高速逆流色譜法分離紅葡萄皮中的花色苷

李媛媛，李靈犀,，崔艷，孫寶山*

(1.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽110016；2.沈陽藥科大學(xué)功能食品與葡萄酒學(xué)院，遼寧沈陽110016）

高速逆流色譜法分離紅葡萄皮中的花色苷

李媛媛1，李靈犀1,2，崔艷2，孫寶山2*

(1.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽110016；2.沈陽藥科大學(xué)功能食品與葡萄酒學(xué)院，遼寧沈陽110016）

建立高速逆流色譜(HSCCC)法分離制備紅葡萄皮中花色苷單體的方法。以乙腈-正丁醇-甲基叔丁基醚-水-三氟乙酸(1∶40∶1∶50∶0.01，V/V)為溶劑體系，上相（有機(jī)相）為固定相，下相（水相）為流動相，流速為2.0 mL/min，轉(zhuǎn)速為950 r/min，進(jìn)樣量為200 mg，分離得到的組分利用紫外-可見（UV）光譜和液質(zhì)聯(lián)用（HPLC-MS）技術(shù)進(jìn)行定性分析。結(jié)果表明，經(jīng)過一次高速逆流分離即可得到3種花色苷單體，分別為飛燕草色素-3-O-葡萄糖苷、錦葵色素-3-O-葡萄糖苷和芍藥色素-3-O-葡萄糖苷，高效液相色譜（HPLC）峰面積歸一法計(jì)算其純度分別為93.7%、95.2%、91.6%。采用高速逆流色譜法成功從紅葡萄皮中一次性分離得到3種高純度的花色苷單體，其中芍藥色素-3-O-葡萄糖苷為首次分離得到。

紅葡萄皮；花色苷；高速逆流色譜；分離

近年來，植物花色苷所表現(xiàn)出的多種生物活性引起了人們的廣泛關(guān)注[1-4]，特別是隨著食用合成色素暴露出的慢性毒性、致癌等問題[5-7]，從葡萄皮等天然植物中提取天然無害的食用色素已成為食品科學(xué)研究中的重要課題。大量的研究表明，從植物中提取得到的花色苷具有很好的抗氧化、抗癌、抗炎、抑菌、降血脂等生物活性[8-12]。然而這些花色苷生物活性的研究多來自于花色苷粗提物，有關(guān)花色苷單體生物活性的研究卻相對較少。由于花色苷粗提物中的成分比較復(fù)雜，既含有花色苷單體化合物又含有原花青素、酚酸、白藜蘆醇等其他多酚類化合物[13]。這些多酚類化合物同樣也具有很強(qiáng)生物活性，這就導(dǎo)致有關(guān)花色苷生物活性的研究結(jié)果存在不確定性，相應(yīng)的作用機(jī)制也就不能夠被進(jìn)一步闡明[14-15]。另外，由于國內(nèi)市場上花色苷標(biāo)準(zhǔn)品的缺乏，目前有關(guān)花色苷定量分析的研究仍采用pH示差法測量其總花色苷含量，而非花色苷單體的含量[16]。因此，找到一種快速有效的分離方法來大量制備花色苷單體顯得尤為重要。但花色苷結(jié)構(gòu)的相似性和復(fù)雜性，使得硅膠色譜等傳統(tǒng)分離技術(shù)難以大規(guī)模分離得到高純度的花色苷單體[17-19]。高速逆流色譜（high-speedcountercurrent chromatography，HSCCC）作為一種新興的分離技術(shù)，具有操作簡便、制備量大、無不可逆吸附等特點(diǎn)，被廣泛用于天然活性成分的分離[20-23]。本研究建立了高速逆流分離制備紅葡萄皮中3種主要花色苷單體的方法，能夠有效快速有效的分離制備出高純度的花色苷單體化合物，有助于今后進(jìn)一步對花色苷單體生物活性的研究以及富含花色苷產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅葡萄皮多酚提取物：寧波北侖康正生物技術(shù)有限公司；對照品飛燕草色素-3-O-葡萄糖苷、錦葵色素-3-O-葡萄糖苷、芍藥色素-3-O-葡萄糖苷：上海西寶生物科技有限公司。

乙腈、甲醇（均為色譜純）、正丁醇、甲基叔丁基醚、乙腈、三氟乙酸（均為分析純）：山東禹王集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

TBE-300B高速逆流色譜儀：上海同田生化技術(shù)有限公司；TBP-5002輸液泵、UV-2000D紫外檢測器：上海三為科學(xué)儀器有限公司；DC-0506低溫恒溫槽：上海同田生化技術(shù)有限公司；Alliance e2695高效液相色譜儀（配2998PDA檢測器）：美國Waters公司；BSA124S電子天平：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；KQ-300DB數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；LTQ Orbitrap XL ETD液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

稱取紅葡萄皮多酚提取物400 mg，置于具塞錐形瓶中，加入HSCCC溶劑體系乙腈-正丁醇-甲基叔丁基醚-水-三氟乙酸（1∶40∶1∶50∶0.01，V/V）的有機(jī)相150 mL，超聲（100 W、40℃）提取10 min，過濾，重復(fù)上述操作，合并濾液，濾液經(jīng)35℃減壓濃縮后真空冷凍干燥（-60℃、24 h），得到花色苷粗提物，干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 高速逆流色譜分離

以乙腈-正丁醇-甲基叔丁基醚-水-三氟乙酸（1∶40∶1∶50∶0.01，V/V)為溶劑體系，充分混合，靜置分層，超聲脫氣10 min，上相（有機(jī)相）為固定相，下相（水相）為流動相。先以35 mL/min的流速泵入固定相，待固定相充滿管道后，打開主機(jī)調(diào)整轉(zhuǎn)速為950 r/min，主機(jī)正轉(zhuǎn)，溫度為25℃，以2.0 mL/min的流速泵入流動相，當(dāng)流動相從主機(jī)出口流出后進(jìn)樣（200 mg的花色苷粗提物溶于20 mL的下相），檢測波長280 nm。根據(jù)峰形手動收集組分A、B、C、D、E，35℃真空濃縮后冷凍干燥。

1.3.3 純度測定與組分鑒定

（1）紫外-可見光譜分析

高速逆流分離所得的組分用0.2%甲酸水溶解，分別在波長250～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，分析其光譜特征。

（2）HPLC分析

高效液相色譜條件：Innoval C18色譜柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm），檢測波長525 nm，柱溫：30℃，流速：0.5 mL/min，洗脫溶劑A為0.2%甲酸水溶液，B為0.2%甲酸乙腈溶液。梯度洗脫條件：0 min，5.4%B；59 min，14.1%B；60 min，20% B；80 min，27%B。峰面積歸一化法的純度計(jì)算公式為：

式中：wi、fi、Ai分別為待測組分i的峰面積百分?jǐn)?shù)、校正因子和峰面積。

（3）芐硫醇水解

稱取6mg的樣品粉末，加入1mL的甲醇溶解。取0.5mL的樣品溶液加入至0.5 mL的5%芐硫醇溶液中（0.2 mol/L鹽酸酸化），密封，90℃反應(yīng)2 min，冷水浴終止反應(yīng)，過濾，進(jìn)行高效液相色譜分析。

（4）液質(zhì)聯(lián)用分析

色譜條件：WatersSymmetryC18色譜柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm），檢測波長525 nm，柱溫：30℃，流速：0.5 mL/min，洗脫溶劑A為0.2%甲酸水溶液，B為0.2%甲酸乙腈溶液。梯度洗脫條件為：0 min，5.4%B；59 min，14.1%B；60 min，20%B；80 min，27%B。

質(zhì)譜條件：電噴霧（electronic spray ion，ESI）離子源；噴射電壓4 kV；毛細(xì)管溫度400℃；毛細(xì)管電壓17 V；干燥氣體流速16.7 L/min；輔助氣體流速3.3 L/min，掃描質(zhì)量范圍：200～1 500 m/z，正離子模式。

（5）定性分析

高效液相定性：按照高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析方法，通過對比組分和標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間以及標(biāo)準(zhǔn)加入法對組分進(jìn)行初步定性。

液質(zhì)聯(lián)用定性：按照液質(zhì)聯(lián)用分析方法，通過對比組分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)來進(jìn)一步的進(jìn)行定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的確定

紅葡萄皮多酚提取物中除花色苷外還含有大量的非目標(biāo)組分，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，直接以該提取物作為HSCCC進(jìn)樣原料時(shí)，這些非目標(biāo)組分將嚴(yán)重影響分離效果，降低分離效率，因此應(yīng)將其盡可能減少或除去。關(guān)于花色苷類物質(zhì)的提取方法，常見的主要有：溶劑萃取法、超臨界流體萃取法、超聲波輔助提取法和酶法等[24]。本研究中采用超聲波輔助提取法對紅葡萄皮中花色苷的提取方法進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳提取工藝。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道花色苷在酸性條件下的提取率較高，且酸有助于保持花色苷的穩(wěn)定性[25-26]。本研究在文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，考察了酸化乙醇和酸化甲醇兩種溶劑體系[27-28]。HPLC峰面積百分含量分析結(jié)果表明，提取液中花色苷的含量分別為15.3%和17.9%，但是相應(yīng)的雜質(zhì)峰的種類也較多，影響花色苷的進(jìn)一步分離；進(jìn)而選擇HSCCC溶劑體系的上相作為提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取液中花色苷的百分含量為19.4%，相應(yīng)的雜質(zhì)峰較少，此時(shí)經(jīng)HSCCC進(jìn)樣后也可獲得較好的分離效果。因此，本實(shí)驗(yàn)最終選擇HSCCC溶劑體系的上相作為提取溶劑來對紅葡萄皮中的花色苷進(jìn)行提取。該方法與傳統(tǒng)的提取工藝相比，對花色苷的提取率更高。

2.2 高速逆流色譜（HSCCC）分離

按照1.3.2的方法，以乙腈-正丁醇-甲基叔丁基醚-水-三氟乙酸（1∶40∶1∶50∶0.01，V/V）為溶劑體系，經(jīng)過HSCCC分離，共分離得到5個(gè)組分，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，測得下固定相保留率為41.7%，說明該體系可行。從200mg葡萄皮粗提物中分離得到組分A（31.8 mg）、B（17.4 mg）、C（0.9 mg）、D（5.9 mg）、E（3.3 mg）。

圖1 高速逆流色譜法分離紅葡萄皮花色苷的色譜圖Fig.1 HSCCC chromatogram of anthocyanins separated from the red grape skins

2.3 紫外-可見光譜分析

圖2 高速逆流色譜法分離紅葡萄皮花色苷中組分的紫外光譜圖Fig.2 Ultraviolet spectrogram of the anthocyanins components separated from red grape skins by HSCCC

花色苷是黃酮類化合物，在波長280 nm與520 nm左右有特征吸收峰，而其他類黃酮化合物（如黃酮、黃酮醇、黃烷酮等）在波長300～400 nm和240～280 nm的紫外區(qū)有吸收[29]，因此可將在波長280 nm和520 nm左右有無特征吸收作為判斷是否為花色苷類物質(zhì)的依據(jù)。

由圖2可知，組分A在279.2 nm和342.7 nm有吸收，組分B在278.6 nm和340.2 nm有吸收，二者均在520 nm處沒有吸收，故推測組分A、B為非花色苷類化合物。組分C在276.0 nm和521.7 nm有特征吸收、組分D在276.0 nm和 526.6 nm有特征吸收、組分E在278.4 nm和515.6 nm有特征吸收，故推測組分C、D、E為花色苷類化合物。

2.4 HPLC分析

采用SPRANGER I等[30]建立的芐硫醇水解方法，對組分A、B水解后經(jīng)HPLC分析計(jì)算得出其聚合度分別為7.6±0.2和6.2±0.1，由此確定組分A、B為多聚體。

采用高效液相色譜峰面積歸一法，對組分C、D、E 3個(gè)組分進(jìn)行純度檢測分析，結(jié)果見圖3。根據(jù)峰面積計(jì)算出組分C、D、E的純度分別為93.7%、95.2%、91.6%。

圖3 高速逆流色譜法分離紅葡萄皮花色苷中組分的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of the anthocyanins components separated from red grape skins by HSCCC

2.5 分離組分鑒定

采用液質(zhì)聯(lián)用在正離子模式下對HSCCC分離得到的三個(gè)組分進(jìn)行鑒定，并對目標(biāo)離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道以及與對照品對比保留時(shí)間和特征吸收波長，最終確定這3個(gè)花色苷單體，結(jié)果見表1。

表1 高速逆流色譜法分離紅葡萄皮花色苷中組分鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of the anthocyanins components separated from red grape skins by HSCCC

由表1可知，組分C的一級質(zhì)譜中（ESI+）分子離子峰m/z為465.13，二級質(zhì)譜中碎片離子為m/z303.36。[M-162+H]+，是分子離子峰失去3-O位上結(jié)合的糖基所得的碎片，推測為飛燕草色素-3-O-葡萄糖苷。經(jīng)過進(jìn)一步與標(biāo)準(zhǔn)品對比，確認(rèn)化合物為飛燕草色素-3-O-葡萄糖苷（delphinidin-3-O-glucoside）。上述質(zhì)譜信息與文獻(xiàn)對比結(jié)果基本一致[31-32]。

組分D的一級質(zhì)譜中（ESI+）分子離子峰m/z為493.10，二級質(zhì)譜中碎片離子為m/z 331.31。[M-162+H]+，是分子離子峰失去3-O位上結(jié)合的糖基所得的碎片，推測為錦葵色素-3-O-葡萄糖苷。經(jīng)過進(jìn)一步與標(biāo)準(zhǔn)品對比，確認(rèn)化合物為錦葵色素-3-O-葡萄糖苷（malvidin-3-O-glucoside）。上述質(zhì)譜信息與文獻(xiàn)對比結(jié)果基本一致[31-32]。

組分E的一級質(zhì)譜中（ESI+）分子離子峰m/z為463.17，二級質(zhì)譜中碎片離子為m/z 301.35。[M-162+H]+，是分子離子峰失去3-O位上結(jié)合的糖基所得的碎片，推測為芍藥色素-3-O-葡萄糖苷。經(jīng)過進(jìn)一步與標(biāo)準(zhǔn)品對比，確認(rèn)化合物為芍藥色素-3-O-葡萄糖苷（peonidin-3-O-glucoside）。上述質(zhì)譜信息與文獻(xiàn)對比結(jié)果基本一致[31-32]。

3 結(jié)論

本研究通過對提取溶劑的考察，采用高速逆流溶劑體系的上相作為提取溶劑來提取紅葡萄皮中的花色苷組分，與傳統(tǒng)的提取工藝相比，提取液中花色苷的百分含量由15.3%（酸化乙醇）和17.9%（酸化甲醇）增加至19.4%，對花色苷的提取率更高。

與傳統(tǒng)的分離方法相比，本研究建立的HSCCC分離方法，可得到飛燕草色素-3-O-葡萄糖苷、錦葵色素-3-O-葡萄糖苷和芍藥色素-3-O-葡萄糖苷分別為93.7%、95.2%、91.6%的花色苷單體化合物。

對于傳統(tǒng)的柱色譜分離來說，多聚體與花色苷的分離一直是個(gè)難點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)中利用HSCCC可以有效的實(shí)現(xiàn)兩者的分離，有助于今后對多聚體的深入研究。

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Isolation of anthocyanins from red grape skins by high-speed countercurrent chromatography

LI Yuanyuan1,LI Lingxi1,2,CUI Yan2,SUN Baoshan2*
(1.School of Pharmacy,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110016,China; 2.School of Functional Food and Wine,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110016,China)

The method for separation and preparation of anthocyanin monomers from red grape skins by high-speed countercurrent chromatography (HSCCC)was established.Using acetonitrile-n-butyl alcohol-methyl tert-butyl ether(MTBE)-water-trifluoroacetic acid(TFA)(1∶40∶1∶50∶0.01,V/V) as solvent system,upper-phase(organic phase)as stationary phase and lower phase(water phase)as mobile phase,with the flow rate of 2 ml/min,rotation speed of 950 r/min and sample injection of 200 mg,the compounds obtained were identified by ultraviolet-visible(UV)spectroscopy and high performance liquid chromatography-mass spectrometry(HPLC-MS)for qualitative analysis.The results showed that the major anthocyanins were delphinidin-3-O-glucoside,malvidin-3-O-glucoside and peonidin-3-O-glucoside.They were successfully separated one from another through HSCCC with the purity of 93.7%,95.2%and 91.6%,respectively.Three anthocyanins monomers with high purity were successfully one-time separated from red grape skins by HSCCC and the compound of peonidin-3-O-glucoside was firstly isolated in this work.

red grape skins;anthocyanins;high-speed countercurrent chromatography;separation

R28

0254-5071（2017）02-0157-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.034

2016-11-08

遼寧省科技廳引進(jìn)海外研發(fā)團(tuán)隊(duì)專項(xiàng)資金(遼外專2011-5號)

李媛媛(1991-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槠咸雅c葡萄多酚。

*通訊作者：孫寶山(1962-)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槠咸雅c葡萄酒科學(xué)。