plate

將初篩菌株分別接入原油無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，均能以不同程度在以原油為唯一碳源環(huán)境中生長(zhǎng)，培養(yǎng)7 d后，測(cè)定菌株編號(hào)1～16原油降解率分別為73%、66%、60%、6%、4%、60%、66%、29%、11%、71%、39%、41%、46%、48%、50%和54%。復(fù)篩試驗(yàn)所用16株石油降解菌中，大牛地污泥選10株，鉆井泥漿、石油污染土壤和老化油中各選2株，由于城鎮(zhèn)污水廠活性污泥在初篩試驗(yàn)中效果相對(duì)較差，復(fù)篩時(shí)未選取該樣品。

經(jīng)復(fù)篩試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)污泥篩分細(xì)菌1#和細(xì)菌10#對(duì)石油烴降解效果良好，7 d降解率達(dá)70%以上，另有2株降解率達(dá)66%，從老化油來源樣品中篩分細(xì)菌15#和16#，原油降解率相對(duì)較好，但仍小于大牛地污泥篩分菌種，綜合考慮降解率和菌種環(huán)境適應(yīng)性，挑選3株試驗(yàn)污泥中篩分出高效石油降解菌（1#、2#和10#）作下一步試驗(yàn)。

2.2 石油降解菌鑒定

2.2.1 石油降解菌初步鑒定

對(duì)三株石油降解菌形態(tài)及生理生化鑒定結(jié)果見表1。

2.2.2 石油降解菌16S rDNA鑒定

對(duì)三株石油烴降解菌作16S rRNA基因序列分析結(jié)果得到各菌株序列進(jìn)化樹，菌m1(1#)屬Klebsiella檸檬酸細(xì)菌屬，菌m2（2#）屬Tatumella塔特姆菌屬，菌m3(10#)屬Kluyvera克呂沃爾式菌屬。如圖2所示。

表1 石油降解菌形態(tài)和生理生化鑒定Table 1Morphology and physiogicaland biochemical characters of petroleum degrading bacteria

圖2 三種菌進(jìn)化樹構(gòu)建Fig.2Three kinds of bacteria to construct phylogenetic tree

2.3.1 菌株對(duì)鹽類環(huán)境耐受能力分析

微生物生長(zhǎng)環(huán)境中鹽類物質(zhì)過高改變微生物細(xì)胞滲透壓，影響微生物吸收水分及排放廢物，微生物失水過多而死亡[26]。鉆井廢棄物中鹽類物質(zhì)均過高，限制微生物生長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株m1、m2和m3對(duì)鹽類耐受濃度分別為8%、8%和7%。

菌株對(duì)不同鹽濃度耐受能力如圖3所示，三株菌株均可在高濃度鹽含量中生長(zhǎng)；在鹽含量濃度低于2%時(shí)，菌株生長(zhǎng)數(shù)量隨鹽濃度升高而增加，是因NaCl提供菌株生長(zhǎng)所需元素，促進(jìn)菌株生長(zhǎng)；濃度超2%時(shí)，菌株生長(zhǎng)數(shù)量隨鹽濃度增加而減少；原因是高濃度鹽含量造成菌株滲透壓失衡脫水，抑制菌株生長(zhǎng)繁殖。m3菌株最高耐受濃度達(dá)7%，m1和m2菌株最高耐受濃度達(dá)8%。由試驗(yàn)結(jié)果可見，這三種菌株對(duì)鹽類環(huán)境均具有耐受能力，其中菌株m1、m2耐鹽性能最高，耐受鹽濃度最高達(dá)8%。微生物僅保證自身需要鹽類物質(zhì)時(shí)才主動(dòng)從外界吸收鹽類物質(zhì)，當(dāng)環(huán)境中耐鹽菌大量生長(zhǎng)時(shí)才能改變油氣田廢棄物鹽性環(huán)境。復(fù)篩菌株對(duì)鹽類物質(zhì)高耐受性決定其可在油氣田廢棄物中生長(zhǎng)。本文菌株鹽耐受性達(dá)8%，可在油氣田廢棄物環(huán)境生長(zhǎng)。

圖3 菌株在不同鹽含量培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況Fig.3Strains in different salt medium for growth

2.3.2 菌株對(duì)堿性環(huán)境耐受能力試驗(yàn)

適宜酸堿度是微生物生長(zhǎng)繁殖必要條件之一。雖然大部分微生物對(duì)環(huán)境適應(yīng)性極強(qiáng)，但需較長(zhǎng)時(shí)間馴化。油氣田開發(fā)鉆井過程會(huì)添加堿性物質(zhì)控制井內(nèi)酸堿度，油氣田廢棄物堿性很強(qiáng)，一般情況下呈強(qiáng)堿性[27]。強(qiáng)堿性環(huán)境極大程度阻礙微生物生長(zhǎng)。探究污染物降解菌株對(duì)堿性環(huán)境耐受能力尤為必要。選用1 mol·L-1NaOH作為堿性物質(zhì)加入液體培養(yǎng)基，試驗(yàn)結(jié)果為菌株m1、m2和m3最高耐受pH分別為11、11.5、11。

菌株在不同堿性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況如圖4所示，m1和m3隨pH增加生長(zhǎng)數(shù)量下降；在pH＜9.5時(shí)，pH對(duì)m1和m3菌株抑制作用稍小，在pH為9.5時(shí)依然保持旺盛生長(zhǎng)能力，最高耐受pH達(dá)11。高堿性環(huán)境對(duì)生物所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、吸收利用有強(qiáng)烈抑制作用，直接阻礙生物生長(zhǎng)繁殖；不同種屬菌種對(duì)pH耐受程度不同，m2在pH＜10時(shí)，菌株生長(zhǎng)數(shù)量隨pH增加而增加，pH為10是該菌株最適宜生長(zhǎng)pH，當(dāng)pH＞10時(shí)；菌株生長(zhǎng)數(shù)量急劇下降，最高耐受pH達(dá)11.5。由試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知三種菌株對(duì)堿性環(huán)境耐受力均較高，其中m2菌株耐受力明顯高于其他兩種，菌株最高耐受堿性環(huán)境值高達(dá)11.5。這三株菌株可在油氣田廢棄物堿性環(huán)境生長(zhǎng)，隨處理過程各種有害物質(zhì)減少，一些產(chǎn)酸菌生長(zhǎng)并分泌酸性物質(zhì)，將油氣田廢棄物環(huán)境調(diào)整到適宜各種微生物生存的條件。

圖4 菌株在不同堿性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況Fig.4Strains in different alkalinity medium for growth

2.3.3 菌株對(duì)重金屬離子抗性試驗(yàn)

油氣田廢棄物中存在大量重金屬離子，例如鉻、鉛、鎘等，重金屬離子多以有毒性化合態(tài)存在，危害微生物生長(zhǎng)和繁殖。石油類降解菌對(duì)重金屬離子耐受能力是保證油氣田污染物徹底處理關(guān)鍵。本試驗(yàn)選用5種主要環(huán)境污染重金屬離子，用不同濃度重金屬離子培養(yǎng)液檢測(cè)三種石油降解菌對(duì)其耐受能力。試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 菌株對(duì)重金屬耐受能力試驗(yàn)結(jié)果Table 2Experimental results of heavy metal tolerance strains(mg·L-1)

Hg是一種生物毒性極強(qiáng)重金屬，進(jìn)入生物體后很難排出。Hg對(duì)三株菌株生長(zhǎng)影響情況見圖5。

圖5 菌株在不同質(zhì)量濃度Hg培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況Fig.5Strains in different Hg medium for growth

由圖5可知，m1、m2和m3生長(zhǎng)數(shù)量隨Hg濃度增加而呈下降趨勢(shì)。Hg濃度達(dá)5 mg·L-1時(shí)，三株菌株均具有較強(qiáng)生長(zhǎng)能力，m3菌株在高濃度Hg環(huán)境中生存能力較強(qiáng)。劉紅娟等發(fā)現(xiàn)，菌株細(xì)胞壁-OH、-NH4化學(xué)官能團(tuán)與重金屬發(fā)生締合，菌m3菌體及分泌物可能存在著如羧基、羥基等大量陰離子基團(tuán)，與Hg離子相互作用，選擇性結(jié)合環(huán)境中Hg，所以m3在高濃度時(shí)也表現(xiàn)出較高生長(zhǎng)數(shù)量[28]。

鎘在人體內(nèi)生物半衰期長(zhǎng)達(dá)10～30年，為已知最易在體內(nèi)蓄積有毒物質(zhì)。Cd對(duì)3株菌株生長(zhǎng)影響情況如圖6所示。

圖6 菌株在不同質(zhì)量濃度Cd培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況Fig.6Strains in different Cd medium for growth

由圖6可知，菌株m1和m2菌株在Cd質(zhì)量濃度＜2 mg·L-1時(shí)，Cd能促進(jìn)菌株m1和m2生長(zhǎng)，菌株生長(zhǎng)數(shù)量呈上升趨勢(shì)。當(dāng)Cd質(zhì)量濃度＞2 mg·L-1時(shí)，菌株生長(zhǎng)數(shù)量隨Cd質(zhì)量濃度增加而下降，菌株生長(zhǎng)受抑制。m3菌株生長(zhǎng)數(shù)量隨Cd質(zhì)量濃度增大而下降。但這三株菌株在5 mg·L-1Cd溶液中保持較高生長(zhǎng)數(shù)量，與張玉秀等分離篩選到耐Cd濃度高達(dá)8.89 mol·L-1細(xì)菌ZGKD2結(jié)果相一致[29]，這可能是三株菌株通過胞壁上有機(jī)基團(tuán)將Cd直接結(jié)合在細(xì)胞表面發(fā)生吸附，同時(shí)通過細(xì)胞代謝向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移運(yùn)送Cd，在高濃度下仍有較高生長(zhǎng)數(shù)量，具有較大耐Cd開發(fā)潛力。

Pb、Cr污染對(duì)動(dòng)植物和人體均產(chǎn)生極大生態(tài)和健康風(fēng)險(xiǎn)，某些Cr（VI）化合物在體內(nèi)具有致癌作用[30]，濃度稍高即可抑制微生物生長(zhǎng)代謝。Pb、Cr對(duì)菌株生長(zhǎng)情況影響見圖7、8。

圖7 菌株在不同質(zhì)量濃度Pb培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況Fig.7Strains in different Pb medium for growth

圖8 菌株在不同質(zhì)量濃度Cr培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況Fig.8Strains in different Cr medium for growth

三株菌株生長(zhǎng)受Pb、Cr影響趨勢(shì)一致，隨Pb、Cr質(zhì)量濃度增加菌株生長(zhǎng)數(shù)量下降。菌株m1最高耐Pb質(zhì)量濃度＜20 mg·L-1，菌株m2和m3最高耐受濃度＞40 mg·L-1。張漢波等用“吸附+細(xì)胞膜傳輸”模型解釋兩種細(xì)菌生長(zhǎng)過程中對(duì)Zn離子吸附作用增加但對(duì)Cd吸附大幅度下降現(xiàn)象，認(rèn)為Pb毒性較大，菌株不會(huì)主動(dòng)運(yùn)輸，溶液中重金屬減少主要是在細(xì)胞表面累積，與本文Pb對(duì)三株菌生長(zhǎng)影響一致[31]。m1、m2和m3菌株最高耐Cr質(zhì)量濃度為80、60和60 mg·L-1。土壤重金屬Cr污染微生物修復(fù)機(jī)理包括微生物還原作用、生物吸附；菌株可通過改變重金屬化合價(jià)改變重金屬穩(wěn)定性及絡(luò)合能力，降低其生物可利用性和毒性[32]。

As是菌體生長(zhǎng)非必需元素，較高濃度As對(duì)菌體生長(zhǎng)有抑制作用（見圖9）。由圖9可知，當(dāng)As濃度＜4 mg·L-1時(shí)，對(duì)菌株m2和m3無明顯抑制作用；在As濃度＜2 mg·L-1時(shí)，m2生長(zhǎng)數(shù)量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，說明菌株m2在低濃度下可利用As作營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生長(zhǎng)，這可能與菌株m2細(xì)胞壁化學(xué)基團(tuán)有關(guān)[33]；當(dāng)As濃度達(dá)5 mg·L-1時(shí)，菌株m2和m3仍可生長(zhǎng)。當(dāng)As濃度＜2 mg·L-1時(shí)，菌株m1生長(zhǎng)情況未受明顯影響，當(dāng)As濃度＞2 mg·L-1時(shí)，菌株生長(zhǎng)開始受嚴(yán)重抑制，在濃度4 mg·L-1時(shí)，菌株m1生長(zhǎng)數(shù)量極少。

圖9 菌株在不同質(zhì)量濃度As培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況Fig.9Strains in different As medium for growth

微生物對(duì)重金屬解毒作用并非將其分解，而是通過轉(zhuǎn)化有毒離子化合價(jià)，將重金屬離子毒性減低，如有些微生物可將六價(jià)鉻離子轉(zhuǎn)變?yōu)榈投救齼r(jià)鉻離子；或?qū)⒅亟饘匐x子吸附到菌體上在胞內(nèi)累積從而降低周圍環(huán)境中重金屬離子濃度。研究表明微生物對(duì)重金屬抗性可能源自微生物可通過陽離子外流系統(tǒng)使陽性重金屬離子排出體外，或自身合成一些類金屬硫蛋白和螯合重金屬肽類，降低重金屬對(duì)自身傷害。三種菌株對(duì)重金屬離子抗性效果良好，可在不同濃度重金屬離子中生長(zhǎng)，對(duì)后期污泥無害化處理試驗(yàn)具有指導(dǎo)意義。

3 討論

本文針對(duì)傳統(tǒng)生物處理技術(shù)菌種單一和處理效率較低問題，篩選三株石油降解菌，原油降解效率均達(dá)65%，降解效率提高。與國(guó)內(nèi)外多數(shù)研究采用單一菌種相比，利用復(fù)合菌種降解原油，菌株在大部分原油污染土壤中可生存，避免菌株受外界極端環(huán)境干擾而降低處理效果。結(jié)果表明，三株Klebsiella克雷伯氏桿菌屬、Tatumella塔特姆菌屬、Kluyvera克呂沃爾氏菌屬?gòu)?fù)合菌種降解石油類物質(zhì)效果顯著，與Sathishkumar等篩選的四株復(fù)合石油降解菌Bacillus sp.IOS1-7,Corynebacterium sp.BPS2-6,Pseudomonas sp.HPS2-5和Pseudomonas sp.BPS1-8結(jié)果一致[34]。

4 結(jié)論

a.從含油污泥中篩選出三株石油烴降解菌并經(jīng)16S rDNA測(cè)序，序列分析鑒定表明，菌株m1、m2和m3分別是Klebsiella克雷伯氏桿菌屬、Tatumella塔特姆菌屬、Kluyvera克呂沃爾氏菌屬。

b.篩選高效石油降解菌，原油降解率最高可達(dá)73%。

c.三株石油降解菌耐受性試驗(yàn)表明，m2耐強(qiáng)堿性；m1，m2耐較高濃度鹽；m2可在高濃度Cr中生長(zhǎng)；m3可在高濃度Hg，Cd，Pb中生長(zhǎng)。

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Screening and identification of oil degrading bacteria and tolerance

analysis

LIUYucheng1,WANG Shanyi1,MALili1,CHEN Mingyan1,ZHANG Hongjie2,YANG Guotong3

(1.Schoolof Chemistry and Chemical Engineering,Southwest Petroleum University,Chengdu 610500,China;2.China United Coalbed Methane Corporation,Ltd.,Beijing 100011,China;3. CNOOC Energy Development Limited by Share Ltd.Engineering and Technology Branch Oil Field Operations Support Company,Tianjin 300000,China)

Three strains of efficient hydrocarbon degrading bacteria m1,m2,m3,were screened from sludge,the highest degradation efficiency of crude oil can reach 73%,and through the 16S rDNA identification,the identification results showed m1was similar to theCitrobacter,m2was similar to the Tatumella,m3was similar to theKluyvera.Then tolerance analysis of the three strains was followed and the results showed that m2could resist strong alkaline,m1,m2were resistant to high concentration of salt,m2could grow in high concentration of Cr,and m3grew well in high concentration of Hg,Cd,Pb.

petroleum degrading bacteria;screening;identification;tolerance analysis

X172

A

1005-9369（2017）01-0049-09

2016-10-31

四川省教育廳科研項(xiàng)目（16ZA0074）

劉宇程（1977-），男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橛蜌馓镂廴局卫?。E-mail:449669537@qq.com

時(shí)間2017-1-9 15:46:04[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170109.1546.006.html

劉宇程,王姍鎰,馬麗麗,等.石油降解菌篩選鑒定及耐受性分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,48(1):49-57.

Liu Yucheng,Wang Shanyi,Ma Lili,et al.Screening and identification of oil degrading bacteria and tolerance analysis[J]. Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(1):49-57.(in Chinese with English abstract)