四味穿心蓮超微粉的薄層鑒別研究

王林，陳獻(xiàn)忠，馬霞，王文佳，張國祖*(.河南省康星生物科技有限公司，河南焦作，454950；.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院，河南鄭州4500)

四味穿心蓮超微粉的薄層鑒別研究

王林1，陳獻(xiàn)忠1，馬霞2，王文佳2，張國祖2*
(1.河南省康星生物科技有限公司，河南焦作，454950；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院，河南鄭州450011)

為控制四味穿心蓮超微粉的質(zhì)量，分別對其所含的四味藥材進行薄層鑒別研究。通過穿心蓮對照藥材、穿心蓮內(nèi)脂和脫水穿心蓮內(nèi)脂的鑒別對穿心蓮進行質(zhì)量控制；通過靛玉紅的鑒別對大青葉進行質(zhì)量控制；通過蘆丁的鑒別對葫蘆茶進行質(zhì)量控制；通過槲皮素的鑒別對辣蓼和葫蘆茶進行質(zhì)量控制。試驗篩選并優(yōu)化了相關(guān)提取方法和色譜條件，并分別制備對應(yīng)的陰性樣品溶液進行對比。結(jié)果表明，四種薄層鑒別方法均無陰性干擾，且簡單、穩(wěn)定，可以有效控制四味穿心蓮超微粉的質(zhì)量。

四味穿心蓮超微粉；穿心蓮；靛玉紅；蘆??；槲皮素

四味穿心蓮散是獸醫(yī)臨床常用的的經(jīng)典配方，現(xiàn)收載于2010版《獸藥典》二部。該藥由穿心蓮、大青葉、辣蓼和葫蘆茶4味藥材組成，有清熱解毒、除濕化滯之功效。在臨床上廣泛用于畜禽瀉痢，積滯等疾病，治療效果較好[1]。

中藥超微粉是利用超微粉碎技術(shù)得到的中藥超細(xì)粉末，中藥的顆粒細(xì)度達(dá)到48 μm以下，細(xì)胞破壁率達(dá)到85%以上。其優(yōu)勢在于增加有效成分溶出率，提高生物利用度，減少用藥量等。四味穿心蓮超微粉綜合了四味穿心蓮散和超微粉的優(yōu)勢，使四味穿心蓮散藥理作用得到最大發(fā)揮，不僅明顯降低用藥成本，且無污染、無殘留，在獸醫(yī)臨床應(yīng)用潛力巨大[2-3]。

目前,四味穿心蓮散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有顯微鑒別和穿心蓮的薄層鑒別，很難完全控制藥物的質(zhì)量。此外，有關(guān)辣蓼和葫蘆茶的薄層鑒別研究多見于單藥材，鮮有復(fù)方制劑或超微粉制劑的相關(guān)研究[4-5]。因此，本試驗研究了四味穿心蓮超微粉中穿心蓮、大青葉、辣蓼和葫蘆茶的薄層鑒別方法，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

AUW220D1電子天平，島津國際貿(mào)易有限公司；GZX-9030 MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；JCX-400GZ超聲波清洗器，山東省濟寧市超聲電子儀器廠。

四味穿心蓮散，批號15060201，河南省康星藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；四味穿心蓮超微粉，批號分別為15061501、15051801、15070401，實驗室自制，用超微粉碎技術(shù)將四味穿心蓮散粉碎到至少95%顆粒，在48 μm以下；穿心蓮對照藥材，批號121082-201004，中國藥品生物制品檢定所；穿心蓮內(nèi)酯對照品，批號110797-200307，中國藥品生物制品檢定所；脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品，批號110854-201007，中國藥品生物制品檢定所；靛玉紅對照品，含量99.9%，批號110713-200911，中國藥品生物制品檢定所；蘆丁對照品，含量91.9%，批號100080-201409，中國食品藥品檢定研究院；槲皮素，批號100081-201509，含量98.6%，中國食品藥品檢定研究院。水為去離子透析水(Minipore 純水器)；乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷，環(huán)己烷，甲醇等為分析純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；硅膠G薄層板及硅膠GF254薄層板，青島海洋化工廠生產(chǎn)。

2 方法

2.1 穿心蓮的薄層鑒別 該鑒別方法源自《獸藥典》所載的四味穿心蓮散鑒別(2)的方法[1]，以穿心蓮為對照藥材，以穿心蓮內(nèi)脂和脫水穿心蓮內(nèi)脂為對照品進行質(zhì)量控制。將普通散劑的鑒別方法應(yīng)用于超微粉劑型，并對對照品濃度和樣品點樣量進行了優(yōu)化，具體過程如下。

2.1.1 供試品溶液的制備 取四味穿心蓮超微粉1 g，置具塞錐形瓶中，加乙醇5 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液作為供試品溶液。

2.1.2 對照藥材溶液的制備 取穿心蓮對照藥材0.5 g，照2.1.1處理方法制成對照藥材溶液。

2.1.3 對照品溶液的制備 取穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)脂對照品各10 mg，置10 mL量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，制成每l mL各含l mg的混合溶液，作為對照品溶液。

2.1.4 陰性樣品溶液的制備 按照四味穿心蓮超微粉處方制備不含穿心蓮的陰性樣品，稱取1 g，按2.1.1項下處理方法處理，制成不含穿心蓮的陰性樣品溶液。

2.1.5 薄層色譜試驗 吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(4∶3∶0.4)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視，觀察供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，是否有相同顏色的斑點。

2.2 靛玉紅的薄層鑒別 靛玉紅是大青葉中所含的重要成分，本方法通過靛玉紅的鑒別來控制大青葉的質(zhì)量。該方法是在2010版《獸藥典》所載的大青葉鑒別(2)的方法優(yōu)化而來，將單味藥的薄層鑒別用于復(fù)方的鑒別中。樣品的稱樣量、提取試劑添加量均通過單味藥材的量進行折算，并對不同對照品濃度和不同展開劑進行對比，篩選出最優(yōu)的薄層鑒別方法，具體如下。

2.2.1 供試品溶液的制備 取四味穿心蓮超微粉3 g，置具塞錐形瓶中，加三氯甲烷40 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。2.2.2 對照品溶液的制備 取靛玉紅對照品2.5 mg，置10 mL量瓶中，加三氯甲烷至刻度，搖勻，制成每1 mL含0.25 mg的溶液，作為對照品溶液。2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按照四味穿心蓮超微粉處方制備不含大青葉的陰性樣品，稱取3 g，按2.2.1處理方法處理，制成不含大青葉的陰性樣品溶液。

2.2.4 薄層色譜試驗 吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以苯-三氯甲烷-丙酮(5∶4∶2)為展開劑，展開，取出，晾干。觀察供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，是否有相同的淺紫紅色斑點。

2.3 蘆丁的薄層鑒別 關(guān)于蘆丁的薄層鑒別方法較多，含蘆丁成分的單藥和復(fù)方均有文獻(xiàn)報道[6-7]。本文查閱大量文獻(xiàn)，通過稱樣量、點樣量的比較，并嘗試了文獻(xiàn)中不同展開劑和顯色劑，篩選出最為合理的各種條件，建立了四味穿心蓮超微粉中蘆丁的薄層鑒別方法，具體內(nèi)容如下。

2.3.1 供試品溶液的制備 取四味穿心蓮超微粉3 g，置具塞錐形瓶中，加乙醇30 mL，溫浸1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇0.5 mL使溶解，作為供試品溶液。

2.3.2 辣蓼和葫蘆茶樣品溶液的制備 稱取辣蓼和葫蘆茶各0.6 g，分別按2.3.1處理方法處理，得到辣蓼和葫蘆茶單味藥材的樣品溶液。

2.3.3 對照品溶液的制備 取蘆丁對照品5 mg，置10 mL量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。2.3.4 陰性樣品溶液的制備 按照四味穿心蓮超微粉處方制備不含葫蘆茶的陰性樣品，稱取3 g，按2.3.1處理方法處理，制成不含葫蘆茶的陰性樣品溶液。

2.3.5 薄層色譜試驗 吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。置紫外光燈(365 nm)下檢視，觀察供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，是否有相同顏色的熒光斑點。

2.4 槲皮素的薄層鑒別 關(guān)于槲皮素的薄層鑒別方法較多，但都集中于含槲皮素的單味藥材，含槲皮素的復(fù)方藥的薄層鑒別方法報道較少[8-9]。本試驗通過文獻(xiàn)報道的各種槲皮素提取方法的對比，嘗試不同的展開劑和顯色劑，篩選出最為合理的各種條件，建立了四味穿心蓮超微粉中槲皮素的薄層鑒別方法，具體內(nèi)容如下。

2.4.1 供試品溶液的制備 取四味穿心蓮超微粉5 g，加80%甲醇80 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，用乙醚振搖提取2次，每次10 mL，棄去乙醚液，水液加稀鹽酸10 mL，置水浴中加熱1 h，取出，迅速冷卻，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，用水30 mL洗滌，棄去水液，乙酸乙酯液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。

2.4.2 辣蓼和葫蘆茶樣品溶液的制備 稱取辣蓼和葫蘆茶各1 g，分別按2.4.1處理方法處理，得到辣蓼和葫蘆茶單味藥材的樣品溶液。

2.4.3 對照品溶液的制備 取槲皮素對照品2.5 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.4.4 陰性樣品溶液的制備 按照四味穿心蓮超微粉處方制備不含辣蓼和葫蘆茶的陰性樣品，稱取5 g，按2.4.1處理方法處理，制成不含辣蓼和葫蘆茶的陰性樣品溶液。2.4.5 薄層色譜試驗 吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10∶8∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，在105 ℃加熱數(shù)分鐘，置紫外光燈(365 nm)下檢視。觀察供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，是否顯相同顏色的熒光斑點。

3 結(jié)果與分析

3.1 穿心蓮的薄層鑒別 穿心蓮的薄層鑒別結(jié)果見圖1，在紫外254 nm光源下檢視，在對照品和對照藥材位置，供試品溶液出現(xiàn)了相同顏色的斑點，陰性樣品溶液沒有出現(xiàn)對應(yīng)斑點，說明該方法無陰性干擾，可以有效鑒別四味穿心蓮超微粉中的穿心蓮。

1.穿心蓮內(nèi)脂和脫水穿心蓮內(nèi)脂對照品；2.不含穿心蓮的陰性；3.穿心蓮對照藥材；4.15061501；5.15051801圖1 穿心蓮薄層鑒別結(jié)果

3.2 靛玉紅的薄層鑒別 靛玉紅的薄層鑒別結(jié)果見圖2，在白光下檢視，在靛玉紅對照品位置，供試品溶液出現(xiàn)了相同的淺紫紅色斑點，陰性樣品溶液沒有出現(xiàn)對應(yīng)斑點，說明該方法無陰性干擾，可以有效鑒別四味穿心蓮超微粉中的大青葉所含的靛玉紅成分。

1.靛玉紅對照品；2.不含大青葉的陰性；3.15061501；4.15051801；5.15070401圖2 靛玉紅薄層鑒別結(jié)果

3.3 蘆丁的薄層鑒別 蘆丁的薄層鑒別結(jié)果見圖3，在紫外365 nm光源下檢視，在對照品位置，葫蘆茶和供試品溶液出現(xiàn)了相同顏色的熒光斑點，而辣蓼和陰性樣品溶液沒有出現(xiàn)對應(yīng)斑點，說明葫蘆茶含有蘆丁成分，辣蓼中蘆丁太少或者不含蘆丁。陰性樣品沒有干擾，可以有效鑒別四味穿心蓮超微粉中葫蘆茶所含的蘆丁成分。

3.4 槲皮素的薄層鑒別 槲皮素的薄層鑒別結(jié)果見圖4，在紫外365 nm光源下檢視，在對照品位置，供試品溶液出現(xiàn)了相同顏色的熒光斑點，陰性樣品溶液沒有出現(xiàn)對應(yīng)斑點，說明該方法無陰性干擾，可以有效鑒別四味穿心蓮超微粉中的辣蓼和葫蘆茶所含的槲皮素成分。

1.蘆丁對照品；2.葫蘆茶；3.辣蓼；4.15061501；5.不含葫蘆茶的陰性圖3 蘆丁薄層鑒別結(jié)果

1.槲皮素對照品；2.葫蘆茶；3.辣蓼；4.15061501；5-6.不含辣蓼和葫蘆茶的陰性圖4 槲皮素薄層鑒別結(jié)果

4 討論與小結(jié)

靛玉紅的薄層鑒別中，最初選用的展開劑是獸藥典上大青葉鑒別(2)的展開劑正己烷-三氯甲烷-丙酮(5∶4∶2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此種展開劑條件下藥物色素和靛玉紅斑點重疊，出現(xiàn)了雜質(zhì)干擾。通過對比嘗試，最終發(fā)現(xiàn)苯替代正己烷之后，色素和靛玉紅斑點分離較好，因此本試驗選用苯-三氯甲烷-丙酮(5∶4∶2)作為展開劑。以上說明，復(fù)方藥物的薄層鑒別不能簡單照搬單味藥材的薄層鑒別條件，需要考察各種條件進行優(yōu)化。

有文獻(xiàn)[10-11]報道葫蘆茶和辣蓼中均含有蘆丁成分，因此本試驗按照供試品處理方法，分別稱取相應(yīng)處方量的葫蘆茶和辣蓼進行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葫蘆茶可以明顯鑒別出蘆丁成分，但辣蓼中未鑒別出蘆丁，說明辣蓼中蘆丁含量很少，明顯低于葫蘆茶。因此，該方法主要控制四味穿心蓮超微粉中的葫蘆茶。

有文獻(xiàn)報道[12-13]葫蘆茶和辣蓼均含有槲皮素成分，因此本實驗按照供試品處理方法，分別稱取相應(yīng)處方量的葫蘆茶和辣蓼進行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葫蘆茶和辣蓼在此方法下都可以明顯鑒別出槲皮素成分。因此，該方法可以同時控制四味穿心蓮超微粉中的辣蓼和葫蘆茶。

本文分別對四味穿心蓮超微粉的四種成分進行薄層鑒別研究，方法簡單快速，可以有效控制四味穿心蓮超微粉的質(zhì)量。試驗過程中也對普通散劑進行了對比，發(fā)現(xiàn)該方法同樣適用于四味穿心蓮散的薄層鑒別，因此可以認(rèn)為，物理粉碎使細(xì)胞達(dá)到破壁之后，藥材的有效化學(xué)成分仍未發(fā)生變化，也為四味穿心蓮普通散劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供思路。

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(編輯：陳希)

Study on the TLC Identification of Siwei Chuanxinlian Ultra-Fine Powder

WANG Lin1，CHEN Xian-zhong1，MA Xia2，WANG Wen-jia2，ZHANG Guo-zu2*
(1.HenanKangxingBiotechnologicalCo.,Ltd,Jiaozuo,Henan454950，China；2.HenanUniversityofAnimalHusbandry&Economy,Zhengzhou,Henan450011，China)

Four stable and reliable TLC methods were established to control the quality of four traditional Chinese medicine in Siwei Chuanxinlian ultra fine powder. The reference drug，andrographolide and dehydroandrographolide were identified for the quality control of andrographolide. The indirubin was identified for the quality control of foliumisatidis. The rutin was identified for the quality control of gourd tea. The quercetin was identified for the quality control of herba polygoni pubescentis and gourd tea. The correlative extraction method and TLC method were optimised and the negative samples were prepared for comparison. The results showed that the TLC methods had no negative interference, these methods were simple and stable ，they can effectively control the quality of Siwei Chuanxinlian ultra fine powder.

Siwei Chuanxinlian ultra fine powder；andrographolide；indirubin；rutin；quercetin

2016-09-08

A

1002-1280 (2017) 02-0024-05

S853.72

河南省重點科技攻關(guān)項目(122102110185,122102110224);河南省成果轉(zhuǎn)化項目(132201310002)

王林，碩士，從事中獸藥開發(fā)與應(yīng)用研究。

張國祖。E-mail：zhangguozu@126.com