高效液相色譜法測定磺胺間甲氧嘧啶的含量

陳錫龍(貴州省獸藥飼料監(jiān)察所，貴陽 550003)

高效液相色譜法測定磺胺間甲氧嘧啶的含量

陳錫龍
(貴州省獸藥飼料監(jiān)察所，貴陽 550003)

建立了獸藥磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液中磺胺間甲氧嘧啶含量的高效液相色譜測定法。以C18為固定相，0.1%磷酸溶液-乙腈(80∶20)為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，檢測波長270 nm，采用外標(biāo)法進行定量?；前烽g甲氧嘧啶的線性范圍為5.0～100.0 μg/mL，回歸方程為Area=40.333×Amt-18.843 (n=5)，相關(guān)系數(shù)大于0.999。從高(120%)、中(100%)和低(80%)三個添加水平的檢測結(jié)果可以看出，磺胺間甲氧嘧啶的回收率為96.27%～98.30%。該方法簡單，準(zhǔn)確，精密度好，回收率高，可以用于測量磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液中磺胺間甲氧嘧啶的含量。

磺胺間甲氧嘧啶；含量；高效液相色譜法

目前，獸用藥品磺胺間甲氧嘧啶(C11H12N4O3)(鈉)的含量測定采用永停滴定法[1-2],相對于高效液相色譜法，永停滴定法較繁瑣、耗時，且不利于及時發(fā)現(xiàn)藥品中的其他非法添加成分。采用高效液相色譜法測定獸藥含量是檢測技術(shù)發(fā)展的未來趨勢，也是提高檢測效率的必然要求。本研究建立了磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液中磺胺間甲氧嘧啶鈉(以磺胺間甲氧嘧啶計)含量的高效液相色譜測定法，并根據(jù)《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則》對新建立方法的準(zhǔn)確度、重復(fù)性、精密度、專屬性、耐用性及線性等進行了研究。

1 材料和方法

1.1 儀器和試藥 Agilent 1260 infinity 高效液相色譜儀(配紫外檢測器)；BP211D型電子分析天平(德國塞多利斯公司)；超聲波清洗器(KQ-300DE,昆山市超聲儀器廠)；磺胺間甲氧嘧啶對照品(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,批號：C0031007，含量：99.4%)；磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液分別由四川維爾康動物藥業(yè)有限公司、成都博大金點生物技術(shù)有限公司和四川好益多動物保健品有限公司提供(批號分別為：20150601，20151218，20160201；標(biāo)示含量為：10 mL:1 g、10 mL:1 g和10mL：0.5g)；乙腈為色譜純；水為高純水；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Zorbax SB C18(5 μm， 4.6 mm×250 mm)；柱溫為40 ℃；流動相為0.1%磷酸溶液-乙腈(80∶20)；流速1.0 mL/min；檢測波長270 nm；進樣體積10 μL。在此色譜條件下，對照品溶液和供試品溶液色譜圖見圖1、圖2。

圖1 磺胺間甲氧嘧啶對照品溶液色譜圖(100 μg/mL)

圖2 磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液供試樣品溶液色譜圖(100 μg/mL)

1.2.2 對照品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取磺胺間甲氧嘧啶對照品50 mg，置50 mL量瓶中，加鹽酸1 mL溶解后，再加水稀釋至刻度，混勻，即得濃度為1.0 mg/mL的磺胺間甲氧嘧啶對照品貯備液。精密量取1.0 mg/mL的磺胺間甲氧嘧啶對照品貯備液10 mL置于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，即得100 μg/mL的磺胺間甲氧嘧啶對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備 取磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液適量，置于100 mL容量瓶中，加2 mL鹽酸溶解后，再加水稀釋至刻度，混勻。然后，按標(biāo)示量稀釋制成100 μg/mL的溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍 精密量取1.0 mg/mL的磺胺間甲氧嘧啶對照品貯備液0.5、1、2、5、10 mL，分別置于100 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，得含磺胺間甲氧嘧啶濃度分別為5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/mL的對照溶液系列。精密吸取各對照溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，分別進樣兩針?；前烽g甲氧嘧啶濃度在5.0～100.0 μg/mL范圍內(nèi)，色譜峰有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Area=40.333×Amt-18.843，相關(guān)系數(shù)大于0.999，標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)見表1。

表1 磺胺間甲氧嘧啶對照品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)表

2.2 精密度 取C公司提供的批號為20151218的磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液，精密量取1000 μL,置100 mL容量瓶中，按1.2.3項制備成供試品溶液，分別作6個平行，每個樣品進樣1針，進行含量測定。以測定結(jié)果峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示試驗的精密度，精密度RSD為1.10%，表明方法的精密度良好(表2)。

表2 精密度及含量測量結(jié)果

2.3 準(zhǔn)確度 精密量取批號為20150601的磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液500 μL，按高(120%)、中(100%)和低(80%)三個濃度水平分別添加磺胺間甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品，制得向已知含量制劑中添加已知測定物的添加樣品，每個濃度水平的添加樣品分別制備3份供試樣。按1.2.3項制成供試品溶液，進行含量測定。以磺胺間甲氧嘧啶的實際測定含量和理論含量(制劑中磺胺間甲氧嘧啶的已有量+添加量)的比值計算磺胺間甲氧嘧啶的回收率，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，三個不同添加水平的磺胺間甲氧嘧啶的回收率均在96.27%～98.30%之間，方法符合《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則》。

表3 準(zhǔn)確度測量結(jié)果

回收率R(%)=實測平均含量/理論含量×100%

2.4 耐用性 取按準(zhǔn)確度測定項下制得的樣品，保持流動相比例和流速不變，在Shimadzu LC2010及Agilent 1260 infinity 色譜儀上分別使用Phenomenex Luna C18(5 μm, 4.6 mm×250 mm)和Zorbax SB C18(5 μm, 4.6 mm×250 mm)色譜柱于40 ℃條件下進行測試，考察方法的耐用性，結(jié)果表明,使用不同的儀器和色譜柱在相同的實驗條件下測得的含量的相對偏差不大于0.5%，耐用性良好。

2.5 專屬性 在磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液樣品測試色譜圖中，標(biāo)準(zhǔn)出峰時間附近均未發(fā)現(xiàn)明顯的干擾峰，可見方法的專屬性良好。

2.6 穩(wěn)定性 取100 μg/mL的磺胺間甲氧嘧啶對照品溶液分別于約0、24、48 h測定含量，以峰面積計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，磺胺間甲氧嘧啶的RSD為0.38%，說明磺胺間甲氧嘧啶溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 含量測定 取批號為20150601、20151228和20160201的三批企業(yè)樣品，分別測定磺胺間甲氧嘧啶鈉的含量，按以上方法測定計算，結(jié)果表明該3批樣品的平均含量分別為標(biāo)示含量的101.6%、96.3%和101.8%，而使用現(xiàn)行獸藥典方法測得的結(jié)果分別為102.4%、97.8%和103.4%。

3 討論與小結(jié)

3.1 色譜條件及檢測波長的選擇 當(dāng)前文獻報道測量磺胺類藥物的高效液相色譜法所使用的流動相系統(tǒng)有0.1%磷酸溶液-乙腈(90∶18)[1]、乙腈-甲醇-水-乙酸(2+2+9+0.2)[3]、0.017 mol/L磷酸-乙腈(80+20)[4]、磷酸鹽溶液-甲醇(65+35)[5]等，柱溫主要有30 ℃、40 ℃，檢測波長多為270 nm[6-7]、230 nm[1, 8]。在200～400 nm波長范圍內(nèi)對磺胺間甲氧嘧啶對照品溶液進行波長掃描，磺胺間甲氧嘧啶最大吸收峰為295、250、230 nm，在285、270、215 nm處均有較強吸收峰。為盡量保持磺胺類藥物液相色譜檢測方法的一致性，同時也能夠獲得較好的分離效果，選擇270 nm作為檢測波長，40 ℃作為色譜柱柱溫，0.1%磷酸溶液-乙腈(80∶20)作為流動相。使用此色譜條件進行檢測，磺胺間甲氧嘧啶的出峰時間適當(dāng)，峰形良好。

3.2 樣品提取方法的優(yōu)化 在進行樣品處理的過程中，分別采用1 mL、3 mL鹽酸，1 mL、3 mL 20 g/L NaOH溶液，少量乙腈等溶解樣品，然后再加水定容。發(fā)現(xiàn)采用1 mL鹽酸溶解處理樣品后峰形最佳且測量的偏差最小，故選擇使用1 mL的鹽酸溶解處理樣品后再加水定容?；前烽g甲氧嘧啶鈉注射液加入鹽酸處理時首先會產(chǎn)生白色沉淀，鹽酸過量后白色沉淀會重新溶解。

本研究建立了磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液中磺胺間甲氧嘧啶含量的高效液相色譜測定法是可行的，各項方法學(xué)指標(biāo)均比較理想，可以作為磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液中磺胺間甲氧嘧啶質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

[1] 中國獸藥典委員會．中華人民共和國獸藥典(二部)[M]．二O一O年版. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社.[2] 農(nóng)業(yè)部獸藥評審中心,獸藥國家標(biāo)準(zhǔn)匯編——獸藥地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)(第一冊)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社.2010：87-90

[3] 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所獸藥殘留檢驗操作規(guī)程CJCZ020[Z]．

[4] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.農(nóng)牧發(fā)[2001]38號文件[S].

[5] 耿士偉，曲斌，姜加華，等．QuEChERS-UPLC-MS/MS快速測定雞肝中七種磺胺類藥物殘留[J]. 中國獸藥雜志, 2011, 45(10) : 16-19.

[6] 查玉兵，陳美，王曉芳，等．高效液相色譜法測定豬肉中五種磺胺類藥物殘留量[J]. 分析儀器，2008，(4): 44-45.

[7] 陳錫龍. HPLC法測定復(fù)方磺胺對甲氧嘧啶片中磺胺對甲氧嘧啶的含量[J].中國獸藥雜志, 2014, 48(7):30-33.

[8] 楊武寧，崔艷莉. HPLC法測定復(fù)方磺胺對甲氧嘧啶鈉可溶性粉含量[J].中國動物保健, 2013, 15(8): 30-32.

(編輯：侯向輝)

Determination of Sulfamonomethoxine by HPLC

CHEN Xi-long
(GuizhouProvincialSupervisoryInstituteofVeterinaryDrugandFeeds,Guiyang550003,China)

An HPLC method has been developed to determine the content of sulfamonomethoxine in sulfamonomethoxine sodium injection, using C18 column as stationary phase, with a mobile phase of 0.1% phosphoric solution-acetonitrile (80∶20) and wavelength of 270 nm. It was quantified by external standard method and the linear range of sulfamonomethoxine was between 5.0 and 100.0 μg/mL. And the regression equation wasArea=40.333×Amt-18.843 (n=5) with the correlation to be more than 0.999. The average recoveries at three different levels of 120%, 100% and 80% of the sample ranged between 96.27% and 98.30%. This method was simple and accurate, and had a good precision and high recoveries as well, could be used for determination of sulfamonomethoxine in sulfamonomethoxine sodium injection.

sulfamonomethoxine; content; HPLC

陳錫龍, 高級獸醫(yī)師，從事獸藥質(zhì)量檢驗檢測及相關(guān)研究。E-mail: cxlofyjs@163.com

2016-10-08

A

1002-1280 (2017) 02-0016-04

S859.2