液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測豬肉、雞肉組織中維吉尼霉素M1殘留量的研究

岳秀英，孫吉，吳曉嵐，陸強，李然, 葛榮(四川省獸藥監(jiān)察所，成都 610041 )

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測豬肉、雞肉組織中維吉尼霉素M1殘留量的研究

岳秀英，孫吉，吳曉嵐，陸強，李然, 葛榮*
(四川省獸藥監(jiān)察所，成都 610041 )

為了建立可同時檢測豬肉、雞肉組織中維吉尼霉素M1藥物殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，樣品選用0.2%甲酸的乙腈/水(80∶20，V/V)溶液為提取液，經(jīng)Oasis PRiME HLB固相萃取小柱凈化，在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀上進行檢測。結(jié)果表明，維吉尼霉素M1在0.25～200 ng/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(R2)大于0.999。豬肉、雞肉組織中維吉尼霉素M1的檢測限為0.5 μg/kg，定量限為2.0 μg/kg。在2～200 μg/kg (2MRL)添加濃度水平上，回收率范圍為80% ～100%,批內(nèi)、批間RSD均小于8.0%。該方法具有簡便快捷、靈敏度高、定性準(zhǔn)確等特點。

豬肉；雞肉；維吉尼霉素M1；獸藥殘留；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

維吉尼霉素藥物又名弗吉尼亞霉素、肥大霉素，是維吉尼鏈霉素產(chǎn)生的一種環(huán)狀多肽類抗生素。維吉尼霉素殺菌作用機理是通過干擾細(xì)菌的核糖體，進而抑制其蛋白質(zhì)的合成[1]，因此常用于豬、雞等畜禽疾病的預(yù)防和治療[2-3],尤其對雞的產(chǎn)蛋性能有所提高[4-5]。但維吉尼霉素可能降低某些藥物的藥效，例如普那霉素，用于對耐萬古霉素屎腸球菌(VREF)引起危及生命的嚴(yán)重感染的治療，以及由甲氧西林敏感葡萄球菌(MSSA)和化膿性鏈球菌引起的復(fù)雜性皮膚和皮膚軟組織感染的治療[6]。歐盟從1999年開始禁止包括維吉尼霉素在內(nèi)的抗生素作為飼料添加劑[7]。日本、美國和中國等也均對動物性食品中的殘留限量作出嚴(yán)格的限定。日本規(guī)定牛奶和雞蛋中維吉尼霉素的最高殘留量為100 μg/kg[8]。我國農(nóng)業(yè)部第235號公告[9]中規(guī)定維吉尼霉素在畜禽組織最高殘留限量為：肌肉100 μg/kg、肝臟300 μg/kg、腎臟400 ～500 μg/kg。

由于維吉尼霉素是主要由M1和S1組分組成[10]，M1組分約占維吉尼霉素總量的70%，因而檢測目標(biāo)多以維吉尼霉素M1為主[11]。目前，國內(nèi)外對維吉尼霉素的檢測方法的前處理方法都是采取傳統(tǒng)的凈化方法，而本文采用混合溶劑提取，新型的反相保留固相萃取小柱凈化，節(jié)省了樣品前處理時間。本研究旨在建立一種操作步驟簡單、靈敏度高、準(zhǔn)確性強的動物產(chǎn)品中維吉尼霉素M1的殘留分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent 1290-6460液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，Agilent公司；TB-215D電子天平，賽多利斯科儀器公司；Sigma 3K30高速冷凍離心機，Thermo公司；MS3渦旋混合器，IKA公司；Oasis PRiME HLB(3cc，60 mg)固相萃取小柱，Waters公司。

1.2 藥品和試劑 維吉尼霉素M1，純度95%，TRC公司；甲醇、乙腈為色譜純，美國Fisher公司；甲酸銨為分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司；所用水為超純水，Millipore超純水儀制備。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取維吉尼霉素M110 mg，用甲醇溶解制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。量取標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用甲醇稀釋成10 ug/mg標(biāo)準(zhǔn)工作液，再用0.01 mol/L甲酸銨溶液稀釋成0.25～200 ng/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 測定方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：C18柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量2.5 μL；流動相：A相為甲醇/乙腈溶液(50∶50，V/V)，B相為0.003 mol/L甲酸銨緩沖液，等度洗脫，A∶B(50∶50，V/V)。

1.4.2 質(zhì)譜條件 離子源：ESI+；檢測方式：MRM；電離電壓3.5 KV；源溫125 ℃；霧化溫度350 ℃；錐孔氣流速10 L/min；霧化氣流速5 L/min。定性、定量離子對及碎裂電壓見表1。

表1 維吉尼霉素M1的質(zhì)譜參數(shù)

1.4.3 樣品的提取 稱取試樣(2.5±0.01)g，置于50 mL離心管中，加入10 mL 0.2%甲酸乙腈/水溶液(80∶20，v/v)渦旋30 s，高速振蕩30 min，12000 r/min離心5 min,取上清液備用。

1.4.4 樣品的凈化 取5.0 mL備用樣液過固相萃取柱，收集全部濾過液，取4.0 mL濾過液40 ℃下氮吹至小于0.5 mL，用流動相定容到1.0 mL，渦動混勻，0.22 μm濾膜過濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確配制0.25、0.5、2、10、50、100、200 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，依次從低濃度到高濃度按液相色譜串聯(lián)條件進行分析，每一濃度進樣三次，按其所得三次峰面積的平均值與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.4.6 方法靈敏度 確定將適量維吉尼霉素M1標(biāo)準(zhǔn)工作液加入到空白試樣，經(jīng)上述方法進行前處理后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測，觀察藥物征離子質(zhì)量色譜峰信噪比(S/N)和對應(yīng)藥物濃度，S/N>3者定其為方法的檢測限；S/N>10者定其為方法的定量限。

1.4.7 準(zhǔn)確度和精密度的測定 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白樣品中添加2、10、100、200 μg/kg四個不同濃度藥物進行回收率試驗，各濃度進行5個樣品平行試樣，重復(fù)3次，求批內(nèi)、批間RSD。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 按照上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度進行線性回歸，得到的回歸方程及變異系數(shù)見表2。

表2 維吉尼霉素M1線性回歸情況

從表2中可以看出維吉尼霉素M1在0.25～200 ng/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R2>0.999。

2.2 方法的靈敏度 按照上述方法進行處理添加濃度為2.0 μg/kg時，測得維吉尼霉素M1的S/N>10，說明方法的定量限為2.0 μg/kg。當(dāng)添加濃度為0.5 μg/kg時，測得維吉尼霉素M1的S/N>3，說明方法的檢測限為0.5 μg/kg。10μg/kg添加豬肉組織樣品中維吉尼霉素M1特征離子質(zhì)量圖譜見圖1。

圖1 10 μg/kg添加豬肉組織樣品中維吉尼霉素M1特征離子質(zhì)量色譜圖

2.3 方法的精確度 在空白試樣中添加2、10、100、200 μg/kg四個不同濃度的維吉尼霉素M1進行回收試驗，結(jié)果匯總見表3?？梢钥闯鲐i肉、雞肉組織中維吉尼霉素M1平均回收率為80%～100%，批內(nèi)RSD小于7.5%，批間RSD小于7.9%。

表3 維吉尼霉素M1添加回收率試驗結(jié)果(n=5)

3 討論與小結(jié)

3.1 提取溶劑的選擇 根據(jù)維吉尼霉素不溶于非極性溶劑的特點[12]，現(xiàn)有方法多使用甲醇、乙腈等極性有機溶劑對維吉尼霉素M1藥物進行萃取。魏計云等[13]通過對乙腈、乙酸乙酯、乙酸乙酯-0.2 mol/L磷酸二氫銨3種提取溶劑的提取效果進行對比，發(fā)現(xiàn)采用混合溶劑的提取效果較好。國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20765-2006《豬肝臟、腎臟、肌肉組織中維吉尼霉素M1殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[14]中規(guī)定樣品用甲醇-乙腈溶液提取，磷酸二氫銨緩沖液對提取液稀釋。林維宜等[15]對比了甲醇-0.1%甲酸溶液和甲醇-磷酸二氫銨溶液的提取效果，發(fā)現(xiàn)磷酸鹽會對維吉尼霉素等多肽類抗生素的質(zhì)譜檢測產(chǎn)生干擾，降低回收率。本實驗為提高維吉尼霉素M1的提取效率，對國家標(biāo)準(zhǔn)方法中使用的提取溶劑進行優(yōu)化，選擇了0.2%甲酸-乙腈/水溶液作為樣品提取液。

3.2 固相萃取柱的選擇 現(xiàn)有方法多使用C18固相萃取小柱對樣品提取液進行凈化，但C18固相萃取柱的填料主要以硅膠為基質(zhì)，同時在其表面鍵合非極性的十八烷基官能團，僅對脂肪的凈化程度較好，不能凈化磷脂；并且C18固相萃取柱填料硅膠基質(zhì)在抽干時會產(chǎn)生疏水塌陷，對目標(biāo)化合物的保留降低，二者皆會對試驗結(jié)果造成影響。因此本試驗選擇了Oasis PRiME HLB反相保留固相萃取小柱，該小柱彌補了C18固相萃取柱不足之處。同時該小柱在凈化樣品提取液之前不用活化平衡，僅需樣液直接過柱就可實現(xiàn)目標(biāo)物的保留、清洗和洗脫，并且樣品凈化程度更高，去除了蛋白、鹽和磷脂等95%以上的基質(zhì)干擾物。這種新型小柱的使用減少了對前處理中樣品的洗滌次數(shù)，對維吉尼霉素M1殘留量造成的損失很小，提高了方法的回收率，同時也縮短了樣品的前處理時間。

試驗簡化了豬肉、雞肉組織中維吉尼霉素M1殘留的檢測方法的前處理步驟，較大程度提高了檢測工作效率。通過對方法的線性關(guān)系、靈敏度、回收率和精密度等技術(shù)參數(shù)的考察，發(fā)現(xiàn)結(jié)果均能滿足殘留檢測方法的要求。該方法具有快速簡便、靈敏度高、抗干擾強等特點，為豬肉、雞肉組織中維吉尼霉素M1殘留檢測提供了一個針對性強和更加簡便快捷的方法，可作為常規(guī)方法進行日常批量分析檢測。

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(編輯：陳希)

Determination of Virginamycin M1Resedues in Pork and Chicken by LC-MS/MS

YUE Xiu-ying，SUN Ji，WU Xiao-lan，LU Qiang，LI Ran,GE Rong*
(SichuanInstituteofVeterinaryDrugControl，Chengdu610041,China)

A LC-MS/MS method was established for the determination of virginamycin M1resedues in pork and chicken .The samples were extracted by 0.2%formate of acetonitrile-water solution (80∶20，V/V),then purified and concentrated on an Oasis PRiME HLB cartridge ,and then determined by LC-MS/MS.The results showed the good linearity in the rage of 0.25～200 ng/mL with correlation coefficients(R2) above 0.999,The limit of detection of the method was 0.5 μg/kg,and the limit of quantification was 2.0 μg/kg,The average recoveries at 2～200 μg/kg (2MRL) were 80%～100%,and intra-and inter-batchRSDwere﹤8.0%.The method is simple,rapid,sensitive and accurate.

pork；chicken；virginamycin M1；veterinary residue；LC-MS/MS

岳秀英，博士，高級獸醫(yī)師，從事獸藥殘留分析方面研究。

葛榮。E-mail：sunji_0@163.com

2016-08-04

A

1002-1280 (2017) 02-0040-04

S859.84