阿司匹林丁香酚酯的一代繁殖毒性研究

趙曉樂，孔曉軍，楊亞軍，劉希望，李世宏，秦哲，焦增華，李劍勇(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050)

阿司匹林丁香酚酯的一代繁殖毒性研究

趙曉樂，孔曉軍，楊亞軍，劉希望，李世宏，秦哲，焦增華，李劍勇*
(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050)

為了初步評(píng)價(jià)阿司匹林丁香酚酯(AEE)對(duì)親代大鼠的生殖功能和子代早期發(fā)育的影響，將360只Wistar大鼠隨機(jī)分成6組，分別為受試藥物AEE高、中、低劑量組(劑量分別為498.0、124.5和31.1 mg·kg-1·d-1)，阿司匹林組(劑量為68.4 mg·kg-1·d-1)，丁香酚組(劑量為246.0 mg·kg-1·d-1)，空白對(duì)照組(給予常規(guī)維持飼料)。各實(shí)驗(yàn)組均按設(shè)定劑量連續(xù)給藥10周后，測(cè)定親代大鼠主要的臟器系數(shù)、繁殖指數(shù)和生產(chǎn)指標(biāo)以及子代(F1)仔鼠的出生指標(biāo)和生長(zhǎng)指標(biāo)。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，高劑量的AEE影響胎鼠的生長(zhǎng)(P<0.05)，并且高劑量AEE組大鼠的妊娠率、窩產(chǎn)仔數(shù)、出生活仔率和出生存活率都偏低，其中雄性仔鼠比例偏高；阿司匹林組妊娠大鼠和哺乳期胎鼠生長(zhǎng)緩慢(P<0.05)；高劑量組AEE親代大鼠的睪丸和附睪系數(shù)偏高(P<0.05)，阿司匹林和丁香酚組子代大鼠的附睪系數(shù)偏高(P<0.05)。結(jié)果表明，在本試驗(yàn)條件下，AEE對(duì)大鼠繁殖毒性的最大無損害作用劑量為31.1 mg·kg-1·d-1，對(duì)大鼠的最小有損害作用劑量為124.5 mg·kg-1·d-1。

阿司匹林丁香酚酯；生殖毒性；發(fā)育毒性；繁殖指標(biāo)

阿司匹林丁香酚酯(Aspirin eugenol ester, AEE)由阿司匹林(Aspirin)與丁香酚(Eugenol)經(jīng)過酰氯反應(yīng)合成的一種新型的無色透明藥用化合物。前期研究表明AEE一方面可降低Aspirin對(duì)胃腸道的刺激性，另一方面又可增強(qiáng)Eugenol的穩(wěn)定性，同時(shí)臨床作用的結(jié)構(gòu)部位不會(huì)發(fā)生改變[1]。藥理學(xué)研究表明，等劑量的AEE對(duì)二甲苯致大鼠耳廓腫脹模型的抗炎效果與Aspirin相當(dāng)，在酵母菌致大鼠發(fā)熱模型中，AEE的解熱效果與等劑量的Aspirin無顯著差異，但AEE的藥效更持久。此外，AEE還具有鎮(zhèn)痛、抗氧化、抑制血小板聚集、降低血脂等生物活性[2-4]。藥代動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，AEE在體內(nèi)首先分解代謝為水楊酸和Eugenol，進(jìn)而水楊酸和Eugenol均進(jìn)行二相代謝轉(zhuǎn)化生成水楊酸的葡萄糖醛酸結(jié)合物、水楊酸的甘氨酸結(jié)合產(chǎn)物和Eugenol的葡萄糖醛酸結(jié)合物和Eugenol的硫酸結(jié)合產(chǎn)物，并且這些代謝產(chǎn)物在血漿和尿液中都可以檢測(cè)到[5]。毒理學(xué)研究表明，AEE對(duì)小鼠經(jīng)口急性毒性的半數(shù)致死量(LD50)為10.39 mg/kg，大鼠經(jīng)口急性毒性的LD50是5.98 mg/kg，而前藥Aspirin和Eugenol的大鼠急性經(jīng)口毒性分別為1.93 mg/kg和1.5 mg/kg[6]，說明AEE相比前體藥物毒性更低。由于合成AEE的前藥Aspirin是研究藥物致畸作用的陽性對(duì)照藥物，而AEE在體內(nèi)分解為Aspirin和Eugenol，因此，AEE是否具有繁殖毒性值得研究。目前未見AEE的繁殖毒性研究報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)就AEE對(duì)妊娠大鼠、胚胎及子代發(fā)育是否有影響進(jìn)行了研究。

1 材料與方法1.1 藥物與試劑 AEE(純度>99%，HPLC方法檢測(cè))，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所制備；Aspirin，武漢合中化工制造有限公司，純度>99.9%；Eugenol，江西匯通藥用香料油有限公司，純度>99%；吐溫-80，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 6周齡、未經(jīng)產(chǎn)的Wistar大鼠360只，體重200 g±20 g，隨機(jī)分為6組，每組60只，雌雄各半。飼養(yǎng)溫度為22±3 ℃[7]，相對(duì)濕度60%±10%，光暗周期12 h。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 將AEE設(shè)為低、中、高三個(gè)劑量組(劑量分別為31.1、124.5和498.0 mg/kg)，即L(AEE)、M(AEE)和H(AEE)。Eugenol組的給藥劑量為246.0 mg/kg，與H(AEE)組的劑量等摩爾。Aspirin給藥組的劑量為68.4 mg/kg，與M(AEE)組的劑量等摩爾。AEE和Aspirin研磨后過100目篩，按劑量比例將其加入到飼料中(福貝世亨生物醫(yī)藥(上海)有限公司成)飼喂大鼠。Eugenol與吐溫-80按1∶2質(zhì)量比配制成混懸液，以飲水方式給予大鼠。

親代大鼠飼喂10周后，雌雄比按1∶1進(jìn)行同籠交配。計(jì)算繁殖指數(shù)：受孕率(受孕率=懷孕大鼠數(shù)/交配雌性大鼠數(shù)×100%)、妊娠率(妊娠率=分娩有活體幼仔的大鼠數(shù)/懷孕大鼠數(shù)×100%)、出生活仔率(出生活仔率=出生時(shí)活的仔鼠數(shù)/出生時(shí)仔鼠總數(shù)×100%)、出生存活率(出生存活率=產(chǎn)后4 d仔鼠存活數(shù)/出生時(shí)活仔數(shù)×100%)、哺乳存活率(哺乳存活率=21 d斷乳時(shí)仔鼠存活數(shù)/出生4 d后仔鼠存活數(shù)×100%)、性別比(性別比=仔鼠成熟時(shí)雄鼠數(shù)/雌鼠數(shù))。

測(cè)定生產(chǎn)指標(biāo)：每窩產(chǎn)仔數(shù)，仔鼠出生后第0、4、7和21天的生長(zhǎng)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)解剖實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，測(cè)定親代和子代大鼠睪丸和附睪(或子宮和卵巢)的臟器系數(shù)[8-10]。

臟器系數(shù)=臟器重量/體重×1000

2 結(jié) 果2.1 臨床表現(xiàn) 除H(AEE)和Aspirin組大鼠的活動(dòng)和進(jìn)食略減，被毛疏松外，其余親代和F1代對(duì)照組大鼠在整個(gè)試驗(yàn)期間精神狀態(tài)良好，活動(dòng)正常，進(jìn)食、飲水和皮毛均無明顯的異常變化。

2.2 妊娠大鼠體重變化 與空白對(duì)照組比較，Eugenol組、M(AEE)組和L(AEE)組的孕鼠體重增長(zhǎng)無差別(P>0.05)；H(AEE)組和Aspirin組的孕鼠體重增長(zhǎng)緩慢，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見圖1。

與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01圖1 各劑量組妊娠大鼠體重增長(zhǎng)曲線

2.3 繁殖指數(shù) 如表1所示，Eugenol組大鼠的受孕率偏低，H(AEE)組大鼠的妊娠率、出生活仔率和出生存活率偏低，其中性別比例很異常，雄性仔鼠比例偏高。

表1 各劑量組大鼠的繁殖指標(biāo)

與空白對(duì)照組比較，*P<0.05, 差異顯著

2.4 生長(zhǎng)指標(biāo) 各劑量組的窩產(chǎn)仔數(shù)和死亡數(shù)如圖2所示。窩產(chǎn)仔數(shù)是大鼠分娩后第一天平均窩產(chǎn)仔鼠，可見H(AEE)組和Aspirin組大鼠的窩產(chǎn)仔鼠明顯偏低(P<0.05)。F1代哺乳期時(shí)體重生長(zhǎng)見圖3，與對(duì)照組對(duì)比，H(AEE)、M(AEE)和Aspirin組子代大鼠生長(zhǎng)緩慢，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。H(AEE)組子代體重增長(zhǎng)最為緩慢，但M(AEE)組子代生長(zhǎng)狀況明顯好于Aspirin組。

2.5 臟器系數(shù) F1代斷乳20 d后，親代大鼠用戊巴比妥鈉麻醉，心臟采血后脫臼處死，雌性大鼠分離子宮和卵巢，雄性大鼠分離睪丸和附睪，分別進(jìn)行稱重計(jì)算臟器指數(shù)，結(jié)果見表2。與空白對(duì)照組相比，H(AEE)組親代大鼠的附睪和睪丸的臟器系數(shù)偏高(P<0.05)。F1代斷乳后給空白飼料飼喂三個(gè)月后，Aspirin和Eugenol處理組大鼠的子代附睪的系數(shù)偏高(P<0.05)。

3 討論與小結(jié)

AEE的劑型研究還正在進(jìn)行當(dāng)中，本試驗(yàn)中將AEE作為原料藥直接添加到大鼠飼料中，通過飼喂的方式給予大鼠。各劑量組妊娠大鼠體重增長(zhǎng)與空白對(duì)照組比較，H(AEE)組和Aspirin組妊娠大鼠的體重增長(zhǎng)緩慢，與溶劑對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。這表明高劑量的AEE和Aspirin對(duì)胎鼠生長(zhǎng)發(fā)育有一定影響，這與AEE在體內(nèi)分解為水楊酸和丁香酚有關(guān)。與Aspirin組等摩爾的M(AEE)組與空白對(duì)照組相比差異不顯著，表明AEE對(duì)妊娠大鼠產(chǎn)生的毒性比Aspirin小。

與空白對(duì)照組比較，*P <0.05，**P <0.01圖2 各劑量組親代大鼠的每窩產(chǎn)仔數(shù)

與空白對(duì)照組比較，*P <0.05，**P <0.01圖3 各劑量組F1代大鼠哺乳期的體重增長(zhǎng)

表2 各劑量組親代和F1代大鼠的主要生殖臟器系數(shù)

與空白對(duì)照組比較，*P<0.05, 差異顯著

各受試藥物組大鼠的妊娠率、窩產(chǎn)數(shù)、出生活仔率、出生存活率、哺乳存活率、性別比、仔鼠的哺乳期生長(zhǎng)等指標(biāo)與空白對(duì)照組比較，結(jié)果得出：與溶劑對(duì)照組相比，H(AEE)組大鼠妊娠率、窩產(chǎn)數(shù)、出生活仔率、出生存活率、哺乳存活率和哺乳期仔鼠的體重增長(zhǎng)都偏低，而雄/雌性別比偏高，這表明當(dāng)AEE為498.0 mg/kg時(shí)，會(huì)對(duì)大鼠的生殖和發(fā)育產(chǎn)生影響，導(dǎo)致大鼠的繁殖能力和哺乳能力較弱。Eugenol的劑量為246.0 mg/kg時(shí)會(huì)降低大鼠的受孕率，說明Eugenol可能影響合子形成或著床[11]。M(AEE)組和L(AEE)組的繁殖指標(biāo)與空白對(duì)照組相比差異不明顯。

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)雌性大鼠子宮和卵巢，雄性大鼠睪丸和附睪的臟器指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，H(AEE)組親代大鼠的睪丸和附睪臟器系數(shù)偏高，與空白對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)，可見長(zhǎng)期接觸高劑量的AEE，會(huì)對(duì)大鼠的睪丸和附睪產(chǎn)生影響[12]。F1代大鼠飼喂空白飼料三個(gè)月后，對(duì)其睪丸、附睪、子宮和卵巢進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，只有Aspirin組和Eugenol組F1代大鼠的附睪的臟器指數(shù)偏高(P<0.05)，說明Aspirin和Eugenol可能會(huì)對(duì)子代雄性大鼠的生殖系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響，這需要進(jìn)一步探討。

以上分析結(jié)果表明，498.0 mg·kg-1·d-1劑量的AEE會(huì)造成大鼠繁殖指數(shù)異常，影響胚胎的發(fā)生及胎兒的發(fā)育，導(dǎo)致自然流產(chǎn)和胎兒發(fā)育遲緩。因此，在本實(shí)驗(yàn)的條件下，AEE對(duì)大鼠繁殖毒性的最大無損害作用劑量為31.1 mg·kg-1·d-1，對(duì)大鼠的最小有損害作用劑量為124.5 mg·kg-1·d-1，并且Aspirin繁殖毒性最大，AEE次之，Eugenol的繁殖毒性最小。此外Aspirin和Eugenol有可能影響后代的生殖系統(tǒng)。

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(編輯：李文平)

Reproductive Toxicity in Parental Generation of Aspirin Eugenol Ester on Rats

ZHAO Xiao-le, KONG Xiao-jun, YANG Ya-jun, LIU Xi-wang, LI Shi-hong, QIN Zhe, JIAO Zeng-hua, LI Jian-yong*
(KeyLabofNewAnimalDrugProject,GansuProvince;KeyLabofVeterinaryPharmaceuticalDevelopment,MinistryofAgriculture;LanzhouInstituteofHusbandryandPharmaceuticalSciencesofCAAS,Lanzhou730050,China)

The reproductive and developmental toxicity of aspirin eugenol ester (AEE) in rats were investigated. Parental generation were exposed to AEE at doses of 498.0、124.5 and 31.1 mg·kg-1·d-1and aspirin at dose of 68.4 mg·kg-1·d-1and eugenol at dose of 246.0 mg·kg-1·d-1for 10 weeks before breeding. The weights of main organs and breeding indexes were observed in P and first filial generation (F1). Results showed that the body weights of P and F1were decreased (P<0.05), and pregnancy rate, litter size, live birth index and viability index on day 4 in high AEE dose group were also lower than those of control group. In addition, high male proportion in sex ratio of F1was very abnormal. Pregnant rats and weaning index in aspirin group grew slowly (P<0.05). Compared to control group,testis and epididymis indexes of P rats in high dose AEE group were high (P<0.05), and epididymis indexes of F1rats in aspirin and eugenol groups were also high (P<0.05). Under the experimental condition, AEE had reproductive toxicity in rats. No observed adverse effect level was 31.1 mg·kg-1·d-1. Low observed adverse effect leve was 124.5 mg·kg-1·d-1.

aspirin eugenol ester；reproductive toxicity；developmental toxicity；reproductive indexes

2016-09-25

A

1002-1280 (2017) 02-0054-05

S859.81

國(guó)家自然基金項(xiàng)目(31572573)

趙曉樂，碩士研究生，從事藥物繁殖毒性研究。

李劍勇。E-mail： lijy1971@163.com