燈盞花素對肺缺血再灌注損傷大鼠保護作用的研究

毛哲哲胡彥峰 郭佳佳 王慧玲 馮 強 常 健 陳奎利 程 忠

（河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001）

·實驗報告·

燈盞花素對肺缺血再灌注損傷大鼠保護作用的研究

毛哲哲△胡彥峰 郭佳佳 王慧玲 馮 強 常 健 陳奎利 程 忠

（河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001）

目的 研究燈盞花素（Bre）對肺缺血再灌注損傷大鼠的保護作用及其可能的作用機制。方法 通過夾閉左肺門45 min的方法建立大鼠肺缺血再灌注損傷模型，術(shù)前30 min分別給予Bre（12.5、25、50 mg/kg）進行干預，并設(shè)假手術(shù)組和模型組。再灌注2 h后測定肺組織濕/干重比（W/D），比色法測定肺組織中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）活性和血清中總抗氧化能力（T-AOC）水平、髓過氧化物酶（MPO）活性、丙二醛（MDA）含量；蘇木精-尹紅（H&E）染色法觀察肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化；TUNEL法觀察肺組織細胞凋亡狀況；通過透射電子顯微鏡觀察肺組織細胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果 與模型組比較，Bre 25、50 mg/kg組大鼠肺組織W/D降低，肺組織抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性和血清中T-AOC水平均提高，血清中MPO活性和MDA含量顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05或P＜0.01）。H&E染色后光鏡下可見模型組肺組織呈現(xiàn)肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、上皮細胞變性壞死、炎癥細胞浸潤等病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，TUNEL染色后光鏡下可見模型組肺組織凋亡細胞數(shù)量較假手術(shù)組明顯增多，透射電鏡下可見肺毛細血管通透性增加、分界不清，肺泡內(nèi)有血漿成分、間隔增厚等病變；經(jīng)Bre干預能夠明顯改善肺缺血再灌注損傷大鼠肺組織病變和細胞凋亡狀況，顯著降低細胞凋亡指數(shù)（AI）（P＜0.01）。結(jié)論 Bre可能通過降低氧化應激損傷、抑制細胞凋亡、改善肺組織病變和細胞超微結(jié)構(gòu)改變而對肺缺血再灌注損傷起到一定的保護作用。

肺缺血再灌注 燈盞花素 氧化應激 凋亡 超微結(jié)構(gòu)

燈盞花是菊科植物短葶飛蓬的干燥全草，又名燈盞細辛，為我國傳統(tǒng)中藥品種，首載于《滇南本草》，性寒、微苦、甘溫辛，具有祛風除濕、活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)、消炎止痛之功。燈盞花素（Bre）是燈盞花的主要活性成分，現(xiàn)代藥學研究發(fā)現(xiàn)Bre屬于黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等多種生物學活性［1-4］。既往研究發(fā)現(xiàn)Bre能夠通過抑制氧化應激損傷和細胞凋亡而對腦組織、心肌、腎臟、肝臟等組織器官缺血再灌注損傷均表現(xiàn)出一定的保護作用［4-7］，但Bre是否對肺缺血再灌注損傷具有保護作用尚未見文獻報道，近年來病理生理學研究發(fā)現(xiàn)氧化應激以及繼發(fā)性細胞凋亡在肺缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用［8-10］，因此本研究通過制備肺缺血再灌注大鼠模型并給予Bre進行干預治療，以抑制氧化應激損傷和細胞凋亡為切入點，研究Bre對肺缺血再灌注損傷的保護作用?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 100只實驗用清潔級SD大鼠（雄性，鼠齡6～7周，體質(zhì)量200～240 g），購自河北省實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK（冀）2013-1-003。

1.2 藥物與試劑 燈盞花素注射液購自石藥銀湖制藥有限公司 （規(guī)格20 mg：5 mL，批號1011411024）；HE、TUNEL染色試劑盒和 T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT、MPO、MDA試劑盒購于北京博奧森生物工程有限公司。

1.3 分組與造模 100只實驗用SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、燈盞花素（12.5、25、50 mg/kg）組，各20只（n=20）；除假手術(shù)組外，其余各組大鼠均參照文獻報道方法建立大鼠肺缺血再灌注模型［6］。腹腔注射烏拉坦實施麻醉、氣管插管并連接動物呼吸機（設(shè)置參數(shù)70次/min，潮氣量20 mL/kg，呼吸比1∶1），于左胸第4肋和第5肋間開胸，剝離左肺門并用無創(chuàng)血管夾閉45 min后松開恢復血流灌注，逐層縫合；假手術(shù)組只行手術(shù)通路而不夾閉血管。Bre各質(zhì)量濃度組分別于術(shù)前30 min腹腔注射給藥，假手術(shù)組和模型組同步給予等體積0.9%氯化鈉注射液；再灌注2 h后，取標本進行各指標檢測。

1.4 標本采集與檢測 1）測定肺組織濕/干比重（W/ D）：每組隨機取6只大鼠，經(jīng)麻醉后取肺組織稱重為濕重（W），置60℃烘箱24 h后稱重為干重（D），然后計算肺組織濕/干比重（W/D）。2）氧化應激監(jiān)測指標：每組隨機取8只大鼠麻醉后取肺組織，用0.9%氯化鈉注射液制備1%肺組織勻漿液，3500 r/min離心10 min后取上清液，按照各試劑盒說明書通過紫外-可見分光光度計測定各組大鼠肺組織中抗氧化酶（SOD、GSHPx、CA）T活性。經(jīng)腹主動脈取血并離心 （1500 r/min，10 min）取血清，采用比色法通過紫外-可見分光光度計測定各組大鼠血清中T-AOC水平、MPO活性和MDA含量。3）肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變及細胞凋亡狀況：每組取剩余的6只大鼠麻醉后取肺組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定、石蠟包埋和切片處理后，行常規(guī)H&E染色后通過光學顯微鏡觀察肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變并照相保存，行TUNEL染色后通過倒置光學顯微鏡觀察各組大鼠肺組織細胞凋亡狀況并照相保存。細胞凋亡指數(shù)（AI）的計算：計數(shù)每張染色切片中細胞總數(shù)和凋亡細胞數(shù) （細胞核黃褐色為陽性著色），然后計算AI：AI（%）=（凋亡細胞數(shù)/肺總細胞數(shù)）×100%。4）肺組織細胞超微結(jié)構(gòu)：取肺組織并迅速剪切并修成約1 mm3小塊，經(jīng)2.5%戊二醛預固定1 h、PBS漂洗、1%鋨酸后固定1 h、丙酮梯度脫水、包埋和超薄切片處理后，行雙鉛染色，然后通過透射電鏡觀察并拍照。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS15.0統(tǒng)計學軟件。計量資料以（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，計數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 Bre對肺缺血再灌注大鼠肺組織W/D的影響

見表1。結(jié)果示，肺缺血再灌注大鼠肺組織W/D與假手術(shù)組比較升高（P＜0.01），經(jīng)Bre（25、50 mg/kg）預處理則能夠降低肺缺血再灌注損傷大鼠肺組織W/D值（P＜0.01或P＜0.05）。

表1 Bre對肺缺血再灌注大鼠肺組織W/D的影響s）

表1 Bre對肺缺血再灌注大鼠肺組織W/D的影響s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術(shù)組比較，△△P＜0.01。下同。

組別 n假手術(shù)組 6模型組 6 Bre 12.5 mg/kg組 6 W/D（%）5.0±0.4 6.7±0.8△△6.4±0.9 Bre 25 mg/kg組 6 5.8±0.5*Bre 50 mg/kg組 6 5.3±0.5**

2.2 Bre對肺缺血再灌注大鼠肺組織中抗氧化酶活性的影響 見表2。結(jié)果示，肺缺血再灌注大鼠肺組織中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性與假手術(shù)組比較降低（P＜0.01），經(jīng)Bre（25、50 mg/kg）預處理則能提高肺缺血再灌注大鼠肺組織SOD、GSH-Px、CAT活性（P＜0.01或P＜0.05）。

表2 Bre對肺缺血再灌注大鼠肺組織中氧化酶活性的影響（U/mg，±s）

表2 Bre對肺缺血再灌注大鼠肺組織中氧化酶活性的影響（U/mg，±s）

2.3 Bre對肺缺血再灌注大鼠血清中T-AOC水平、MPO活性、MDA含量的影響 見表3。結(jié)果示，肺缺血再灌注模型大鼠血清中T-AOC水平與假手術(shù)組比較降低（P＜0.01），而MPO活性、MDA含量升高（P＜0.01）。經(jīng)Bre（25、50 mg/kg）預處理則能提高T-AOC水平并降低MPO活性和MDA含量（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 Bre對肺缺血再灌注大鼠血清中T-AOC水平、MPO活性、MDA含量的影響（±s）

表3 Bre對肺缺血再灌注大鼠血清中T-AOC水平、MPO活性、MDA含量的影響（±s）

組別 n假手術(shù)組 8模型組 8 Bre 12.5 mg/kg組 8 Bre 25 mg/kg組 8 Bre 50 mg/kg組 8 T-AOC（U/mL） MPO（IU/L） MDA（nmol/L）23.9±2.8 3.5±0.7 2.8±0.3 15.1±2.2△△9.4±1.8△△8.7±1.2△△15.9±2.5 7.2±2.0 7.9±0.9 18.7±3.0*5.6±1.4*5.8±0.7**21.5±3.3**4.5±1.2**4.2±0.4**

2.4 Bre對肺缺血再灌注大鼠肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響見圖1。結(jié)果示，各組大鼠肺組織經(jīng)H&E染色后通過倒置光學顯微鏡觀察：假手術(shù)組大鼠肺組織形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)完整，未見異常；模型組大鼠肺組織呈現(xiàn)肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、液體滲出，細胞變性和壞死，炎癥細胞浸潤等病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變；經(jīng)不同劑量Bre預處理則能夠不同程度改善肺缺血再灌注大鼠肺組織病變，該作用呈一定依賴性。

圖1 Bre對肺缺血再灌注大鼠肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響（HE染色，400倍）

2.5 Bre對肺缺血再灌注大鼠肺細胞凋亡狀況的影響見圖2、表4。結(jié)果示，各組大鼠肺組織經(jīng)TUNEL染色后通過倒置光學顯微鏡觀察：與假手術(shù)組相比，模型組大鼠肺組織凋亡細胞數(shù)量明顯增多；經(jīng)不同劑量Bre預處理則能夠不同程度減少肺缺血再灌注損傷大鼠肺組織凋亡細胞數(shù)量，該作用具有一定的劑量依賴性。凋亡指數(shù)（AI）結(jié)果如表4所示，模型組大鼠肺組織細胞AI較假手術(shù)組增高（P＜0.01），經(jīng)Bre（25、50 mg/kg）預處理則能降低肺缺血再灌注大鼠AI值（P＜0.01）。

圖2 Bre對肺缺血再灌注大鼠肺細胞凋亡狀況的影響（TUNEL，400倍）

表4 Bre對肺缺血再灌注大鼠肺組織細胞凋亡率（AI）的影響（%，±s）

表4 Bre對肺缺血再灌注大鼠肺組織細胞凋亡率（AI）的影響（%，±s）

組別 n假手術(shù)組 6模型組 6 Bre 12.5 mg/kg組 6 AI 3.6±0.9 34.1±4.8△△27.8±5.4 Bre 25 mg/kg組 6 21.6±3.1**Bre 50 mg/kg組 6 15.3±2.2**

2.6 Bre對肺缺血再灌注大鼠肺細胞超微結(jié)構(gòu)的影響見圖3。通過透射電子顯微鏡（TEM）觀察發(fā)現(xiàn)：假手術(shù)組大鼠細胞超微結(jié)構(gòu)未見異常；模型組大鼠肺組織毛細血管通透性增加、分界不清，肺泡內(nèi)有血漿成分、間隔增厚，肺細胞出現(xiàn)變性壞死等病理性超微結(jié)構(gòu)改變。較模型組，經(jīng)不同劑量Bre預處理則能夠不同程度改善肺缺血再灌注損傷大鼠肺組織細胞超微結(jié)構(gòu)病變，該作用具有一定的劑量依賴性。

圖3 Bre對肺缺血再灌注大鼠肺細胞超微結(jié)構(gòu)的影響（TEM）

3 討 論

肺部手術(shù)過程中往往需要阻斷血流以減少出血，但缺血再灌注損傷并發(fā)癥的存在嚴重影響患者治療效果。肺缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展具有非常復雜的病理機制，其中氧化應激以及繼發(fā)性細胞凋亡發(fā)揮著重要作用［8-10］，這為能夠改善肺缺血再灌注損傷新型藥物的研發(fā)提供了新的切入點。

Bre是一類具有多種生物學活性的黃酮類化合物［1-4］。本實驗通過夾閉左肺門45 min后恢復血流的方法建立肺缺血再灌注損傷大鼠模型進行研究，檢測肺組織W/D發(fā)現(xiàn)經(jīng)Bre預處理能夠顯著緩解肺缺血再灌注損傷大鼠肺水腫，經(jīng)H&E染色后觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)Bre預處理能夠改善肺缺血再灌注損傷大鼠肺組織病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，經(jīng)TUNEL染色后觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)Bre預處理能夠顯著降低肺組織AI、有效抑制肺細胞凋亡，經(jīng)TEM觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)Bre預處理能夠有效改善肺缺血再灌注損傷大鼠肺組織細胞超微細胞結(jié)構(gòu)病變，提示Bre對肺缺血再灌注損傷大鼠具有一定的保護作用。

常態(tài)下體內(nèi)氧自由基（ROS）的生成與清除處于動態(tài)平衡，其中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）對ROS的清除發(fā)揮著重要的催化作用［11-13］；而當再灌注后隨著氧的大量涌入，ROS大量生成和過剩而攻擊細胞膜造成臟器的脂質(zhì)過氧化損傷，因此脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA的含量也能夠間接反映氧化應激損傷程度［14］；而總抗氧化能力（T-AOC）水平也能夠反應機體整體抗氧化能力［15］。髓過氧化物酶（MPO）是中性粒細胞特有的酶，其活性能夠反映中性粒細胞激活和浸潤，也能間接反映組織氧化應激損傷程度［16］。本實驗研究發(fā)：經(jīng)Bre預處理能夠顯著改善抗氧化酶 （SOD、GSH-Px、CAT）活性、提高血清中T-AOC水平、降低MPO活性和MDA含量，并通過下調(diào)NF-κB蛋白表達；提示Bre對缺血再灌注后氧化應激損傷具有一定的保護作用。

綜上所述，燈盞花素對肺缺血再灌注損傷具有一定的保護作用；其作用機制可能與燈盞花素能夠有效改善抗氧化酶活性、提高T-AOC水平、降低MPO活性而降低氧化應激損傷，抑制細胞凋亡，減輕肺水腫，改善肺組織病變和肺細胞超微結(jié)構(gòu)病變有關(guān)。

［1］ 丁寧.燈盞花素注射液對痛風患者抗氧化能力的影響研究［J］.中國現(xiàn)代藥物應用，2016，10（10）：150-151.

［2］ 梅崢嶸，司徒冰，黃漢輝，等.燈盞花素對阿爾茨海默病模型大鼠學習記憶和抗氧化能力的影響［J］.中國藥學雜志，2012，47（5）：347-350.

［3］ 李軍，吳立友，王朝陽.燈盞花素注射液對2型糖尿病早期腎病患者相關(guān)炎癥因子的影響［J］.中藥藥理與臨床，2011，27（3）：110-112.

［4］ 龔明玉，劉永平，許倩，等.燈盞花素對大鼠缺血/再灌注心肌細胞凋亡及凋亡相關(guān)基因表達的影響［J］.中國老年學雜志，2011，31（4）：657-659.

［5］ 金桂蘭，覃慧林，石孟瓊，等.燈盞花素對小鼠局灶性腦缺血損傷的保護作用及與腦組織P-糖蛋白表達研究［J］.中藥藥理與臨床，2015，31（1）：76-79.

［6］ 龔明玉，周曉慧，張力，等.燈盞花素抑制大鼠心肌缺血再灌注損傷誘導的細胞凋亡［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志，2011，17（5）：517-519.

［7］ 賈俊海，周留正，陳素仙，等.燈盞花素對大鼠腎臟缺血-再灌注損傷的保護作用［J］.江蘇醫(yī)藥，2011，37（5）：506-508.

［8］ 周權(quán)明，劉俊，章加寬，等.燈盞花素對大鼠肝缺血再灌注后肺損傷的保護作用［J］.吉林醫(yī)藥學院學報，2012，33（2）：71-73.

［9］ 王曉楊，毛宇飛，王萬鐵，等.氧化應激與總肺缺血再灌注細胞凋亡的相關(guān)性及川芎嗪干擾的影響［J］.中國老年學雜志，2012，32（18）：3957-3959.

［10］劉建平，何建峰.黃芪甲苷對大鼠肺缺血再灌注損傷后細胞凋亡的影響［J］.江蘇中醫(yī)藥，2016，48（6）：75-78.

［11］周俊輝，趙珊，陳海娥，等.姜黃素對肺缺血/再灌注損傷小鼠Caspase-12及細胞凋亡的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014，34（9）：1118-1124.

［12］Lartigue A，Burlat B，Coutard B，et al.The megavirus chilensis Cu，Zn-superoxide dismutase：the first viral structure of a typical CCS-independent hyperstable dimeric enzyme［J］.J Virol，2014，2588（14）：254-261.

［13］雷素英，李銀生，張彬，等.姜黃素對急性肺損傷小鼠肺組織GSH-PX和iNOS活性的影響［J］.中國現(xiàn)代應用藥學，2012，29（7）：583-586.

［14］高元峰，陳興，陳里新，等.紅景天苷對大鼠離體心臟缺血-再灌注損傷的保護作用及機制研究［J］.中南藥學，2010，8（2）：115-118.

［15］劉秀芳，李婷婷，蔡光明，等.小葉黑柴胡莖葉總黃酮體外抗氧化活性的研究［J］.中南藥學，2011，9（3）：173-175.

［16］張翔，江興林，周利玲，等.大黃素對大鼠動脈粥樣硬化形成的干預及對血清T-AOC、SOD和MDA水平的影響［J］.新中醫(yī)，2015，47（12）：230-232.

［17］段若望，李明新，宋炯.不同血液pH值對大鼠肺移植時缺血再灌注損傷的影響［J］.中華麻醉學雜志，2010，30（6）：685-687.

R285.5

A

1004-745X（2017）02-0255-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.02.022

2016-11-09）

△通信作者（電子郵箱：maozhezhe0614@163.com）