10種殺菌劑對中華蜜蜂的急性毒性測定及風險評估

王雅珺，高景林，韓文素，劉俊峰，王玉潔，符石成，趙冬香

(1.海南大學環(huán)境與植物保護學院，?？?570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所，?？?571101； 3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院蜂業(yè)技術(shù)研究中心，?？?571101)

10種殺菌劑對中華蜜蜂的急性毒性測定及風險評估

王雅珺1,2,3，高景林2,3，韓文素2,3，劉俊峰2,3，王玉潔2,3，符石成1，趙冬香2,3*

(1.海南大學環(huán)境與植物保護學院，?？?570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所，?？?571101； 3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院蜂業(yè)技術(shù)研究中心，海口 571101)

明確80%代森錳鋅可濕性粉劑、50%啶酰菌胺水分散型粒劑、50%腐霉利可濕性粉劑、50%烯酰嗎啉可濕性粉劑、100 g/L氰霜唑懸浮劑、20%葉枯唑可濕性粉劑、2%春雷毒素水劑、12.50%腈菌唑乳油、25%丙環(huán)唑乳油和15%咪鮮胺微乳劑等10種殺菌劑對中華蜜蜂Apisceranacerana工蜂的急性毒性，并評價其對中華蜜蜂工蜂的風險性。在室內(nèi)采用攝入法和點滴法測定10種殺菌劑對中華蜜蜂工蜂的急性經(jīng)口和接觸毒性。結(jié)果表明代森錳鋅，啶酰菌胺，腐霉利等7種殺菌劑對中華蜜蜂的急性毒性均為低毒；腈菌唑和丙環(huán)唑?qū)χ腥A蜜蜂的急性經(jīng)口毒性和急性接觸毒性均為中毒，咪鮮胺對中華蜜蜂的急性經(jīng)口毒性為高毒，急性接觸毒性為中毒；這3種殺菌劑且均屬于中等風險性。建議禁止咪鮮胺在蜜源作物開花授粉期施用，慎重選擇中等毒性殺菌劑腈菌唑和丙環(huán)唑，盡量選擇對蜜蜂低毒的殺菌劑，以保護中華蜜蜂的安全。

殺菌劑；中華蜜蜂；毒性測定；風險評估

中華蜜蜂Apisceranacerana是中國特有蜂種，是我國傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)授粉的主要昆蟲，對促進植物基因多樣性和維持生態(tài)平衡具有重要的生態(tài)、社會和經(jīng)濟意義(鄭火青和胡福良，2009)。近十年來，大量證據(jù)表明，人工飼養(yǎng)蜜蜂及野生傳粉昆蟲數(shù)量大幅減少，但減少的原因仍有爭議(Goulsonetal.，2015)。影響蜜蜂生存的因素可能有許多種，包括氣候變化、遺傳、由于種植模式改變而引起的營養(yǎng)變化、寄生蟲和病毒疾病等(Fairbrotheretal.，2014)。一些研究結(jié)果表明，大量使用殺蟲劑可能增加蜜蜂的損失率(Cutleretal.，2014；Al Naggaretal.，2015a，2015b)。而Goulson等(2015)認為蜜蜂大量減少的原因是由于殺蟲劑、殺菌劑以及寄生蟲與生境喪失之間復雜的交互作用所致。蜜蜂群體數(shù)量銳減，必定會引發(fā)農(nóng)作物授粉危機(Stokstad，2013；吳艷艷等，2013)這已引起社會各界的廣泛關(guān)注。

除殺蟲劑外，殺菌劑也是蜜蜂和其他傳粉昆蟲最常接觸的一類化合物，因為殺菌劑常被噴在開花作物上，而這類作物對采集蜂常有極高吸引力(Legardetal.，2001)。Mullin等(2010)在蜂房和花粉等中發(fā)現(xiàn)高殘留的殺菌劑如百菌清和丙環(huán)唑，雖然通常認為這些殺菌劑對蜜蜂沒有劇毒，但蜜蜂接觸的環(huán)境中會有不確定農(nóng)藥混合物的毒性(Krupkeetal.，2012), 當新煙堿類殺蟲劑與某些殺菌劑或其他農(nóng)藥結(jié)合后，會有協(xié)同增效作用，殺菌劑氟菌唑及丙環(huán)唑使啶蟲脒對意大利蜜蜂的毒性分別增加244倍和105倍、使噻蟲啉對意蜂毒性增加1141倍和559倍(Iwasaetal.，2014)。此外，最近一項研究發(fā)現(xiàn)，殘留在蜂箱中的殺菌劑與蜂群病毒之間具有顯著相關(guān)性(Samsonetal.，2014)。

蜜蜂授粉是促進作物增產(chǎn)提質(zhì)的重要措施。而人們往往為防治作物害蟲而大量使用農(nóng)藥，由于蜜蜂對農(nóng)藥十分敏感，農(nóng)藥使用不當會影響蜜蜂授粉，甚至造成蜜蜂中毒，影響作物授粉工作的順利進行，嚴重破壞農(nóng)田生態(tài)平衡(安建東和陳文鋒，2011)。據(jù)趙帥等(2011)研究表明，300種農(nóng)藥中86%以上的殺蟲劑對蜜蜂具有中等以上毒性，而多數(shù)殺菌劑對蜜蜂相對安全，屬于低毒，少數(shù)為劇毒。業(yè)內(nèi)一致的看法認為作物花期一般要嚴禁使用殺蟲劑，而對殺菌劑的使用則沒有太多的關(guān)注，多數(shù)人認為殺菌劑對蜜蜂沒有影響。近年來，在我們開展的設施作物蜜蜂授粉試驗及技術(shù)推廣服務期間，常發(fā)現(xiàn)為作物授粉的蜜蜂有不歸巢甚至死亡現(xiàn)象，故開展了農(nóng)藥尤其是農(nóng)作物花期使用的各種殺菌劑對蜜蜂毒性影響的研究。本文以設施瓜類作物常用的幾種殺菌劑為研究對象，研究這些殺菌劑對中華蜜蜂的毒性影響，明確其對中華蜜蜂的急性經(jīng)口和接觸毒性，并進行了殺菌劑對中華蜜蜂的毒性風險評估。開展農(nóng)藥對蜜蜂毒性影響的研究，可以更好的指導授粉生產(chǎn)實踐，也為進一步協(xié)調(diào)蜜蜂授粉與綠色防控技術(shù)體系的應用，更好地保護蜜蜂為農(nóng)作物授粉安全提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試生物

試驗蜂群是由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所試驗蜂場(N19°32′，E109°32′)提供的中華蜜蜂成年工蜂。供試蜜蜂在試驗當天清晨收集，要求為健康、大小一致的個體。用于急性經(jīng)口毒性試驗的蜜蜂在試驗前饑餓2 h。

1.1.2 供試物

試驗用藥：12.5%腈菌唑乳油(沈陽科創(chuàng)化學品有限公司)；25%丙環(huán)唑乳油(海南博士威農(nóng)用化學有限公司)；15%咪鮮胺微乳劑(海南博士威農(nóng)用化學有限公司)；80%代森錳鋅可濕性粉劑(美國陶氏益農(nóng)公司)；50%啶酰菌胺水分散型粒劑(德國巴斯夫有限公司)；50%腐霉利可濕性粉劑(住友化學有限公司)；50%烯酰嗎啉可濕性粉劑(德國巴斯夫有限公司)；100 g/L氰霜唑懸浮劑(日本石原產(chǎn)業(yè)株式會社)；20%葉枯唑可濕性粉劑(江西禾益化工有限公司)；2%春雷毒素水劑(日本北興化學工業(yè)株式會社)。

試劑：75%乙醇、丙酮(廣州化學試劑廠，化學純)，蔗糖(海南椰威糖業(yè)有限公司)，超純水(MING-CHE 24UV)。

1.1.3 儀器設備

試驗蜂籠(13 cm×6 cm×10 cm 的長方體鋼盒，正面為玻璃板，頂部有飼喂口，底部有通風孔，每次使用前經(jīng)過75%乙醇消毒)，臺秤(廣州香山橫榮集團股份有限公司)，電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，人工氣候室(面積3.8 m2)，農(nóng)藥環(huán)境檢測儀(浙江托普儀器有限公司)，微量移液槍(Eppendorf，Genex Beta)及配套吸頭，冰箱(青島海爾股份有限公司，BCD-215KA DZ)，容量瓶、量筒、燒杯(BOMEX)，玻璃棒，定性濾紙(杭州沃華濾紙有限公司，中速定性濾紙，Φ-11 cm)，飼喂器(15 mL離心管，底部設3個直徑1 cm的飼喂孔)，醫(yī)用脫脂棉(曹縣華魯衛(wèi)生材料有限公司)等。

1.1.4 試驗條件

試驗在溫度25℃±2℃、相對濕度50%-70%、黑暗條件下進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 急性經(jīng)口毒性

以下試驗操作均參照《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》第10部分：農(nóng)藥對蜜蜂急性毒性試驗(SAC，2015)。通過預實驗得出中華蜜蜂工蜂最高存活劑量與最低全致死劑量，得出劑量范圍按一定比例間距(級差在2.2以內(nèi))設置5個處理組及1個空白對照組(若使用有機溶劑助溶的需設溶劑對照組)。每個處理10頭蜜蜂，各組均重復3次。將工蜂低溫麻醉后放入試驗籠中，然后在飼喂器中加入100-200 μL含有不同濃度供試物的50%(質(zhì)量濃度)蔗糖水溶液，一旦藥液消耗完(通常需要3-4 h，最多延長至6 h)，將飼喂器取出，換用不含供試物的蔗糖水進行飼喂(不限量)，并對每組藥液的消耗量進行測定(即測定該處理的食物殘存的重量)。觀察記錄處理48 h后的中毒癥狀和死亡數(shù)。

1.2.2 急性接觸毒性

通過預實驗得出中華蜜蜂工蜂最高存活劑量與最低全致死劑量，得出劑量范圍按一定比例間距(級差在2.2以內(nèi))設置5個處理組及1個空白對照組(若使用有機溶劑助溶則需設溶劑對照組)。每個處理10頭蜜蜂，各組均重復3次。供試物用丙酮溶劑溶解，配制成不同濃度的藥液。對準蜜蜂中胸背板處，用移液槍分別點滴各濃度供試藥液1.0 μL，待蜂身晾干后轉(zhuǎn)入試驗籠，用50%(質(zhì)量濃度)蔗糖水飼喂。觀察記錄處理48 h后中毒癥狀和死亡數(shù)。

試驗開始后觀察蜜蜂的行為活動情況，并記錄48 h后蜜蜂死亡情況，描述死亡癥狀及其他異常行為，描述試驗過程中與對照組相比不同的癥狀，如蜜蜂的身體蜷縮、雙翅張開等。當蜜蜂身體完全不動時即可判定為死亡。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

1.3.1 毒力評價

根據(jù)試驗期間死亡數(shù)及死亡時間，采用SPSS 19.0軟件計算48 h半致死劑量值(LD50)、95%置信限及相應的毒力回歸方程。參照《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》第10部分：農(nóng)藥對蜜蜂急性毒性試驗，按照蜜蜂急性經(jīng)口和接觸的毒性半致死劑量LD50(48 h)，將農(nóng)藥對蜜蜂的毒性分為四個等級：(1)LD50≤0.001 μg a.i./bee，為劇毒；(2)0.001 μg a.i./bee11.0 μg a.i./bee，為低毒。

1.3.2 風險評估

危害商值(Hazard Quotients，HQ)是經(jīng)合組織(OECD，2005)、聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO，1989)、歐洲和地中海植物保護組織(EPPO，2000)等許多國家和國際組織用以初步判斷農(nóng)藥對蜜蜂生態(tài)風險的指標。就蜜蜂而言，其HQ值的計算公式為：HQ=AR/LD50，式中AR代表農(nóng)藥田間推薦用量(g/hm2)，LD50是農(nóng)藥對蜜蜂的急性經(jīng)口或觸殺試驗所得值(μg a.i./bee)。如果HQ值小于50，則農(nóng)藥對蜜蜂無害；反之，則認為該農(nóng)藥對蜜蜂存在風險(EPPO，2000)，HQ值越高，化學農(nóng)藥對蜜蜂的風險性越高。HQ小于50時，農(nóng)藥對蜜蜂為低風險；HQ在50-2500時為中等風險；HQ大于2500時為高風險。本文采用急性經(jīng)口及接觸毒性試驗LD50(48 h)計算HQ值。

2 結(jié)果與分析

2.1 10種殺菌劑對中華蜜蜂的急性毒性

從表1發(fā)現(xiàn)，80%代森錳鋅可濕性粉劑、50%啶酰菌胺水分散型粒劑、50%腐霉利可濕性粉劑、50%烯酰嗎啉可濕性粉劑、100 g/L氰霜唑懸浮劑、20%葉枯唑可濕性粉劑和2%春雷毒素水劑等7種殺菌劑對中華蜜蜂的急性經(jīng)口毒性半致死劑量LD50(48 h)及急性接觸毒性半致死劑量LD50(48 h)均大于11.0 μg a.i./bee，按照《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》中農(nóng)藥對蜜蜂的毒性等級劃分，對中華蜜蜂工蜂的毒性為低毒。

12.50%腈菌唑乳油、25%丙環(huán)唑乳油和15%咪鮮胺微乳劑等3種殺菌劑對中華蜜蜂的急性經(jīng)口毒性LD50值(48 h)分別為2.154、5.176和1.817 μg a.i. /bee，接觸毒性LD50值(48 h)分別為4.697、7.261和3.228 μg a.i. /bee。按照《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》中農(nóng)藥對蜜蜂的毒性等級劃分，腈菌唑及丙環(huán)唑?qū)χ腥A蜜蜂工蜂的急性經(jīng)口毒性和急性接觸毒性均為中毒，咪鮮胺對中華蜜蜂工蜂的急性經(jīng)口毒性為高毒，急性接觸毒性為中毒。3種藥劑急性經(jīng)口毒性半致死劑量LD50值都小于急性接觸毒性半致死劑量LD50值，說明經(jīng)口攝入這3種殺菌劑更易使中華蜜蜂中毒。

表1 10種殺菌劑對中華蜜蜂工蜂的急性經(jīng)口毒性和接觸毒性(48 h)

2.2 3種殺菌劑中毒癥狀

12.5%腈菌唑乳油、25%丙環(huán)唑乳油及15%咪鮮胺微乳劑引起中華蜜蜂中毒，起初表現(xiàn)為急躁亂飛，橫沖直撞，后續(xù)中華蜜蜂出現(xiàn)身體翻轉(zhuǎn)足朝上抽搐，并且有嘔吐物出現(xiàn)，且農(nóng)藥劑量越高癥狀越明顯。而對照組蜜蜂多數(shù)群聚安靜的趴在蜂籠壁上。死亡中華蜜蜂癥狀表現(xiàn)為雙翅張開、喙伸出、腹部收縮、身體逐漸發(fā)干并散發(fā)出刺鼻臭味等。

2.3 3種殺菌劑對中華蜜蜂的致死效果比較

依照上述急性毒性試驗方法，分別測定了這3種殺菌劑對中華蜜蜂的急性經(jīng)口毒性和急性接觸毒性。圖1-3所示為各供試殺菌劑對中華蜜蜂的平均死亡率，由各組試驗結(jié)果可以得出，隨著供試殺菌劑劑量的逐漸增加，各殺菌劑對中華蜜蜂的平均死亡率逐漸升高。

圖1 12.50%腈菌唑乳油對中華蜜蜂急性毒性試驗結(jié)果Fig.1 The acute toxicity of myclobutanil 125 EC on Apis cerana ceranaⅠ，急性經(jīng)口毒性；Ⅱ，急性接觸毒性。Ⅰ，the acute oral toxicity；Ⅱ，the acute contact toxicity.注：圖中不同大寫字母表示差異極顯著水平(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著水平(P<0.05)，下同。Note: Different capital letters mean significant differences at 0.01 level, different small letters mean significant differences at 0.05 level. The same below.

圖 2 25%丙環(huán)唑乳油對中華蜜蜂急性毒性試驗結(jié)果Fig.2 The acute toxicity of propiconazole 250 EC on Apis cerana cerana

圖 3 15%咪鮮胺微乳劑對中華蜜蜂急性毒性試驗結(jié)果Fig.3 The acute toxicity of prochloraz 150 ME on Apis cerana cerana

2.4 3種殺菌劑對中華蜜蜂的危害商值

供試的3種殺菌劑對中華蜜蜂的危害商值如表2示，中華蜜蜂急性經(jīng)口或接觸12.50%腈菌唑、25%丙環(huán)唑及15%咪鮮胺均為中等風險。3種殺菌劑的HQ順序15%咪鮮胺>12.50%腈菌唑>25%丙環(huán)唑，即15%咪鮮胺對中華蜜蜂的風險性最高，其次是12.50%腈菌唑，25%丙環(huán)唑的風險性最低。

表2 3種殺菌劑對海南蜜蜂的危害商值

3 結(jié)論與討論

近年來，農(nóng)藥對蜜蜂影響的研究引起了業(yè)界廣泛的關(guān)注，據(jù)報道，許多殺蟲劑對蜜蜂表現(xiàn)為高毒(趙帥等，2011；趙怡楠等，2014a，2014b)，同時影響蜜蜂幼蟲的生長發(fā)育(Krupkeetal.，2012)，還影響蜜蜂的學習和記憶能力(Decourtyeetal.，2005；Aliouaneetal.，2009)、勞動分工(Krupkeetal.，2012)、以及采集行為(Decourtyeetal.，2004；Guezetal.，2005)等。而殺菌劑的蜜蜂毒性普遍沒有引起足夠的重視，甚至認為殺菌劑對蜜蜂沒有影響。但在設施作物授粉生產(chǎn)實踐中，由于作物花期使用了殺菌劑而導致蜜蜂群勢衰弱或死亡的現(xiàn)象屢見不鮮。在過去十年中，為控制真菌爆發(fā)，農(nóng)業(yè)殺菌劑的使用量急劇增加(USGS，2015)。而且殺菌劑被施用于種子處理和整個生長季節(jié)的植物植株，這增加了傳粉昆蟲接觸殺菌劑的機會。雖然通常不認為殺菌劑對蜜蜂有劇毒，但最近一項研究發(fā)現(xiàn)高殘留的殺菌劑增加了蜜蜂感染寄生病毒的概率(Pettisetal.，2013)。通常情況下，殺螨劑、殺菌劑和抗菌藥物均以無毒濃度施用，但由于其間的交互作用可能使其對蜜蜂的毒性加劇(Pilling & Jepson，1993；Glavan &Bo?icˇ， 2013；Johnsonetal.，2013)。從而導致殺菌劑暴露率增加，減少生物多樣性和傳粉昆蟲的數(shù)量及其為生態(tài)系統(tǒng)提供的授粉服務(Hladiketal.，2016)。

本文研究結(jié)果表明，12.50%腈菌唑乳油和25%丙環(huán)唑乳油和對中華蜜蜂的急性經(jīng)口毒性和急性接觸毒性均為中毒，15%咪鮮胺微乳劑對中華蜜蜂的急性經(jīng)口毒性為高毒，急性接觸毒性為中毒。其中，咪鮮胺為咪唑類脫甲基抑制劑，腈菌唑和丙環(huán)唑均為三唑類脫甲基抑制劑，均屬于麥角甾醇生物合成抑制劑(Ergosterol Biosynthesis Inhibitors，E-BIs)。這類殺菌劑通過抑制甾醇生物合成C-14脫甲基化酶從而抑制病菌麥角甾醇的生物合成，使菌體細胞膜功能受到破壞，從而抑制或干擾菌體附著胞及吸器的發(fā)育、菌絲和孢子的形成，最終導致細胞死亡(周子燕等，2008)。賈變桃等(2015)研究表明氟硅唑?qū)γ鄯涞慕佑|毒性為高毒，丙環(huán)唑和咪鮮胺為中毒；丙環(huán)唑和抑霉唑?qū)γ鄯涞慕?jīng)口毒性為中毒。郭晶等(2010)研究表明殺菌劑烯效唑、己唑醇、丙環(huán)唑、戊菌唑、腈菌唑以及氟環(huán)唑?qū)Π唏R魚為中等毒性。池艷艷等(2014)報道氟硅唑、烯效醇2種殺菌劑對家蠶2齡幼蟲為中等毒性，具有高風險性。可見此類殺菌劑對非靶標有益昆蟲具有一定的毒性風險，應謹慎使用。

本試驗結(jié)果表明，10種殺菌劑對中華蜜蜂的急性接觸毒性，咪鮮胺、腈菌唑和丙環(huán)唑為中毒，其余7種藥劑均為低毒；10種殺菌劑對中華蜜蜂的急性經(jīng)口毒性，咪鮮胺為高毒，腈菌唑和丙環(huán)唑為中毒，其余7種藥劑均為低毒。因此，應該嚴格禁止咪鮮胺在蜜源作物花期施用，慎重選擇中等毒性殺菌劑腈菌唑和丙環(huán)唑，盡量選擇對蜜蜂低毒的殺菌劑，以保護中華蜜蜂的安全。

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Acute toxicity and hazard assessment of 10 fungicides onApisceranacerana

WANG Ya-Jun1,2,3, GAO Jing-Lin2,3, HAN Wen-Su2,3, LIU Jun-Feng2,3, WANG Yu-Jie2,3, FU Shi-Cheng1,ZHAO Dong-Xiang2,3*

(1. Environment and Plant Protection College, Hainan University, Haikou 570228, China; 2. Environment and Plant Protection Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China; 3.Bee Industry Technology Research Center, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China)

The experiments were carried out to determine the acute toxicity of 10 fungicides, namely mancozeb 800 WP, boscalid 500 WG, procymidone 500 WP, dimethomorph 500 WP, cyazofamid 100 g/L SC, bismerthiazol 200 WP, kasumin 20 AS, myclobutanil 125 EC, propiconazole 250 EC, prochloraz 150 ME, onApisceranaceranaworkers. The acute oral and contact toxicities of 10 fungicides onA.ceranaceranawere conducted by food intake method and drop method in laboratory. The results of virulence evaluation indicated that the acute toxicity of 7 kinds of fungicides, namely mancozeb, boscalid, procymidone, etc, on honey bees were low. The oral and contact toxicity of myclobutanil and propiconazole on honey bees were medium, the oral toxicity of prochloraz was high toxic and the contact toxicity was medium. The risk assessment results showed that these 3 fungicides were medium risk forA.ceranacerana. It is suggested that prochloraz should be forbidden to be applied on honey crops during the pollination period. Myclobutanil and propiconazole with medium toxicity should be cautiously used. In order to protect the safety ofA.ceranacerana, fungicides with low toxicity on honey bees should be chosed as far as possible.

Fungicides；Apisceranacerana；acute toxicity；hazard assessment

國家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設專項(CARS-45-SYZ14，CARS-45-KXJ9)；海南省重點項目(ZDXM2014050)；基本科研業(yè)務費項目(2016hzs1j042)

王雅珺，女，1991年生，碩士研究生，研究方向為蜜蜂毒理學

*通訊作者 Author for correspondence, E-mail: dongxiangzh@163.com

Received：2016-09-19；接受日期 Accepted：2016-11-8

Q965.9;S89

A

1674-0858(2017)01-0126-08

王雅珺，高景林，韓文素，等.10種殺菌劑對中華蜜蜂的急性毒性測定及風險評估[J].環(huán)境昆蟲學報，2017,39(1):126-133.