eotaxin-3基因+2497、+77位點SNP與支氣管哮喘易感性及類型的關(guān)系

熊曉琦，宋新宇，曾凡軍，孟麗霞，阮玉姝，李文新

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院·宜昌市中心人民醫(yī)院，湖北宜昌443003)

eotaxin-3基因+2497、+77位點SNP與支氣管哮喘易感性及類型的關(guān)系

熊曉琦，宋新宇，曾凡軍，孟麗霞，阮玉姝，李文新

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院·宜昌市中心人民醫(yī)院，湖北宜昌443003)

目的 探討嗜酸性粒細胞趨化蛋白(eotaxin-3)基因+2497、+77位點單核苷酸多態(tài)性(SNP)與支氣管哮喘(哮喘)易感性、類型的關(guān)系。方法 選擇哮喘患者196例(哮喘組)、經(jīng)體檢健康者196例(對照組)，其中哮喘組嗜酸細胞性哮喘(EA)140例、非嗜酸細胞性哮喘(NEA)56例。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)檢測eotaxin-3 SNP，ELISA法檢測血漿eotaxin-3水平。結(jié)果 哮喘組eotaxin-3+2497位TG基因型頻率、等位基因G的頻率高于對照組(P均<0.05)；兩組+77位等位基因T的頻率和各基因型頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。NEA患者+2497位TG型頻率高于EA患者(P<0.05)。TG型哮喘患者血漿eotaxin-3水平低于TT型哮喘患者(P<0.05)。結(jié)論 eotaxin-3+2497突變(T>G)與哮喘易感性及類型相關(guān)，而eotaxin-3+77位點SNP與哮喘易感性及類型無關(guān)。

支氣管哮喘；嗜酸性粒細胞趨化蛋白；單核苷酸多態(tài)性；易感性

嗜酸性粒細胞趨化蛋白(eotaxin)家族包括eotaxin-1、eotaxin-2和eotaxin-3，通過與趨化因子3受體結(jié)合參與招募嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和Th2細胞，從而在外周血和氣道中激活嗜酸性粒細胞反應(yīng)，在支氣管哮喘(哮喘)發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1,2]。目前研究發(fā)現(xiàn)，eotaxin的單核苷酸多態(tài)性(SNP)與哮喘易感性、外周血IgE及嗜酸性粒細胞(EOS)數(shù)量相關(guān)[3～5]。本研究檢測哮喘患者eotaxin-3基因+2497、+77位點SNP，探討其與哮喘易感性、類型及患者血漿eotaxin-3水平的關(guān)系，為哮喘治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年1月～2015年12月于本院就診的哮喘患者196例(哮喘組)，均符合全球哮喘防治倡議有關(guān)哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中男92例、女104例，年齡(43.21±10.68)歲；第1秒用力呼氣容積占預(yù)計值百分比(FEV1% pred)82%±15%，外周血總IgE水平(132±33)IU/mL，外周血EOS計數(shù)(0.45±0.22)×109/L，誘導(dǎo)痰中EOS百分比7.8%±3.1%。根據(jù)誘導(dǎo)痰中EOS百分比，將哮喘患者分為嗜酸細胞性哮喘(EA)140例(EOS>3%)和非嗜酸細胞性哮喘(NEA)56例(EOS≤3%)。排除有吸煙史、糖皮質(zhì)激素治療史、肺部有實質(zhì)性病變及近4周有上呼吸道感染病史患者。同期選擇經(jīng)體檢健康者196例(對照組)，男90例、女106例，年齡(45.32±13.35)歲；FEV1% pred 93%±12%，外周血總IgE水平(18.4±7.6)IU/mL，外周血EOS計數(shù)(0.05±0.02)×109/L，誘導(dǎo)痰中EOS百分比0.23%±0.16%。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)?；颊呔炇鹬橥鈺?。

1.2 eotaxin-3 SNP檢測 采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)。采集兩組靜脈血4 mL，取其中2 mL用苯酚-氯仿法提取外周血白細胞基因組DNA，用PRIMER軟件設(shè)計引物，eotaxin-3基因+77位引物：上游5′-TCAGGCAGGAGGAGTTTG-3′、下游 5′-GGCTTGTGGCTGTATTGG-3′)，+2497位引物：上游5′-GAAAGAGGCAAGAAAGTC-3′、下游 5′-AATCTGGGAGGAAACACC-3′。PCR反應(yīng)體系25 μL，包括基因組100 ng，10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTPs各10 nmol，Taq DNA聚合酶1 U，Mg2+濃度2.0 mmol/L，不足體積用雙蒸水補足。+77位PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。+2497位PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min； 94 ℃ 45 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。用PCR-RFLP技術(shù)對eotaxin-3基因+2497位及+77位的2個SNP位點進行基因分型，酶切產(chǎn)物經(jīng)4%瓊脂糖凝膠電泳分離，用全自動數(shù)碼凝膠成像儀分析結(jié)果。+77位酶切產(chǎn)物長度：TT為247 bp，CC為147、127 bp，CT為247、147、127 bp；+2497位酶切產(chǎn)物長度：TT為217、135 bp，TG為217、135、117 bp。

1.3 血漿eotaxin-3水平檢測 取剩余的2 mL靜脈血，4 ℃，3 000 r/min，離心10 min，取上層血漿置于-80 ℃冰箱保存。采用ELISA法檢測血漿eotaxin-3水平。

2 結(jié)果

2.1 兩組eotaxin-3 +2497、+77位等位基因及基因型頻率比較 +2497 T>G未檢測到GG基因型，兩組eotaxin-3 +2497和+77的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。哮喘組eotaxin-3 +2497位等位基因T、G的頻率分別為88.5%(347/392)、11.5%(45/392)，對照組分別為97.7%(383/392)、2.3%(9/392)；哮喘組+77位等位基因C、T的頻率分別為62.5%(245/392)、37.5%(147/392)，對照組分別為59.4%(233/392)、40.6%(159/392)。哮喘組eotaxin-3 +2497位等位基因G的頻率高于對照組(P<0.05)，兩組其他等位基因頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。哮喘組TG基因型頻率高于對照組(P<0.05)，兩組其他基因型頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 兩組eotaxin-3 +2497位、77位基因型頻率比較[例(%)]

2.2 EA與NEA患者eotaxin-3 +2497、+77位基因型頻率比較 EA與NEA患者eotaxin-3 +2497位基因型頻率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，+77位基因型頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 EA與NEA患者eotaxin-3 +2497位、77位基因型頻率比較[例(%)]

2.3 eotaxin-3 +2497位TT型和TG型哮喘患者血漿eotaxin-3水平比較 TT型哮喘患者血漿eotaxin-3水平為(0.84±0.31)ng/mL，高于TG型[(0.43±0.12)ng/mL]，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

目前認(rèn)為氣道炎癥是哮喘時氣道高反應(yīng)性的重要原因，而EOS是其關(guān)鍵的效應(yīng)細胞，EOS在氣道的聚集是哮喘發(fā)病的一個重要環(huán)節(jié)，且EOS浸潤是哮喘患者氣道的主要病理改變之一。Eotaxin可特異性地趨化EOS聚集到支氣管而引發(fā)氣道炎癥。eotaxin基因家族包括eotaxin-1、eotaxin-2和eotaxin-3，其同源性不足40%。研究顯示，eotaxin-1與早期變態(tài)反應(yīng)中的EOS浸潤激活相關(guān)[6]，而eotaxin-2和eotaxin-3則與變態(tài)反應(yīng)晚期EOS的增多活化關(guān)系密切[7～9]。eotaxin-3位于7q11.23染色體上，共有3個外顯子和2個內(nèi)含子，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有7個SNP位點，其中有5個位于內(nèi)含子區(qū)域，1個位于5′-非編碼區(qū)，1個位于3′-非編碼區(qū)。本研究中的eotaxin-3 +2497位和+77位分別位于3′-非編碼區(qū)和內(nèi)含子區(qū)域。

本研究發(fā)現(xiàn)，eotaxin-3 在3′-非編碼區(qū)+2497 T>G基因多態(tài)性與哮喘易感性相關(guān)，而+77 C>T與哮喘的易感性無明顯關(guān)系。eotaxin-3 +2497 T>G基因多態(tài)性與哮喘易感性相關(guān)這一結(jié)論與高貴民等[10,11]的研究結(jié)論相同。而+77 C>T與哮喘易感性不相關(guān)與霍婧等[12]的研究結(jié)果不一致，該研究發(fā)現(xiàn)eotaxin-3 C+77T可能是漢族兒童哮喘易感SNP位點，其中eotaxin-3 C+77T T/T純合子基因型與哮喘發(fā)病密切相關(guān)；而Shin等[3]用直接測序的方法發(fā)現(xiàn)，eotaxin-3的+2497位、+77位與哮喘的關(guān)系并不密切，因此eotaxin-3在此兩個位點的SNP與哮喘易感性的相關(guān)性可能還需更大樣本的研究來驗證。

目前有研究認(rèn)為，eotaxin-3 +2497位點可能在EOS的募集和血漿總IgE水平的維持中起重要作用[11]。而eotaxin-3 +2497位點的SNP可能影響eotaxin-3的表達。Macdonald[13]認(rèn)為，3′-非編碼區(qū)序列能夠控制mRNA的穩(wěn)定性及其翻譯效率。由此推斷，eotaxin-3 +2497位點由TT型突變成TG型后，eotaxin-3的mRNA穩(wěn)定性可能受到影響，從而影響其翻譯效率，最終導(dǎo)致TG型血漿eotaxin-3的表達水平較TT型低，而本研究結(jié)果也證實了這一推論。本研究TT型哮喘患者血漿eotaxin-3的水平明顯高于TG型和對照組，說明eotaxin-3 +2497突變(T>G)突變能影響eotaxin-3的血漿水平。且本研究發(fā)現(xiàn)，eotaxin-3 +2497位TG型的NEA患者比例高于EA患者，這說明eotaxin-3+2497T>G突變可能通過影響eotaxin-3的表達而影響EOS聚集，從而導(dǎo)致TG型哮喘患者誘導(dǎo)痰中的EOS比例降低。

綜上所述， eotaxin-3 +2497 T>G與哮喘易感性、哮喘類型相關(guān)。eotaxin-3 +2497 T>G突變可影響哮喘患者血漿eotaxin-3水平，從而影響EOS的聚集。

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Relationship of eotaxin-3 +2497 and +77 SNP with types and susceptibility of bronchial asthma

XIONGXiaoqi,SONGXinyu,ZENGFanjun,MENGLixia,RUANYushu,LIWenxin

(TheFirstSchoolofClinicalMedicineofChinaThreeGorgesUniversity,YichangCentralPeople'sHospital,Yichang443003,China)

Objective To investigate the relationships of eotaxin-3 +2497 and +77 single nucleotide polymorphism (SNP) with types and susceptibility of asthma.Methods We recruited 196 healthy control subjects (control group) and 196 patients with asthma (asthma group), including 140 cease of eosinophilic asthma (EA) and 56 cases of non-eosinophilic asthma (NEA). The polymorphism, allele frequency and genotype frequency of eotaxin-3+77C>T, +2497T>G were detected by PCR-RFLP. ELISA was used to detect the level of eotaxin-3 in plasma. Results The genotype frequency of eotaxin-3+2497 TG and allele frequency of eotaxin-3+2497G in the asthma group were significantly higher than those of the control group (allP<0.05). However, the allele frequency of eotaxin-3+77T and genotype frequency of eotaxin-3+77 showed no difference between the asthma and control groups (allP>0.5). The frequency of eotaxin-3 +249 7 TG genotype in NEA patients was significantly higher than that in EA patients (P<0.05). The level of eotaxin-3 in TG genotype asthmatic patients was significantly lower than that in TT genotype (P<0.05).Conclusions Eotaxin-3 +249 7 mutation (T>G) is associated, but eotaxin-3+77 SNP is not associated with asthma susceptibility, eosinophilic asthma and non-eosinophilic asthma.

bronchial asthma; eotaxin; single nucleotide polymorphism; susceptibility

湖北省教育廳科研計劃項目(B2015254)。

熊曉琦(1975-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要研究方向為支氣管哮喘的基礎(chǔ)及臨床。E-mail：glacierxq@126.com

宋新宇(1979-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要研究方向為間質(zhì)性肺病、支氣管哮喘的基礎(chǔ)及臨床。E-mail：songxinyuhxk@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.05.004

R562.25

A

1002-266X(2017)05-0012-03

2016-10-07)