利用PiggyBac系統(tǒng)在家蠅中表達蜜蜂王漿蛋白MRJP1

熊佳福，張鑒清，劉桂清，韓日疇*

(1. 中國科學(xué)院大學(xué)華南植物園，廣州 510650；2. 廣東省生物資源應(yīng)用研究所，廣東省動物保護與資源利用重點實驗室，廣東省野生動物保護與利用公共實驗室，廣州 510260)

利用PiggyBac系統(tǒng)在家蠅中表達蜜蜂王漿蛋白MRJP1

熊佳福1,2，張鑒清2，劉桂清2，韓日疇2*

(1. 中國科學(xué)院大學(xué)華南植物園，廣州 510650；2. 廣東省生物資源應(yīng)用研究所，廣東省動物保護與資源利用重點實驗室，廣東省野生動物保護與利用公共實驗室，廣州 510260)

家蠅Muscadomestica是一種重要的資源昆蟲，作為飼料蛋白已廣泛應(yīng)用于動物養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)。MRJP1蛋白(Major Royal Jelly Proteins 1, MRJP1)是蜂王漿的主要蛋白成分，具有營養(yǎng)作用和跨物種促細胞增殖作用。構(gòu)建表達意大利蜜蜂Apismellifera王漿蛋白基因Ammrjp1的家蠅可望提高家蠅幼蟲的應(yīng)用價值。本研究構(gòu)建了攜帶Ammrjp1基因的重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pBac[fa PUb-mrjp1-DsRed]，顯微注射家蠅胚胎，成功建立Ammrjp1轉(zhuǎn)基因家蠅品系，RT-PCR證明Ammrjp1基因在轉(zhuǎn)基因家蠅中正常轉(zhuǎn)錄；SouthernBlot證實Ammrjp1基因是以單拷貝的形式插入到家蠅基因組內(nèi)；利用Inverse-PCR技術(shù)獲得Ammrjp1基因在家蠅基因組上插入位點側(cè)翼序列。與野生型家蠅比較，G8代Ammrjp1轉(zhuǎn)基因家蠅4齡幼蟲的百頭重增加8.6%。家蠅遺傳轉(zhuǎn)化體系的成功構(gòu)建，為建立新型轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器和開發(fā)高值動物蛋白飼料提供技術(shù)支持。

Ammrjp1基因；PiggyBac；顯微注射；轉(zhuǎn)基因家蠅

家蠅Muscadomestica屬于昆蟲綱Insecta雙翅目Diptera蠅科Muscidae，具有繁殖能力強、世代周期短和耐高密度養(yǎng)殖等優(yōu)良特點，是昆蟲蛋白飼料的重要來源。家蠅主要的利用階段是幼蟲期—蠅蛆，蠅蛆體內(nèi)含有豐富蛋白質(zhì)、脂肪酸、氨基酸、幾丁質(zhì)、維生素、礦物元素和抗菌肽等多種活性物質(zhì)(吳青華等，2006)。家蠅蠅蛆在蛋白飼料、醫(yī)藥和工農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用價值。

蠅蛆粉作為一種可代替魚粉的蛋白飼料，具有很大的市場應(yīng)用價值。用不同比例的蠅蛆粉飼料飼喂體重相同的青魚8周，發(fā)現(xiàn)在飼料中添加4.2%-5.0%的蠅蛆粉能促進青魚的生長、提高魚體內(nèi)胰臟消化酶的酶活力，并能改善青魚的魚肉口感(劉黎等，2014)。鮮蠅蛆可直接作為餌料，用于畜禽、魚類和其它特種養(yǎng)殖的活餌料。鮮蠅蛆在水中存活的時間相對較長，飼喂對蝦能夠顯著提高對蝦的抗桿狀病毒感染能力，并激活對蝦的酚氧化酶系統(tǒng)(王娓等，2002)。在飼料中添加適量鮮蠅蛆飼養(yǎng)清遠雞，雞群死亡率明顯低于僅使用商業(yè)飼料的雞群，氨基酸含量也顯著提高，說明家蠅幼蟲作為一種蛋白飼料可提高雞的抗病能力以及改善雞肉的口感(常斌等，2007)。加強對家蠅的開發(fā)利用，將為蛋白資源提供更加豐富的來源，有利于蛋白質(zhì)原料工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

蜂王漿作為一種混合物，包含多種蛋白質(zhì)、脂肪酸、糖、維生素等有機成分和無機成分(Chen and Chen，1995)。其中蛋白質(zhì)是蜂王漿中含量最豐富的有機成分，占蜂王漿總量的11%-14%。蜂王漿中的蛋白質(zhì)分為水溶性蛋白和非水溶性蛋白，水溶性蛋白占總蛋白含量的46%-89%，為蜂王漿中蛋白質(zhì)的主要成分，稱為主要王漿蛋白(Major Royal Jelly Proteins，MRJPs)(Schmitzovaetal.，1998；Quetal.，2008)。研究發(fā)現(xiàn)MRJP1是主要王漿蛋白中含量最多的一種主蛋白，不僅在工蜂各階段表達而且在蜂王和雄峰體內(nèi)也有表達(Drapeauetal.，2006；Huangetal.，2012)。并且MRJP1富含的必須氨基酸達48%之多，它可能是一種潛在的功能性食品(Rosmilahetal.，2008)。用MRJP1飼喂果蠅能增加果蠅個體大小和增強繁殖能力，延長壽命并縮短發(fā)育時間，而這些果蠅形態(tài)上的變化是用450 kDa蛋白和酪蛋白飼養(yǎng)所觀察不到的，結(jié)果與用MRJP1誘導(dǎo)蜜蜂幼蟲發(fā)育成為蜂王的實驗結(jié)果一致，這說明該蛋白對生物特征的影響是可以跨物種的(Kamakuraetal.，2011)。

本研究采用的PiggyBac轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒能夠攜帶目的基因進入新的基因組特定靶標位點TTAA，并能在宿主基因組中表達；能攜帶的約15 kb的外源基因片段，遠遠超過傳統(tǒng)病毒載體的攜帶容量(Dingetal.，2005)；轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座作用也不受物種限制，在真核生物許多物種中均能實現(xiàn)轉(zhuǎn)座。目前，PiggyBac轉(zhuǎn)座子已在鱗翅目、雙翅目和鞘翅目等多類昆蟲中成功進行了高效、穩(wěn)定的轉(zhuǎn)座(Kuwayamaetal.，2006；Martinsetal.，2012；Schetelig and Handler，2013)。PiggyBac轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺生物反應(yīng)器中表達有價值的外源蛋白起到了非常重要的作用，Wen等(2010)研究發(fā)現(xiàn)利用PiggyBac載體構(gòu)建蜘蛛絲基因Masp1轉(zhuǎn)基因家蠶，與野生蠶絲相比轉(zhuǎn)基因蠶絲的強度與韌性增加約1.2倍。本論文中為獲得Ammrjp1轉(zhuǎn)基因家蠅品系，建立轉(zhuǎn)基因家蠅新型生物蛋白反應(yīng)器，開發(fā)具有重大經(jīng)濟價值的動物蛋白飼料的研究提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗昆蟲

意大利蜜蜂Aprsmellifera哺育蜂和野生型家蠅，由廣東省生物資源應(yīng)用研究所資源昆蟲與生物工程研究中心飼養(yǎng)。

1.2 質(zhì)粒和菌株

感受態(tài)細胞Trans1-T1、DH5α、Transsetta(DE3)以及克隆質(zhì)粒pEASY-T1-simple，購自廣州全式金公司。克隆質(zhì)粒pSL[fa1180fa]，轉(zhuǎn)座輔助質(zhì)粒pSL[Dmhsp70-hyPBase]和轉(zhuǎn)座載體pBac[faPUb-DsRed]由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所萬方浩實驗室饋贈。表達質(zhì)粒pET-32a(+)由本實驗室保存。

1.3 主要試劑藥品

限制性內(nèi)切酶EcoRI、NotI、BamHI、NcoI、BglII、AscI和MbiI，1 kb、2 kb、5 kb DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司。EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒購自北京全式金有限公司。Roche試劑盒(Dig High Prime DNA Lablling and Detection Starter Kit I)購自廣州齊云生物技術(shù)有限公司。

1.4Ammrjp1基因的克隆及原核表達

1.4.1 哺育蜂總RNA提取與cDNA的合成

采集的哺育蜂樣本液氮速凍后，用振動球磨儀磨碎后直接加入1 mL Trizol(Invitrongen)試劑中，按照試劑盒的說明提取總RNA。并用DNase I酶(RNase-free DNase I, Fermentas Inc)處理，去除殘留基因組DNA的污染。以處理后的RNA為模板，經(jīng)PCR擴增家蠅GAPDH內(nèi)參基因(引物見表1)。未出現(xiàn)GAPDH的特異性條帶，符合下一步實驗要求。按照EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒的說明，取1 μg RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.4.2mrjp1基因的PCR擴增

按照實驗室常規(guī)PCR方法，反應(yīng)體系為50 μL，取2 μL cDNA為模板，2×TransTaq? HiFi Super Mix 25 μL，F(xiàn)orward and Reverse primer各1 μL，32個循環(huán)(94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min)，進行mrjp1的PCR擴增。獲得目的條帶，切膠回收后連接至克隆載體pEASY-T1-simple，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性單菌落測序分析。測序結(jié)果與已經(jīng)公布的mRNA序列(登錄號NM_001011579)進行Blast比對。

1.4.3 意大利蜜蜂mrjp1的原核表達載體構(gòu)建

取測序鑒定成功的pEASY-T1-mrjp1菌株，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，雙酶切(NotI/EcoRI)獲得目的片段，同時雙酶切原核pET-32a(+)載體，獲得相應(yīng)末端的pET-32a(+)載體片段。將回收的目的基因片段與原核表達載體片段用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Transetta(DE3)感受態(tài)細胞，獲得pET-32a(+)-mrjp1原核表達系統(tǒng)。表達菌株轉(zhuǎn)接到帶Car+抗性液體LB中，37℃，200 rpm，培養(yǎng)至OD約為0.4-0.6 h，加入IPTG至終濃度1 mM誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h后，離心收集菌體，加入PBS冰上超聲破碎、離心(4℃，12000 rpm，15 min)，收集總蛋白樣。SDS-PAGE電泳檢測。

1.5Ammrjp1的轉(zhuǎn)座載體構(gòu)建

1.5.1 啟動子PUb克隆載體構(gòu)建

取經(jīng)酶切驗證成功的轉(zhuǎn)座載體pBac[faPUb-DsRed]菌株，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，雙酶切(BglII/BamHI)后獲得PUb啟動子片段，同時雙酶切克隆載體pSL[fa1180fa]獲得相應(yīng)末端的載體片段。然后將啟動子PUb與載體片段進行回收、連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，酶切和測序鑒定。

1.5.2 目的基因mrjp1與啟動子PUb連接

取經(jīng)測序與表達驗證成功的pEASY-T1-mrjp1菌株，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，雙酶切(NcoⅠ/BamHⅠ)后獲得目的基因mrjp1片段，同時雙酶切克隆載體pSL[fa1180fa]-PUb獲得相應(yīng)末端的載體片段。然后將mrjp1與載體片段進行回收、連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，酶切鑒定。

1.5.3 目的基因mrjp1與轉(zhuǎn)座質(zhì)粒連接

取經(jīng)測序驗證成功的pSL[fa1180fa]-PUb-mrjp1菌株，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，單酶切(BglII)質(zhì)粒后獲得PUb-mrjp1片段，單酶切(BglII)轉(zhuǎn)座載體pBac[fa PUb-DsRed](BglII)獲得相應(yīng)末端的載體片段。然后將PUb-mrjp1與載體片段進行回收、連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，酶切及測序鑒定。

1.6 顯微注射及轉(zhuǎn)基因家蠅的建立

1.6.1 轉(zhuǎn)基因家蠅品系建立

將經(jīng)過驗證的重組質(zhì)粒pBac[fa PUb-mrjp1-DsRed]菌株和pSL[Dmhsp70-hyPBase]輔助質(zhì)粒菌株，擴大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒后分別按照最終濃度600 ng/μL和400 ng/μL的量進行共沉淀混合，用于顯微注射。收集20 min內(nèi)生產(chǎn)的新鮮家蠅胚胎，每個胚胎(注射前覆蓋一層薄石蠟油，維持內(nèi)外滲透壓)注入0.05-0.1 μL DNA溶液至極區(qū)，在1 h內(nèi)完成該批次胚胎的顯微注射。注射完成后的胚胎連同載玻片放在人工氣候箱中(25℃, RH 75%)培養(yǎng)16 h，胚胎即可發(fā)育成幼蟲。用毛筆將幼蟲挑至幼蟲飼料(麥麩25 g, 葡萄糖2 g, 全脂奶粉3 g, 純水50 mL)中，放置在室溫條件下即可。蠅蛹羽化后，在顯微鏡下(λ=510-560 nm)觀察鑒定。篩選表達熒光的陽性轉(zhuǎn)基因家蠅個體(G0代)。將G0代轉(zhuǎn)基因雌、雄蟲分別與野生家蠅雜交，篩選轉(zhuǎn)基因純合子。

1.6.2 轉(zhuǎn)基因家蠅鑒定

提取取經(jīng)過熒光顯微鏡鑒定的純合轉(zhuǎn)基因G2代成蠅的總RNA，RT-PCR方法檢測目的基因轉(zhuǎn)錄，按照試劑盒提供的方法，提取家蠅的總RNA，合成cDNA。分別用DsRed-F/R引物和Ammrjp1-F/R引物(表1)檢測合成的cDNA，電泳檢測；Southern Blot技術(shù)檢測目的基因在基因組上的拷貝數(shù)，按照試劑盒說明提取家蠅的總DNA，PCR檢測。取50 μg DNA經(jīng)BamHI 37℃、2 h酶切，30 V電泳3 h。虹吸轉(zhuǎn)膜36 h，將轉(zhuǎn)有DNA的硝酸纖維素膜放在紫外交聯(lián)儀(Stratagene 1800)中交聯(lián)40 s，按照Roche試劑盒說明，取5 ngmrjp1 PCR產(chǎn)物制作探針，在雜交爐中預(yù)雜交和雜交(41℃)孵育，進行嚴謹性洗脫(室溫下洗膜液I振蕩洗脫2×5 min；洗膜液II，于68℃水浴搖床中洗脫2×15 min)，免疫檢測和顯色觀察。利用Inverse-PCR技術(shù)檢測出目的基因在基因組上的插入位點，方法步驟如下：用限制性內(nèi)切酶EcoRI消化1 μg家蠅基因組DNA，在500 μL產(chǎn)物片段體系中，使產(chǎn)物終濃度為1-5 ng/μL，T4連接過夜。根據(jù)設(shè)計的反向引物1(表1)進行第一輪擴增，用第一輪產(chǎn)物作為模板，以反向引物2(表1)進行第二輪擴增，測序分析。測定外源Ammrjp1基因?qū)蚁壣L的影響，各取G8代轉(zhuǎn)基因和野生型家蠅新鮮胚胎(1 h內(nèi))300頭，在相同條件下(飼料、溫度和濕度)培養(yǎng)至4齡幼蟲，重復(fù)3次。分別稱取每組幼蟲的百頭重，比較兩者之間的差異顯著性。

表1 本研究用到的引物

2 結(jié)果與分析

2.1 意大利蜜蜂mrjp1基因的克隆

通過NCBI找到了mrjp1的完整開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)，根據(jù)ORF設(shè)計帶有酶切位點(表1下劃線部分)的引物對mrjp1進行擴增(圖1-A)，并構(gòu)建出重組克隆質(zhì)粒pEASY-T1 simple-Ammrjp1。挑取經(jīng)菌液PCR初步鑒定的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，少量擴增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒通過雙酶切鑒定(圖1-B)，將已經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定的克隆送英濰捷基公司測序，測序結(jié)果與已公布的基因序列一致。

2.2 意大利蜜蜂mrjp1基因的原核表達

重組質(zhì)粒pET-32a(+)-Ammrjp1轉(zhuǎn)化表達宿主大腸桿菌Transetta(DE3)后，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達，在64 kDa附近有一條特異性條帶(圖2泳道3)；而在未誘導(dǎo)的對照中，沒有相應(yīng)大小的蛋白表達帶出現(xiàn)。說明重組MRJP1蛋白的表達受到IPTG的誘導(dǎo)調(diào)控。重組蛋白的分子量大小為67 kDa，其中包含了約20 kDa His-tag等標簽蛋白。

2.3 啟動子PUb克隆載體構(gòu)建

將pBac[fa PUb-DsRed]和pSL[fa1180fa]同時用BglII和BamHI酶切(圖3-A)，分別獲得PUb啟動子和粘性末端載體pSL[fa1180fa]，用T4連接液連接后獲得pSL[fa1180fa]-PUb重組質(zhì)粒，用BglII和BamHI單、雙酶切后(圖3-B)，均在Marker 2000 bp位置獲得目的條帶，說明重組質(zhì)粒pSL[fa1180fa]-PUb構(gòu)建成功。

圖1 Ammrjp1基因的擴增和pEASY-T1 simple-Ammrjp1質(zhì)粒鑒定Fig.1 Amplification product of Ammrjp1geneand analysis of pEASY-T1 simple-Ammrjp1 vector注: M, DNA Marker; A, Ammrjp1基因的擴增結(jié)果; 1-3, 意大利蜜蜂cDNA; B, pEASY-T1 simple-Ammrjp1質(zhì)粒酶切分析; 1-3, pEASY-T1 simple-Ammrjp1質(zhì)粒酶切。Note: M, DNA Marker; A, Amplification product of Ammrjp1 gene; 1-3, cDNA of Apis mellifera; B, Analysis of pEASY-T1 simple-Ammrjp1 vector; 1-3, Restriction enzyme analysis of pEASY-T1 simple-Ammrjp1.

圖2 pET-32a(+)-Ammrjp1的誘導(dǎo)表達Fig.2 Expression of recombinant pET-32a(+)-Ammrjp1 induced 注: M, 蛋白Marker; 1, 加入IPTG 誘導(dǎo)的Transetta(DE3)/pET-32a(+)對照菌總蛋白; 2, 未加入IPTG 誘導(dǎo)的Transetta(DE3)/pET-32a(+)對照菌總蛋白; 3, 加入IPTG 誘導(dǎo)的Transetta(DE3)/pET-32a(+)-Ammrjp1重組菌總蛋白; 4, 未加入IPTG誘導(dǎo)的Transetta(DE3)/pET-32a(+)-Ammrjp1重組菌總蛋白。Note: M, Protein Marker; 1, Transetta(DE3)/pET-32a(+)induced; 2, Transetta(DE3)/pET-32a(+)uninduced; 3, Transetta(DE3)/pET-32a(+)-Ammrjp1 induced; 4, Transetta(DE3)/pET-32a(+)-Ammrjp1 uninduced.

圖3 啟動子PUb的克隆載體構(gòu)建Fig.3 Cloning vector of PUb promoter注: M, DNA Marker; A, pBac[fa PUb-DsRed]酶切電泳分析; 1, BamH I酶切; 2-5, Bgl II/BamH I雙酶切; B, pSL[fa1180fa]-PUb酶切電泳分析; 1-2, Bgl II、BamH I單酶切; 3, Bgl II/BamH I雙酶切。Note: M, DNA Marker; A, Restriction enzyme analysis of pBac[fa PUb-DsRed]; 1, Restriction enzyme analysis of BamH I; 2-5, Restriction enzyme analysis of Bgl II/BamH I; B, Restriction enzyme analysis of pSL[fa1180fa]-PUb; 1-2, Restriction enzyme analysis of Bgl II or BamH I; 3, Restriction enzyme analysis of Bgl II/BamH I.

2.4 目的基因mrjp1與啟動子PUb連接

將保種的pEASY T1 simple-Ammrjp1質(zhì)粒和pSL[fa1180fa]-PUb分別酶切后獲得大目的基因mrjp1片段和載體片段，連接重組后挑取陽性克隆DH5α/pSL[fa1180fa]-PUb-Ammrjp1擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。用BamHI和BglII 兩種酶分別單酶切質(zhì)粒鑒定(圖4)。均能得到相應(yīng)大小的目的條帶，說明載體與片段連接方向正確。

圖4 pSL[fa1180fa]-PUb-Ammrjp1質(zhì)粒的酶切分析Fig.4 Restriction enzyme analysis of pSL[fa1180fa]-PUb-Ammrjp1 vector注: M, DNA Marker; 1, Bgl I酶切; 2, BamH I酶切; 3, Bgl I和BamH I酶切。Note: M, DNA Marker; 1, Restriction enzyme analysis of BglII; 2, Restriction enzyme analysis of BamH I; 3, Restriction enzyme analysis of Bgl II/BamH I.

2.5 目的基因mrjp1與轉(zhuǎn)座質(zhì)粒連接

連接后的重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒長度為12560 bp，用

酶切和測序的方法鑒定片段與載體的連接順序。用NotI和BglI分別酶切重組質(zhì)粒均能獲得與預(yù)期大小一致的目的條帶，用BamHI和AscI 雙酶切后在Marker 7000 bp、3500 bp、2000 bp和900 bp位置附近獲得3條目的條帶(圖5-A，5泳道)，與預(yù)期的正向連接結(jié)果一致。經(jīng)過測序驗證，證明PUb-Ammrjp1與pBac[fa PUb-DsRed]連接正確(圖5-B)。

2.6 熒光顯微鏡鑒定

顯微注射2566頭家蠅胚胎，利用熒光標記篩選從513頭成蠅中篩選出3頭Ammrjp1轉(zhuǎn)基因家蠅，轉(zhuǎn)座效率約0.6%。篩選的G0代個體分別與野生家蠅雜交，當G1代成蠅羽化12 h內(nèi)在熒光顯微鏡下(λ=510-560 nm)篩選出熒光G1代個體，將G1代雌雄蟲相互雜交，篩選紅色熒光個體(G2代)。根據(jù)圖6圖片可以看出，與野生型成蠅對照后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因家蠅的紅色熒光主要在腹部、胸部以及頭部表達。同時與野生型家蠅的蛹相比較，轉(zhuǎn)基因家蠅蛹的末端有相對明顯的發(fā)光現(xiàn)象。

圖5 重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒的酶切分析及圖譜Fig.5 Restriction enzyme analysis of recombinant vector and map of plasmid注: A, 質(zhì)粒的酶切分析。M, DNA Marker; 1, pBac[fa PUb-mrjp1-DsRed]質(zhì)粒; 2, Not I 酶切; 3, Bgl I酶切; 4, BamH I 酶切; 5, BamH I和Asc I酶切; 6, BamH I和Mbi I酶切。 B, pBac[fa PUb-mrjp1-DsRed]重組質(zhì)粒圖譜。Note:A, Restriction enzyme analysis of recombinant vector. M, DNA Marker; 1, pBac[fa PUb-mrjp1-DsRed] plasmid; 2, Restriction enzyme analysis of Not I; 3, Restriction enzyme analysis of Bgl I; 4, Restriction enzyme analysis of BamH I; 5, Restriction enzyme analysis of BamH I and Asc I; 6, Restriction enzyme analysis of BamH I and Mbi I. B， Map of recombinant pBac[fa PUb-mrjp1-DsRed] plasmid.

圖6 熒光在家蠅體內(nèi)的表達分析Fig.6 Expression of fluorescence in housefly注: A, 轉(zhuǎn)基因G1代與野生家蠅的白光; B, 轉(zhuǎn)基因G1代與野生家蠅的熒光; C, 轉(zhuǎn)基因G2與野生家蠅蛹的白光; D, 轉(zhuǎn)基因G2代與野生家蠅蛹的熒光; E, 轉(zhuǎn)基因G2代家蠅的白光；F, 轉(zhuǎn)基因G2代家蠅的熒光。Note: A, Normal photos of nontransformed and transformed G1 flies; B, Fluorescence photos of nontransformed and transformed G1 flies; C, Normal photos of nontransformed and transformed G1 flies pupae; D, Fluorescence photos of nontransformed and transformed G1 flies pupae; E, Normal photos of transformed G2 flies; F, Fluorescence photos of transformed G2 flies.

圖7 轉(zhuǎn)基因家蠅PCR分析Fig.7 PCR analysis of transgenic housefly 注:A, 家蠅DNA和cDNAPCR; M, DNA Marker; 1, 野生家蠅DNA; 2, 野生家蠅cDNA; 3, 轉(zhuǎn)基因家蠅cDNA。 B, 家蠅cDNA PCR; 1和3, 野生型家蠅cDNA; 2, 轉(zhuǎn)基因家蠅cDNA; 4, pBac[fa PUb-mrjp1-DsRed]質(zhì)粒。 C, 家蠅DNA PCR; 1-2, 轉(zhuǎn)基因家蠅基因組DNA; 3, pBac[fa PUb-mrjp1- DsRed]質(zhì)粒; 4, 野生型家蠅基因組DNA。Note: A, PCR of housefly DNA / cDNA; M, DNA Marker;1, DNA of wild housefly; 2, cDNA of wild housefly; 3, cDNA of transgenic housefly. B, PCR of housefly cDNA; 1 and 3, cDNA of wild housefly; 2, cDNA of transgenic housefly; 4, pBac[fa PUb-mrjp1-DsRed] plasmid. C, PCR of housefly DNA; 1-2, DNA of transgenic housefly; 3, pBac[fa PUb-mrjp1-DsRed] plasmid; 4, DNA of wild housefly.

2.7 轉(zhuǎn)基因家蠅鑒定

利用家蠅的內(nèi)參基因GAPDH引物PCR檢測逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA是否有基因組DNA污染，如圖7-A所示，只有野生型家蠅提取的DNA出現(xiàn)GAPDH條帶，其余均沒有條帶，說明合成的cDNA樣品中無DNA污染。圖7-B所示以Ammrjp1基因F/R為引物PCR鑒定，轉(zhuǎn)基因家蠅cDNA樣品和pBac[fa PUb-mrjp1-DsRed]質(zhì)粒樣品有目的條帶，證明Ammrjp1基因能在家蠅體內(nèi)正常轉(zhuǎn)錄。分別以野生型家蠅基因組DNA、G2代轉(zhuǎn)Ammrjp1家蠅基因組DNA和pBac[fa PUb-mrjp1-DsRed]質(zhì)粒為模板，以Ammrjp1-for、Ammrjp1-rev引物進行PCR擴增(如圖7-C)，獲得特異性目的產(chǎn)物，證明Ammrjp1已整合至家蠅基因組中。Southern Blot 檢測證明Ammrjp1基因以單拷貝的形式插入家蠅基因組中(圖8)。Inverse-PCR技術(shù)獲得Ammrjp1基因在家蠅基因組上插入位點側(cè)翼序列(圖9)，由于家蠅基因組基因標記信息不完整，無法準確定位插入染色體位置。通過分析野生型和G8代轉(zhuǎn)基因型4齡幼蟲百頭重的顯著性差異(圖10)，發(fā)現(xiàn)兩者差異顯著，說明Ammrjp1基因的插入能夠促進家蠅的生長發(fā)育。

圖8 Southern Blot檢測轉(zhuǎn)基因家蠅插入拷貝數(shù)Fig.8 Southern Blotting analysis of transgenic housefly genomic DNA注: M, DNA Marker; 1, 轉(zhuǎn)基因基因組DNA; 2, mrjp1 PCR產(chǎn)物; 3, 野生型基因組DNA。Note: M, DNA Marker; 1, DNA of transgenic housefly; 2, mrjp1; 3, DNA of wild housefly.

圖9 Inverse-PCR檢測轉(zhuǎn)基因家蠅插入位點Fig.9 Inverse-PCR analysis of transgenic housefly genomic DNA注: 下劃線(直線), 轉(zhuǎn)座質(zhì)粒序列; 下劃線(波浪線), 家蠅基因組DNA序列(Sequence ID:gb|AQPM01090136.1| 2084-1377; Sequence ID:gb|AQPM01013585.1|229-603)。Note: Underline (straight line), sequences of the pBac plasmid; Underline (break line), sequences of the transgenic housefly genomic DNA (Sequence ID:gb|AQPM01090136.1| 2084-1377; Sequence ID:gb|AQPM01013585.1| 229-603).

圖10 G8轉(zhuǎn)基因和野生家蠅幼蟲百頭重Fig.10 One hundred larval weight of G8 transgenic flies and wild type flies注：不同小寫字母表示不同類型差異在P<0.05水平顯著。Note: Different lowercase letters indicate significant differences between treatments (P<0.05).

3 結(jié)論與討論

本研究為了獲得有完整生物學(xué)功能的蜜蜂主要王漿蛋白1(mrjp1)轉(zhuǎn)基因家蠅，構(gòu)建含有該基因的轉(zhuǎn)座重組質(zhì)粒pBac[fa PUb-mrjp1-DsRed]具有以下特點：(1)帶有PUb組成型啟動子，該啟動子具有啟動效率高、甲基化程度相對較低和遺傳穩(wěn)定等特點，同時能在中腸、脂肪體、馬氏管和飛行肌等組織中高度表達(Barrioetal.，1994)，便于后續(xù)實驗的篩選；(2)帶有PiggyBac轉(zhuǎn)座元件，能特異性識別靶序列TTAA位點；(4)DsRed作為一種常用的熒光標記基因，已經(jīng)在地中海實蠅Ceratitiscapitata、埃及伊蚊Aedesaegypti以及墨西哥按實蠅Anastrephaludens等昆蟲轉(zhuǎn)基因篩選中成功應(yīng)用(Fuetal.，2007；Smithetal.，2007；Zimowskaetal.，2009)。(5)同時注射的pSL[Dmhsp70-hyPBase]輔助質(zhì)粒，利用果蠅來源的hsp70強啟動子，能在溫度誘導(dǎo)環(huán)境下促進外源基因整合進目標生物基因組內(nèi)，并啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控，實現(xiàn)目的基因的穩(wěn)定遺傳。通過顯微注射技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因昆蟲需要解決成功率不高的問題，往往需要技術(shù)員增大顯微注射的胚胎基數(shù)來增加陽性個體的幾率。瑞士蘇黎世大學(xué)動物研究中心的研究人員在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因家蠅過程中，總共注射了1668頭家蠅胚胎，最終存活244頭，存活率約為14%。造成存活率低的原因除了機械損傷外，還有一些是非受精卵，不能發(fā)育成成蠅(Hedigeretal.，2001)。造成轉(zhuǎn)基因陽性個體概率較低的可能原因：(1)外源基因整合至家蠅重要功能基因上，影響家蠅的正常發(fā)育；(2)外源基因轉(zhuǎn)座時以多拷貝的形式插入到基因組上，影響家蠅的正常代謝或生理活動；(3)轉(zhuǎn)座質(zhì)粒以線狀DNA形式比較容易插入基因組上，而注射時質(zhì)粒是以環(huán)狀的形式注入胚胎內(nèi)，在胚胎內(nèi)未經(jīng)有效酶切成線狀而影響基因的整合效率。在以上因素的影響下，造成了陽性轉(zhuǎn)基因個體概率偏低的現(xiàn)象。由于家蠅新鮮胚胎卵殼比較軟，在本研究中未采用果蠅常用的次氯酸鈉溶液浸泡脫卵殼方法，直接用極細的玻璃針注射家蠅胚胎，有利于減少對胚胎的機械傷害，家蠅胚胎的存活率提高至30%左右。

本研究利用熒光顯微鏡(λ=510-560 nm)初步篩選轉(zhuǎn)基因家蠅個體G1，提取G2代轉(zhuǎn)基因家蠅基因組DNA和總RNA，分別進行PCR和RT-PCR驗證，均能獲得特異性目的基因Ammrjp1條帶，證明目的基因mrjp1已經(jīng)插入到家蠅基因組上，并且能夠在家蠅體內(nèi)正常轉(zhuǎn)錄。利用Southern Blot雜交技術(shù)證明Ammrjp1是以單拷貝的形式插入家蠅基因組上?；赑iggBac的轉(zhuǎn)基因方法是以隨機方式整合至家蠅基因組上，利用Inverse-PCR技術(shù)獲得Ammrjp1基因在家蠅基因組上插入位點側(cè)翼序列，由于家蠅基因組信息的不完善，無法準確獲得外源基因在染色體上的位置。比較野生型家蠅與G8代轉(zhuǎn)基因家蠅4齡幼蟲百頭重顯著性差異，發(fā)現(xiàn)Ammrjp1插入家蠅基因組能夠促進家蠅的生長發(fā)育，比野生家蠅幼蟲增加8.6%的重量，但是具體機制還不明確，需要經(jīng)過進一步的實驗才能驗證。

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Expression of honey bee royal jelly protein MRJP1 in houseflyMuscadomesticawith a transposon PiggyBac

XIONG Jia-Fu1,2, ZHANG Jian-Qing2, LIU Gui-Qing2, HAN Ri-Chou2*

(1. University of Chinese Academy of Sciences, South China Botanical Garden, Guangzhou 510650, China; 2. Guangdong Key Laboratory of Animal Conservation and Resource Utilization, Guangdong Public Laboratory of Wild Animal Conservation and Utilization, Guangdong Institute of Applied Biological Resources, Guangzhou 510260, China)

HouseflyMuscadomesticais an important resource insect, which is widely applied as feed protein in animal breeding industry. MRJP1 (Major Royal Jelly Proteins 1, MRJP1)is the main protein components in the honey bee royal jelly, with the function of nutrition and promotion of cell proliferation across species. With an aim to improve the application value of the housefly larvae, a transgenic housefly strain withAmmrjp1 gene inApismelliferawas constructed. In this study, the pBac[fa PUb-mrjp1-DsRed] recombinant plasmid withAmmrjp1 gene was constructed, and successfully microinjected into housefly embryos. RT-PCR showed thatAmmrjp1 was normally transcribed. Southern Blot indicated thatAmmrjp1 was inserted into the housefly genome with a single copy. The insert site sequence ofAmmrjp1 in the genome was cloned by Inverse-PCR. Compared to the non-transgenic houseflies, the weight of one hundred fourth instar G8 transgenic houseflies was 8.6% higher. This construction of genetic transformation system in housefly would provide technical support for the establishment of new transgenic bioreactors and the development of high-value animal protein feedstuffs.

Ammrjp1 gene; PiggyBac; microinjection; transgenic housefly

廣東省科技計劃項目(2015B070701019)；廣東省科學(xué)院科研平臺環(huán)境與能力建設(shè)專項(2016GDASPT-0107)；國家科技支撐計劃課題(2012BAD14B16)

熊佳福，男，1989年生，湖南常德人，碩士研究生，研究方向為轉(zhuǎn)基因家蠅的研究，E-mail: jiafuxiong163@163.com

*通訊作者Author for correspondence, E-mail:hanrc@giabr.gd.cn

Received：2016-12-27；接受日期Accepted：2017-01-20

Q963

A

1674-0858(2017)01-0075-10

熊佳福，張鑒清，劉桂清，等.利用PiggyBac系統(tǒng)在家蠅中表達蜜蜂王漿蛋白MRJP1 [J].環(huán)境昆蟲學(xué)報，2017,39(1):75-84