Cullin-RING E3泛素連接酶及其抑制劑在腫瘤治療中的研究進(jìn)展

韋瓊，陳錦飛

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.南京市第一醫(yī)院，江蘇 南京 210006)

·綜 述·

Cullin-RING E3泛素連接酶及其抑制劑在腫瘤治療中的研究進(jìn)展

韋瓊1，陳錦飛2

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.南京市第一醫(yī)院，江蘇 南京 210006)

Cullin-RING泛素連接酶(cullin-rING ligase，CRL)是人體內(nèi)數(shù)量最多的一類(lèi)泛素連接酶的統(tǒng)稱(chēng)，由cullin蛋白、RING蛋白及底物識(shí)別亞基組成。它們通過(guò)與數(shù)百種底物相互作用，形成數(shù)量龐大的CRL復(fù)合體并調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白分子的泛素化降解過(guò)程。作者對(duì)CRL及其抑制劑在腫瘤治療中的研究進(jìn)展作一綜述。

Cullin-RING泛素連接酶；泛素化；蛋白質(zhì)降解；腫瘤治療；CRL抑制劑；文獻(xiàn)綜述

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiqutin-proteasome system，UPS)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)最主要的蛋白降解途徑。靶蛋白的泛素化依賴(lài)胞內(nèi)E1泛素活化酶、E2泛素結(jié)合酶和E3泛素連接酶的協(xié)同作用。目前發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)含有兩種E1泛素活化酶、大約38種E2泛素結(jié)合酶和數(shù)百種E3泛素連接酶，而E3泛素連接酶決定了底物的特異性。蛋白泛素化的最主要功能是為蛋白酶體提供識(shí)別和降解的信號(hào)。UPS功能眾多，其功能失調(diào)被證實(shí)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1]。

Cullin-RING泛素連接酶(cullin-rING ligase，CRL)作為人體內(nèi)最龐大的一類(lèi)泛素連接酶家族，能夠調(diào)節(jié)胞內(nèi)眾多腫瘤相關(guān)蛋白的泛素化修飾與降解[2]。作者先對(duì)CRL進(jìn)行概述，然后進(jìn)一步對(duì)CRL作為抗腫瘤治療靶點(diǎn)的研究進(jìn)展作一綜述。

1 CRL的構(gòu)成

蛋白在細(xì)胞內(nèi)翻譯后被泛素或一些其他類(lèi)泛素分子共價(jià)修飾是一種常見(jiàn)的蛋白生理功能的調(diào)節(jié)機(jī)制，其中蛋白泛素化修飾最為普遍。E3泛素連接酶可以分為HECT結(jié)構(gòu)域家族和RING-finger結(jié)構(gòu)域家族兩大類(lèi)。CRL是RING-finger結(jié)構(gòu)域家族的典型代表，屬于人體內(nèi)數(shù)量最大的泛素連接酶家族。CRL是一類(lèi)由cullin、RING蛋白以及其他多種亞基蛋白共同組成的復(fù)合體[1]。其中，cullin蛋白作為支架蛋白通過(guò)羧基端結(jié)合RING蛋白構(gòu)成CRL的催化中心，同時(shí)利用氨基端直接或間接連接底物識(shí)別亞基蛋白。迄今，在人體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)8種不同類(lèi)型的cullin蛋白家族成員[3]，其蛋白均有保守的cullin同源結(jié)構(gòu)域，可結(jié)合具有活性的亞基RING結(jié)構(gòu)域蛋白。RING蛋白分為RBX1和RBX2兩大亞類(lèi)。人體內(nèi)cullin蛋白、RING蛋白、接頭蛋白和底物識(shí)別受體之間通過(guò)不同組合構(gòu)成CRL復(fù)合體，胞內(nèi)調(diào)控?cái)?shù)以千計(jì)的蛋白分子的泛素化降解過(guò)程。

2 CRL活化的調(diào)控機(jī)制

CRL在細(xì)胞內(nèi)的激活除了需要相關(guān)亞基蛋白的有效組合外，還依賴(lài)類(lèi)泛素分子NEDD8對(duì)其Cullin骨架蛋白的共價(jià)修飾，即Neddylation修飾[1]。與蛋白泛素化修飾相似，蛋白Neddylation修飾也依賴(lài)自身通路的E1活化酶、E2結(jié)合酶以及E3連接酶介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)，將類(lèi)泛素分子NEDD8共價(jià)結(jié)合到其下游底物蛋白[4]。Cullin蛋白通過(guò)Neddylation修飾促進(jìn)CRL活化。除了Neddylation修飾通路外，哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)還存在一種去除NEDD8修飾的CSN酶家族，最終能夠負(fù)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)CRL的活性[5]。目前尚不清楚這兩套酶系統(tǒng)是如何在不同生理或病理?xiàng)l件下通過(guò)協(xié)同或拮抗的方式來(lái)保證特定CRL對(duì)某一底物蛋白的有效降解。

3 CRL在腫瘤中的作用

CRL能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子、促癌蛋白、抑癌蛋白以及DNA復(fù)制相關(guān)蛋白等的降解，從而參與細(xì)胞周期、DNA 修復(fù)、信號(hào)傳導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄和胚胎發(fā)育等眾多重要生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控，其功能失調(diào)與細(xì)胞增殖失控、基因組非穩(wěn)定以及惡性腫瘤關(guān)系密切。目前，部分CRL的組成蛋白已被確認(rèn)是促癌基因(如SKP2等)，它們?cè)谀[瘤細(xì)胞內(nèi)往往發(fā)生基因擴(kuò)增或過(guò)量表達(dá)；雖然部分組成蛋白被發(fā)現(xiàn)具有抑癌作用(如FBXW7等)，但其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)多表現(xiàn)為突變。

3.1 Cullin蛋白

Cullin蛋白自身無(wú)生物學(xué)活性，其生物學(xué)功能依賴(lài)與其連接的底物識(shí)別亞基蛋白實(shí)現(xiàn)。目前臨床研究發(fā)現(xiàn)：cullin-1蛋白主要在肺癌組織過(guò)度表達(dá)[6]，cullin-4A則在乳腺癌、肝癌和腎癌等多種類(lèi)型的腫瘤組織呈現(xiàn)過(guò)度表達(dá)[7]。盡管cullin蛋白不是傳統(tǒng)意義上的促癌蛋白或抑癌因子，但其過(guò)度表達(dá)也能夠顯著提升腫瘤細(xì)胞CRL的生物活性，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。鑒于此，我們推測(cè)cullin-1蛋白和cullin-4A可能是有效的抗腫瘤治療靶點(diǎn)。

3.2 RBX1和RBX2

RBX1和RBX2在多種類(lèi)型的腫瘤組織中均高表達(dá)，通過(guò)RNA干擾技術(shù)或基因敲除的方法下調(diào)這兩類(lèi)蛋白表達(dá)的水平均能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，這種抑制效應(yīng)與腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡和(或)衰老有關(guān)[8]。與此結(jié)果相對(duì)應(yīng)的是，RBX2在腫瘤細(xì)胞內(nèi)過(guò)度表達(dá)能夠保護(hù)細(xì)胞免受外界應(yīng)激所誘發(fā)的細(xì)胞凋亡[9]。這些研究結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與存活依賴(lài)于胞內(nèi)RBX1和RBX2的表達(dá)。最近，我們通過(guò)動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，Rbx2基因被敲除后能夠顯著抑制肺部腫瘤的發(fā)展[10]，進(jìn)一步證實(shí)了RBX2基因在腫瘤發(fā)展中的促進(jìn)作用。由于RBX1或RBX2是構(gòu)成CRL催化核心的關(guān)鍵蛋白，通過(guò)靶向RBX1或RBX2的策略能夠抑制胞內(nèi)大部分CRL的活性，因此具有潛在的廣譜的抗腫瘤效果。

3.3 底物識(shí)別亞基蛋白(SRS)

在CRL復(fù)合物中，SRS主要起識(shí)別和招募底物蛋白的作用，但不同種類(lèi)的cullin蛋白采用不同類(lèi)型的SRS。迄今發(fā)現(xiàn)，人體至少編碼69種不同SRS，其中SKP2和β-TrCP已經(jīng)證明具有促癌功能。

3.3.1 SKP2 SKP2是SCFSKP2泛素連接酶復(fù)合體的底物識(shí)別亞基，能夠介導(dǎo)多種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白如p27、p21和 p57等的降解。大量研究證實(shí)，SKP2在胃癌、結(jié)腸癌以及白血病中高表達(dá)[11]，通過(guò)RNA干擾抑制SKP2的表達(dá)則能夠抑制多種類(lèi)型腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[12]。對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)度表達(dá)SKP2可以導(dǎo)致低程度的前列腺腫瘤和白血病的發(fā)生[13]。盡管SKP2基因敲除的小鼠沒(méi)有產(chǎn)生顯著的生物學(xué)表型，但在p53、PTEN或Rb等經(jīng)典抑癌基因敲除驅(qū)動(dòng)產(chǎn)生的腫瘤模型中，SKP2基因的缺失能夠顯著抑制或完全消除腫瘤的發(fā)生[14]。鑒于SKP2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，美國(guó)的一個(gè)研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)高通量篩選方法獲得一個(gè)小分子化合物。該小分子化合物通過(guò)阻斷SKP2蛋白與SCFSKP2泛素連接酶之間的連接而抑制SCFSKP2泛素連接酶的活性。利用該化合物處理腫瘤細(xì)胞能夠?qū)е耂CFSKP2泛素連接酶底物p27發(fā)生積聚，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生周期G1期阻滯以及p27依賴(lài)的細(xì)胞殺傷作用。這些研究結(jié)果揭示了SKP2作為抗腫瘤治療靶點(diǎn)的潛力。

3.3.2 β-TrCP β-TrCP是SCFβ-TrC泛素連接酶的底物識(shí)別亞基，包括β-TrCP1和β-TrCP2兩種亞型。能夠調(diào)控胞內(nèi)眾多重要蛋白包括促癌蛋白和抑癌因子的泛素化降解[15]?；讦?TrCP底物的多樣性，β-TrCP到底是促癌因子還是抑癌因子往往取決于其所調(diào)節(jié)底物的性質(zhì)。目前已證實(shí)，β-TrCP能夠調(diào)節(jié)一系列抑癌蛋白，其在一些組織器官中具有明顯的促癌作用，例如通過(guò)轉(zhuǎn)基因小鼠模型過(guò)度表達(dá)β-TrCP1蛋白能夠誘導(dǎo)乳腺、腸道、肝臟和腎臟腫瘤的發(fā)生。與β-TrCP1促乳腺癌作用一致，β-TrCP1在乳腺癌組織中過(guò)量表達(dá)，通過(guò)抑制β-TrCP1的表達(dá)能夠顯著提高乳腺癌和胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感性[16]，這些研究表明，β-TrCP具有作為腫瘤治療靶點(diǎn)的潛力。

4 CRL是一種新興的抗腫瘤治療靶點(diǎn)

開(kāi)展針對(duì)CRL腫瘤治療的思路最初源于蛋白酶體的相關(guān)研究。美國(guó)Millennium制藥公司開(kāi)發(fā)的蛋白酶體抑制劑Bortezomib于2003年獲準(zhǔn)臨床使用[17]。這一實(shí)例從臨床實(shí)踐層面證實(shí)了靶向泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是安全而有效的抗腫瘤方法，同時(shí)預(yù)示著該系統(tǒng)內(nèi)的其他關(guān)鍵酶也是潛在的靶點(diǎn)。最近Millennium制藥公司采用阻斷Neddylation通路的策略成功篩選了CRL的小分子抑制劑MLN4924。該化合物在本質(zhì)上是NEDD8活化酶E1的直接抑制劑，它能夠通過(guò)封閉NEDD8活化酶E1的活性位點(diǎn)并與NEDD8形成NEDD8-MLN4924復(fù)合物，導(dǎo)致NEDD8不能夠修飾cullin蛋白，從而間接抑制下游CRL的活性。研究發(fā)現(xiàn)，小分子抑制劑MLN4924對(duì)結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌以及白血病等多種臨床前模型均具有良好的抑制效果[18]。已經(jīng)證實(shí)，MLN4924的抑瘤效應(yīng)與其引起胞內(nèi)CRL底物蛋白的積聚密切相關(guān)。目前，MLN4924作為抗癌新藥正在美國(guó)接受人體Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)，顯示了良好的臨床應(yīng)用前景。

5 結(jié)論與展望

在提出CRL概念的近20年里，研究人員通過(guò)利用生物化學(xué)、遺傳學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)等研究技術(shù)持續(xù)不斷的努力，已經(jīng)初步闡明了CRL的具體功能及調(diào)控機(jī)制，為今后進(jìn)一步探索和開(kāi)發(fā)針對(duì)性的抗腫瘤新藥奠定了良好的基礎(chǔ)。鑒于CRL僅僅是UPS的組成部分，選擇性抑制CRL的腫瘤治療策略比靶向整個(gè)UPS所產(chǎn)生的毒副作用明顯降低。由于CRL參與調(diào)節(jié)多種與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的信號(hào)通路，單純抑制CRL可以起到同時(shí)抑制多種腫瘤相關(guān)信號(hào)通路的作用。這種治療策略比傳統(tǒng)的抑制單一信號(hào)通路的腫瘤治療方法更為高效。目前成功篩選的CRL抑制劑MLN4924是Neddylation通路的NAE直接抑制物，顯示出良好的應(yīng)用前景。但最近有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)MLN4924處理后可誘發(fā)部分細(xì)胞產(chǎn)生NAE點(diǎn)突變，這種誘發(fā)的突變能夠顯著降低MLN4924與NAE之間的親和力，從而導(dǎo)致該類(lèi)腫瘤細(xì)胞能夠逃避MLN4924對(duì)Neddylation通路的抑制作用而呈現(xiàn)對(duì)MLN4924治療的耐藥性[19-20]。這一發(fā)現(xiàn)給今后臨床開(kāi)展針對(duì)CRL的靶向治療提出了新的難題，同時(shí)也迫使我們?nèi)ヌ綄ば乱淮腃RL抑制劑，以克服MLN4924在未來(lái)臨床使用中所誘發(fā)的耐藥性。

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2016-08-08

2016-08-28

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81272469)

韋瓊(1992-)，女，安徽蕪湖人，在讀碩士研究生。E-mail:1534602112@qq.com

陳錦飛 E-mail:Chenjinfei2016@163.com

韋瓊，陳錦飛.Cullin-RINGE3泛素連接酶及其抑制劑在腫瘤治療中的研究進(jìn)展[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2017，36(1)：120-122.

R34

A

1671-6264(2017)01-0120-03

10.3969/j.issn.1671-6264.2017.01.031