運(yùn)用GT/PCL納米纖維電紡膜在豬皮下構(gòu)建組織工程化軟骨的實(shí)驗(yàn)研究

霍瑩瑩 周廣東 鄭蕊

·論著·

運(yùn)用GT/PCL納米纖維電紡膜在豬皮下構(gòu)建組織工程化軟骨的實(shí)驗(yàn)研究

霍瑩瑩 周廣東 鄭蕊

目的探討運(yùn)用GT/PCL電紡材料為支架，在大動(dòng)物皮下構(gòu)建組織工程化軟骨的可行性。方法成年大白豬耳廓軟骨獲取種子細(xì)胞，分別以GT/PCL電紡材料（實(shí)驗(yàn)組）和傳統(tǒng)PGA/PCL（對(duì)照組）支架材料構(gòu)建軟骨。細(xì)胞－材料復(fù)合物在體外培養(yǎng)3周后，回植入自體豬皮下。分別于回植前、體內(nèi)培養(yǎng)3周時(shí)行組織學(xué)檢測、濕重和力學(xué)強(qiáng)度檢測，比較兩組的軟骨形成情況。結(jié)果體外培養(yǎng)3周后，兩組均可見軟骨組織形成，均可見明顯未降解材料，對(duì)照組軟骨基質(zhì)分泌更為旺盛；體內(nèi)培養(yǎng)3周后，實(shí)驗(yàn)組形成成熟的軟骨組織，對(duì)照組未見明顯軟骨形成，基本為纖維組織所替代；實(shí)驗(yàn)組力學(xué)強(qiáng)度明顯大于對(duì)照組。結(jié)論GT/PCL電紡材料可以作為支架，在大動(dòng)物皮下成功構(gòu)建組織工程化軟骨組織，是一種具有臨床應(yīng)用前景的支架材料。

組織工程化軟骨納米纖維電紡膜聚乙酸聚乳酸炎癥反應(yīng)

支架材料是影響組織工程化軟骨構(gòu)建的關(guān)鍵問題之一。膠原（Gelatine，GT）/聚己內(nèi)酯（Polycaprolactone，PCL）納米纖維電紡膜作為一種新型材料，在組織工程領(lǐng)域已引起廣泛關(guān)注。我們之前的研究顯示，GT/PCL納米纖維電紡膜作為支架材料，可以成功在體外和裸鼠體內(nèi)構(gòu)建組織工程化軟骨[1-2]。大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是進(jìn)入臨床試驗(yàn)的重要前期準(zhǔn)備。一些常用的支架材料可以在體外和免疫豁免動(dòng)物體內(nèi)成功構(gòu)建出軟骨組織，但由于大動(dòng)物皮下血運(yùn)豐富、免疫環(huán)境復(fù)雜，這些材料在大動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中常引起嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，影響軟骨形成[3-5]。因此，為了進(jìn)一步驗(yàn)證其大動(dòng)物皮下成軟骨的可行性，本研究以聚乙酸（Polyglycolic acid，PGA）/聚乳酸（Polylactic acid，PLA）支架材料為對(duì)照，以GT/PCL（50∶50）納米電紡材料（G5P5）為實(shí)驗(yàn)組，復(fù)合自體軟骨細(xì)胞進(jìn)行軟骨構(gòu)建，并回植于豬自體皮下，比較兩者在大動(dòng)物皮下的軟骨形成能力。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雜交豬3只（上海甲干生物科技有限公司），雌雄不限，體質(zhì)量50～60 Kg。實(shí)驗(yàn)過程均依照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)保護(hù)指南進(jìn)行。每只雜交豬選取腹部近后肢平坦處回植，左側(cè)為細(xì)胞-GT/PCL材料復(fù)合物（n=5），右側(cè)為細(xì)胞-PGA/PCL材料復(fù)合物（n=5），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

胰蛋白酶（Hyclone公司，美國）；Ⅱ型膠原酶（Worthington公司，美國）；高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）；胎牛血清（Hyclone公司，美國）；無紡PGA纖維（組織工程國家工程中心）；GT/PCL納米纖維電紡膜（上海兒童醫(yī)學(xué)中心轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所）。

1.3 細(xì)胞的獲取與擴(kuò)增

剪取豬耳廓軟骨，洗凈，切成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入5倍體積的0.25%膠原酶搖床消化過夜；75 μm孔徑濾網(wǎng)過濾，離心，PBS漂洗2遍，以含10% FBS的高糖DMEM配成細(xì)胞懸液，按2×106個(gè)/皿（直徑10 cm培養(yǎng)皿）接種細(xì)胞，置入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞達(dá)90%融合時(shí)進(jìn)行傳代[6]。本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均為第二代軟骨細(xì)胞。

1.4 細(xì)胞－GT/PCL復(fù)合物的制備

用7 mm直徑的角膜環(huán)鉆將G5P5納米纖維電紡膜處理成直徑7 mm的圓形膜片，真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行過夜冷凍干燥處理，紫外燈下消毒30 min后備用。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的前期研究成果，運(yùn)用“三明治”法構(gòu)建細(xì)胞-材料復(fù)合物[7]。將第2代軟骨細(xì)胞用軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液制備成6×107cells/mL濃度的細(xì)胞混懸液，用顯微鑷將G5P5納米纖維電紡膜按照“膜片-細(xì)胞懸液-膜片”的方式在培養(yǎng)皿中層層疊加，每層約加入8 μL細(xì)胞懸液，共疊加10層，約80 μL，然后將構(gòu)建的細(xì)胞-材料復(fù)合物放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，小心加入含10%FBS的高糖DMEM至覆蓋復(fù)合物，放入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3～4 d換液一次，換液時(shí)應(yīng)輕輕吸除培養(yǎng)液[1]。體外培養(yǎng)3周后，將細(xì)胞-GT/PCL復(fù)合物植入自體大白豬腹部的皮下。

1.5 細(xì)胞-PGA/PCL復(fù)合物的制備

15 mg無紡PGA纖維制成直徑7 cm大小圓片，將1%PLA二氯甲烷溶液均勻滴在PGA纖維上，使PGA/PLA混合材料總質(zhì)量達(dá)到16.5 mg[8]。75%乙醇消毒，PBS沖洗3次。將第2代軟骨細(xì)胞用軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液制備成6×107cells/mL濃度的細(xì)胞懸液，均勻滴在PGA/PLA支架上，每塊材料可吸水80 μL。在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)4 h，加入軟骨組織培養(yǎng)液（含10%FBS、1%青霉素及鏈霉素的DMEM）繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液。體外培養(yǎng)3周后，將細(xì)胞-PGA/PLA復(fù)合物植入自體大白豬腹部皮下。

1.6 組織學(xué)檢查

每組分別于回植前（體外培養(yǎng)3周）、體內(nèi)培養(yǎng)3周時(shí)，各取5個(gè)樣本，大體觀察。然后，將標(biāo)本以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，行HE及油紅-O染色，觀察組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況。免疫組織化學(xué)染色檢測Ⅱ型膠原的表達(dá)情況[7，9]。

1.7 濕重與力學(xué)強(qiáng)度檢測

將構(gòu)建物輕輕夾出，在濾紙上吸干表面水分后用精密天平稱重，每組5個(gè)標(biāo)本。用生物力學(xué)分析儀（Instron 5542-C8609，美國）對(duì)各組構(gòu)建軟骨進(jìn)行單軸向、非限定性壓縮的生物力學(xué)分析。通過應(yīng)力-應(yīng)變力學(xué)測試來測定組織彈性模量和抗壓強(qiáng)度，每組5個(gè)樣本[1]。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

樣本的各項(xiàng)定量指標(biāo)均以（x±s）表示，應(yīng)用SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建的軟骨組織大體和組織學(xué)觀察

軟骨細(xì)胞分別與實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組支架材料復(fù)合，構(gòu)建直徑7 mm的圓柱形細(xì)胞材料復(fù)合物（圖1A、B），體外培養(yǎng)后植入自體大白豬腹部皮下（圖1C）。

體外培養(yǎng)3周后，構(gòu)建的軟骨組織從外觀上看，均為有一定彈性的軟骨樣組織，直徑、大小無明顯改變（圖2A、E）。組織學(xué)顯示，兩組均有軟骨陷窩形成，實(shí)驗(yàn)組軟骨層較薄，并被條帶狀材料所分割（圖2B-D），對(duì)照組軟骨基質(zhì)分泌更為旺盛，細(xì)胞基質(zhì)更均勻，大量纖維狀殘余材料分布其中（圖2F-H）。

體內(nèi)培養(yǎng)3周后，實(shí)驗(yàn)組繼續(xù)發(fā)育成熟，大小無明顯回縮（圖3A），組織學(xué)可觀察到大量基質(zhì)分泌，有成熟的軟骨陷窩形成，同時(shí)可見明顯的條帶狀材料殘余（圖3B-D）。對(duì)照組樣本較體外培養(yǎng)時(shí)縮小（圖3E），質(zhì)軟，組織學(xué)未見軟骨陷窩形成，未見明顯材料殘余（圖3F-H）。

2.2 體內(nèi)培養(yǎng)3周后構(gòu)建組織的濕重和力學(xué)強(qiáng)度經(jīng)過3周的體內(nèi)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣本濕重統(tǒng)計(jì)未見明顯差異（圖4A）；實(shí)驗(yàn)組力學(xué)強(qiáng)度明顯大于對(duì)照組（圖4B），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。

圖1 細(xì)胞－材料復(fù)合物的構(gòu)建和回植Fig.1Engineering cartilage in vitro and during implantation

圖2 體外培養(yǎng)3周構(gòu)建組織大體觀與組織學(xué)觀察（標(biāo)尺：500 μm）Fig.2Gross and histological observation of tissue harvested in each group after cultured for 3 weeks(scale bars:500 μm)

圖3 體內(nèi)培養(yǎng)3周構(gòu)建組織大體觀與組織學(xué)觀察（標(biāo)尺：500 μm）Fig.3Gross view and histological observation of tissue harvested in each group after implanted for 3 weeks(scale bars:500 μm)

圖4 體內(nèi)培養(yǎng)3周構(gòu)建組織濕重和力學(xué)強(qiáng)度檢測Fig.4Wet weight and Young's modulus of tissue harvested in each group after implanted for 3 weeks

3 討論

我們的前期研究已證實(shí)電紡膜是一種優(yōu)良的組織工程支架材料，可在體外和裸鼠體內(nèi)構(gòu)建出成熟的三維軟骨組織[1-2]。大動(dòng)物皮下因復(fù)雜的免疫環(huán)境，很多常用的支架材料均未能成功構(gòu)建軟骨[10-11]。本研究證明，電紡膜可在大動(dòng)物皮下構(gòu)建軟骨，并且軟骨陷窩成熟，基質(zhì)相對(duì)均勻，是優(yōu)良的支架材料。

大動(dòng)物皮下復(fù)雜的免疫環(huán)境，是造成很多支架材料不能用于軟骨構(gòu)建的主要原因。GT/PCL電紡材料和PGA/PCL材料在成分和結(jié)構(gòu)上有很大不同，且進(jìn)入大動(dòng)物皮下培養(yǎng)時(shí)均有大量材料殘余。因此，我們分析造成這種巨大差異的原因如下。

首先是支架材料的成分，實(shí)驗(yàn)組G5P5納米纖維電紡膜為GT∶PCL=50∶50的混紡材料，其中Gelatin是一種天然的水溶性的生物可降解高分子材料，具有良好的組織相容性，在體內(nèi)酶、鹽等的作用下可自行降解，降解后的低分子產(chǎn)物可被組織吸收，或者通過排泄系統(tǒng)排出體外，而不會(huì)產(chǎn)生異物排斥現(xiàn)象或炎癥反應(yīng)，也無細(xì)胞毒性；而PCL則是經(jīng)美國FDA認(rèn)證、批準(zhǔn)的一種醫(yī)用可降解生物材料，具有低免疫原性及無毒性[12]，且降解緩慢，產(chǎn)物為CO2和H2O，對(duì)人體無毒[13-15]，對(duì)照組PGA/PCL支架中的90%的成分為PGA，降解產(chǎn)物為乳酸，可引起微環(huán)境pH值變化，易引起炎癥反應(yīng)，對(duì)軟骨細(xì)胞造成破壞。

其次，是支架材料的降解速度。支架材料的降解速度和組織形成相適應(yīng)，是評(píng)價(jià)組織工程支架的一個(gè)重要指標(biāo)。降解速度的不同可造成降解產(chǎn)物的不同的聚集程度，是影響組織形成的重要原因。PGA/ PCL支架中90%的成分為PGA，PGA降解速度快，約8周可降解完全，體外培養(yǎng)中，降解的乳酸可隨更換培養(yǎng)液去除，不易對(duì)軟骨細(xì)胞造成破壞，而在大動(dòng)物皮下，快速的降解可造成乳酸堆積于組織周圍，更易受到免疫攻擊，造成嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[3-4]。而G5P5納米纖維電紡膜為完全混合混紡材料，Gelatin降解速度快，體外培養(yǎng)中幾乎可以完全降解，而PCL完全降解則需要2年以上[13]。因此，在免疫環(huán)境中，G5P5納米纖維電紡膜不易引起炎癥反應(yīng)。

再次，是納米電紡膜特殊的結(jié)構(gòu)特征。大動(dòng)物皮下具有豐富的血管組織，和關(guān)節(jié)軟骨的免疫豁免環(huán)境不同，幼稚的軟骨樣組織極易受到免疫攻擊，很難發(fā)育成熟。而我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，回植前實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞基質(zhì)不多，組織極不成熟，而體內(nèi)培養(yǎng)后軟骨組織迅速成熟，幾乎和前期研究在免疫缺陷動(dòng)物中的組織成熟度相當(dāng)[1]。電紡膜的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為超細(xì)纖維，且在形態(tài)和尺寸上能仿生天然細(xì)胞外基質(zhì)的納米纖維結(jié)構(gòu)[15]。成熟的軟骨基質(zhì)具有免疫保護(hù)作用，其致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可包裹軟骨細(xì)胞不被免疫系統(tǒng)識(shí)別[5]。因此，根據(jù)電紡膜仿生細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，我們推測其具有和軟骨基質(zhì)類似的免疫保護(hù)作用，軟骨細(xì)胞可以在其保護(hù)下不被免疫系統(tǒng)識(shí)別，從而進(jìn)一步發(fā)育成熟，這也可以解釋體外培養(yǎng)3周時(shí)實(shí)驗(yàn)組未見明顯成熟軟骨組織，而體內(nèi)培養(yǎng)后軟骨成熟迅速，電紡膜材料也未見明顯降解。當(dāng)然，這種推論還需要后期進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

4 結(jié)論

GT/PCL復(fù)合納米纖維電紡膜可成功用于大動(dòng)物皮下環(huán)境的軟骨構(gòu)建。與PGA/PCL材料相比，具有體外培養(yǎng)時(shí)間短、軟骨形成成熟的優(yōu)勢，是一種優(yōu)良的軟骨組織工程支架材料，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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The Construction of Tissue Engineered Cartilage by Using GT/PCL Nanofibres Membranes in Porcine Model

ObjectiveTo investigate the possibility of the tissue engineered cartilage construction with electrospun gelatin/polycaprolactone(GT/PCL)membranes in subcutaneous of porcine model.MethodsEngineered cartilage was constructed by auricular chondrocytes of porcine as seed cells with GT/PCL membranes(experimental group)and PGA/PLA material(control group)as scaffold.Then the engineered cartilage was implanted subcutaneously in the abdominal wall of swine after cultured 3 weeks in vitro.The samples of the two groups were collected at two time points:3 weeks in vitro and 3 weeks in vivo.Histological observation,wet weight and mechanical strength test were used to evaluate the chondrogenesis．ResultsAfter 3 weeks cultured in vitro,cartilage phenotype and undegraded scaffolds were observed in two groups by histological analysis.And the extracellular matrix in control group seems more uniform than the experimental group. However,After 3 weeks cultured in vivo,mature cartilage were only formed in the experimental group,and fibrous tissue substitute for cartilage was observed in the control group.In addition,the engineered cartilage in experimental group showed better mechanical strength.ConclusionGT/PCL membranes could be successfully used in the construction of tissue engineering cartilage in subcutaneous of large animal.It could be a kind of promising scaffold for cartilage tissue engineering.

Tissue engineered cartilage;Electrospun nanofibres membranes;Polyglycolic acid;Polylactic acid; Inflammatory response

R318.1

A

1673－0364（2017）01－0001－04

HUO Yingying1,2,3,ZHOU Guangdong2,3,ZEHNG Rui1,2,3．
1 Department of Dermatology,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;2 Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai 200011,China;3 National Tissue Engineering Center of China,Shanghai 200241,China.Corresponding author:ZEHNG Rui (E-mail:zhr1224@126.com).

2016年9月30日；

2016年12月22日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.01.001

國家自然科學(xué)基金（81401532）。

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院皮膚科（霍瑩瑩，鄭蕊）；200011上海市上海市組織工程研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（霍瑩瑩，周廣東，鄭蕊）；200241上海市組織工程國家工程中心（霍瑩瑩，周廣東，鄭蕊）。

鄭蕊（E-mail：zhr1224@126.com）。