高效液相色譜-熒光法測(cè)定牛羊組織中阿苯達(dá)唑及其代謝物的殘留量

吳寧鵬，彭麗，孟蕾，陳彥龍，馬浩軒(．河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450008； ．鄭州大學(xué)，鄭州 450000； ．河南省鄭州市第七高級(jí)中學(xué)，鄭州 450008)

高效液相色譜-熒光法測(cè)定牛羊組織中阿苯達(dá)唑及其代謝物的殘留量

吳寧鵬1，彭麗1，孟蕾1，陳彥龍2，馬浩軒3
(1．河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450008； 2．鄭州大學(xué)，鄭州 450000； 3．河南省鄭州市第七高級(jí)中學(xué)，鄭州 450008)

建立了同時(shí)測(cè)定牛羊組織中阿苯達(dá)唑及其代謝物的高效液相色譜-熒光檢測(cè)方法。試樣中待測(cè)物經(jīng)乙酸乙酯提取，酸性氧化鋁固相萃取柱和MCX固相萃取柱凈化，高效液相色譜-熒光法測(cè)定，以外標(biāo)法定量。藥物在5～2000 μg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。方法的檢出限為0.025 mg/kg，定量限為0.05 mg/kg，在不同組織中添加濃度范圍為0.05～10 mg/kg，其平均回收率為60.6%～119.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.7%～19.1%之間。方法抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度高，適用于牛羊組織中阿苯達(dá)唑及其代謝物殘留量的測(cè)定。

牛羊組織；阿苯達(dá)唑及其代謝物；高效液相色譜-熒光法

阿苯達(dá)唑(ABZ)是一種苯并咪唑類驅(qū)蟲(chóng)藥物，是抗蟲(chóng)性最強(qiáng)的驅(qū)蟲(chóng)藥物之一。廣泛用于動(dòng)物的腸道寄生蟲(chóng)感染病，在我國(guó)獸醫(yī)臨床使用最廣泛[1]。阿苯達(dá)唑在動(dòng)物體內(nèi)不穩(wěn)定，動(dòng)物口服攝入后，經(jīng)腸道消化后會(huì)在較短時(shí)間內(nèi)代謝為阿苯達(dá)唑亞砜(ABZSO)、阿苯達(dá)唑砜(ABZSO2)、阿苯達(dá)唑-2-氨基砜(ABZ-2NH2-SO2)[2]。動(dòng)物毒理學(xué)表明阿苯達(dá)唑及其活性代謝物阿苯達(dá)唑亞砜具有致畸及胚胎毒性作用[3]。

由于一些養(yǎng)殖戶為追求經(jīng)濟(jì)利益，違規(guī)使用而且長(zhǎng)期、超量使用，從而使阿苯達(dá)唑及其代謝藥物在動(dòng)物組織中殘留，因此，世界食品法典委員會(huì)和世界各國(guó)對(duì)動(dòng)物源性食品中阿苯達(dá)唑藥物殘留均有嚴(yán)格的限量要求，國(guó)際貿(mào)易中也對(duì)其限量有嚴(yán)格規(guī)定[4]。我國(guó)規(guī)定在牛、豬、羊、雞等動(dòng)物的肌肉、脂肪、肝、腎等食品中阿苯達(dá)唑及其代謝藥物最高殘留限為0.05～1.0 mg/kg[5]。國(guó)內(nèi)外對(duì)阿苯達(dá)唑及其代謝物檢測(cè)分析方法報(bào)道較多，主要包括免疫檢測(cè)法(ELISA)[6]、高效液相色譜法(HPLC)[2,7-10]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[11-12]和氣相質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS/MS)[13]等。其中，HPLC-FLD法因具有檢測(cè)成本低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于阿苯達(dá)唑及其代謝物的檢測(cè)。目前牛羊組織中阿苯達(dá)唑及其代謝藥物殘留的檢測(cè)方法中，存在空白干擾嚴(yán)重、靈敏度低、適應(yīng)性差等問(wèn)題，因此，本文對(duì)牛羊組織中阿苯達(dá)唑及其代謝物藥物殘留的樣品前處理法進(jìn)行了改進(jìn)，減小基質(zhì)干擾，從而提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度，從源頭上保障食品安全。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀配熒光檢測(cè)器(Waters公司)；XP205分析天平(瑞士Mettler Toledo 公司)；N-EVAP-112氮吹儀(美國(guó)Organomation)；SIGMA 3-30K離心機(jī)(德國(guó)SIGMA公司)； MS3 basic渦旋混合器(IKA)。阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑亞砜，含量均大于98.3%，購(gòu)于Dr. Ehrenstorfer公司，阿苯達(dá)唑氨基砜對(duì)照品，購(gòu)于德國(guó)WITEGA；Waters Oasis MCX 固相萃取柱(6mL/150 mg)；Supelco酸性氧化鋁固相萃取柱(3 mL/1 g)。甲醇、乙腈、乙酸銨(色譜純)；二甲基亞砜(DMSO)、碳酸鈉、焦亞硫酸鈉、乙酸乙酯、正己烷、鹽酸、乙二胺四乙酸二鈉、氨水、冰醋酸(分析純)；實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng)制備的去離子水。

0.5 mol/L乙酸銨溶液：取1.927 g乙酸銨，用水溶解并稀釋至500 mL，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至5.0。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑亞砜和阿苯達(dá)唑氨基砜標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，分別于100 mL容量瓶中，用乙腈:二甲基亞砜(9:1)溶解并定容，配制成濃度為0.1 mg/mL的阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑亞砜和阿苯達(dá)唑氨基砜標(biāo)準(zhǔn)貯備液，-20 ℃以下保存，有效期1個(gè)月。

1.3 樣品前處理 稱取試樣(2±0.02)g于50 mL離心管中，加2%的碳酸鈉溶液0.5 mL， DMSO 1 mL和0.004 g/mL焦亞硫酸鈉溶液溶液1 mL，渦旋1 min，加入乙酸乙酯10 mL，渦旋1 min，振蕩5 min， 10000 r/min離心5 min，取上清液。殘?jiān)偌尤胍宜嵋阴?0 mL，渦旋1 min，振蕩5 min， 10000 r/min離心5 min，取上清液。合并兩次上清液，40 ℃氮吹至近干，用正己烷5 mL復(fù)溶，加入乙腈∶0.2 mol/L鹽酸(V∶V/9∶1)2 mL溶液，渦旋1 min，靜置分層，棄去上層正己烷，余液作為備用液1。

酸性Al2O3固相萃取柱依次用乙腈∶0.2 mol/L鹽酸(V∶V/9∶1)溶液3 mL、1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液3 mL活化，取備用液1過(guò)柱，收集流出液，用乙腈∶0.2 mol/L鹽酸(V∶V/9∶1)1 mL溶液淋洗，合并流出液，加0.2 mol/L鹽酸溶液8 mL，混勻作為備用液2。MCX柱依次用甲醇3 mL、1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液3 mL、水3 mL、0.2 mol/L鹽酸溶液3 mL活化，取備用液2過(guò)柱，待全部液體流出后，依次用0.2 mol/L鹽酸溶液3 mL、甲醇3 mL淋洗，抽干1 min，10%氨化乙腈溶液5 mL洗脫，收集洗脫液，于40 ℃水浴氮?dú)獯蹈?。用乙腈∶甲醇?.5 mol/L乙酸銨溶液(V∶V∶V/2∶2∶8)1 mL溶解殘余物，過(guò)0.22 μm濾膜后供高效液相色譜測(cè)定(上機(jī)溶液應(yīng)在72 h內(nèi)完成測(cè)定)。

1.4 液相色譜參考條件 色譜柱：Waters Xbridge C18 (4.6×150 mm, 5 μm)；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相A為乙腈，B為甲醇,C為0.5 mol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。激發(fā)波長(zhǎng)290 nm,發(fā)射波長(zhǎng)330 nm。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍 準(zhǔn)確移取阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑亞砜和阿苯達(dá)唑氨基砜標(biāo)準(zhǔn)溶液液適量，用乙腈∶甲醇∶0.5 mol/L乙酸銨(V∶V∶V/2∶2∶8)溶液稀釋，配置成一系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，從低濃度到高濃度依次進(jìn)樣，以色譜峰平均峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各藥物的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。

表2 藥物回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.2 方法的靈敏度 添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于2 g空白樣品中，經(jīng)提取后測(cè)定，依據(jù)信噪比S/N>3(按PtP算)，確定阿苯達(dá)唑及其代謝藥物的檢出限均為0.025 mg/kg。依據(jù)信噪比S/N>10(按PtP算)，確定阿苯達(dá)唑及其代謝藥物的定量限均為0.05 mg/kg。2.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度考察 本方法考察了在牛肉、牛肝、羊肉、羊肝中的添加回收情況。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，在空白樣品中添加0.05、2.5、5、10 mg/kg 4個(gè)不同濃度的阿苯達(dá)唑及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)，各濃度進(jìn)行5個(gè)樣品平行試驗(yàn)，重復(fù)3次，求相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 牛、羊組織中阿苯達(dá)唑及代謝物回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

從表中可以看出，本方法在空白牛羊組織中進(jìn)行0.05～10 mg/kg的添加，平均回收率在60.6%～119.1%之間，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.7%～19.1%之間。說(shuō)明該方法有較好的準(zhǔn)確度與精密度。阿苯達(dá)唑及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白及添加色譜圖分別見(jiàn)圖1～圖3。

3 討論與小結(jié)

3.1 儀器條件 阿苯達(dá)唑及其代謝物屬于苯并咪唑類物質(zhì)，既有紫外吸收又有熒光吸收。因此，按照參考文獻(xiàn)方法分別選用紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器作為阿苯達(dá)唑及其代謝物的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明選用熒光檢測(cè)器對(duì)動(dòng)物組織樣品測(cè)定時(shí)，雜質(zhì)干擾小，準(zhǔn)確度高。因此，選擇熒光檢測(cè)器作為動(dòng)物組織中阿苯達(dá)唑及其代謝物的檢測(cè)器。

阿苯達(dá)唑類藥物殘留檢測(cè)常用的流動(dòng)相體系有甲酸-乙腈和乙酸銨-乙腈-甲醇等流動(dòng)相體系，試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)兩種流動(dòng)性體系進(jìn)行了比較，最終確定了用0.05 mol/L乙酸銨-乙腈-甲醇(80∶10∶10)作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0 mL/min，能夠很好的控制阿苯達(dá)唑氨基砜、阿苯達(dá)唑亞砜、阿苯達(dá)唑砜和阿苯達(dá)唑的保留時(shí)間，避免了出峰較早易受到雜質(zhì)峰干擾，也克服了保留時(shí)間較長(zhǎng)而導(dǎo)致色譜峰展寬。

圖1 阿苯達(dá)唑及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(100 μg/L)

圖2 羊肝組織空白試樣色譜圖

圖3 羊肝組織空白添加阿苯達(dá)唑及其代謝物色譜圖(0.05 mg/kg)

3.2 提取條件 本方法參考了相關(guān)文獻(xiàn)和檢測(cè)方法，提取液分別用乙腈、乙酸乙酯和乙腈+乙酸乙酯(V∶V/3∶1)為提溶劑進(jìn)行5次平行提取實(shí)驗(yàn)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，對(duì)于四種藥物的提取效率為乙酸乙酯>乙腈+乙酸乙酯>乙腈，同時(shí)用乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí)雜質(zhì)干擾明顯低于乙腈。因此，選用乙酸乙酯為動(dòng)物組織中阿苯達(dá)唑及其代謝物的提取溶劑。由于阿苯達(dá)唑及其代謝物具有弱堿性，在不同的鹽溶液和pH 條件下電離度不同，所以參考了國(guó)內(nèi)外一些文獻(xiàn)在乙酸乙酯提取溶液中加入5% NaOH、10% Na2SO4和2%Na2CO3，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取溶劑中加入0.5 mL 2%Na2CO3使提取液呈弱堿性，在該條件下阿苯達(dá)唑及其三種代謝物均有較高的回收率。為了減小基質(zhì)對(duì)阿苯達(dá)唑及其代謝藥物檢測(cè)的干擾，在提取時(shí)加入1 mL抗氧化劑Na2S2O5(4 mg/mL)。

3.3 凈化方法 參照文獻(xiàn)的凈化方法，先后比較了Sep-Pak C18(6 mL 150 mg)、Oasis MCX(6 mL 150 mg)、Oasis HLB(6 mL 150 mg)、ProElut SCX(6 mL 150 mg)固相萃取柱，結(jié)果表明MCX回收率最高。但由于樣品基質(zhì)比較復(fù)雜，僅過(guò)MCX柱凈化，雜質(zhì)干擾嚴(yán)重，尤其組織樣品中極性化合物和陰離子化合物會(huì)影響動(dòng)物組織中痕量的阿苯達(dá)唑及其代謝物的檢出。因此，最終選用酸性Al2O3和MCX固相萃取柱作為凈化柱。

該方法具有較好的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，適用于牛羊組織中阿苯達(dá)唑及其代謝物殘留量的測(cè)定。

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(編輯：侯向輝)

Determination of Albendazole and Its Main Metabolites Residues in Cattle and Ovine Tissues by HPLC-FLD

WU Ning-peng1，PENG Li1，MENG Lei1，CHEN Yan-long2，MA Hao-xuan3(1.HenanInstituteofVeterinaryDrugandFeedsControl,Zhengzhou450008，China;2．ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450000，China;3．HenanProvinceZhengzhouNo.7MiddleSchool,Zhengzhou450008，China)

A method based on high performance liquid chromatography with fluorescence detector (HPLC-FLD) has been developed for the determination of albendazole and its main metabolites residues in cattle and ovine tissues. The analytes were extracted with ethyl acetate, and cleaned by Alumina-A and MCX solid phase extraction cartridges. Quantification of the analytes were achieved by HPLC-FLD using external standard method. The calibration curves of the drugs were linear in the concentration ranges of 5～2000 μg/L with correlation coefficients more than 0.999. Detection limits and quantification limits of the method for the analytes were 0.025 mg/kg and 0.05 mg/kg in cattle and ovine tissues. The average recoveries ranged from 60.6% to 119.1% at the spiked level of 0.05～10 mg/kg in tissues. The relative standard deviation was in the range of 1.7%～19.1%. With the advantages of good anti-interference ability and sensitivity, the method adapts to the determination of albendazole and its main metabolites residues in cattle and ovine tissues.

cattle and ovine tissues; albendazole and its main metabolites；HPLC-FLD

2016-10-10

A

1002-1280 (2017) 02-0035-05

S859.84

2016年國(guó)家畜禽產(chǎn)品未知危害因子識(shí)別與已知危害因子安全性評(píng)估項(xiàng)目(GJFP2016007)

吳寧鵬，高級(jí)獸醫(yī)師，從事獸藥質(zhì)量監(jiān)測(cè)與監(jiān)督研究。E-mail:wnppeking2002@163.com