沙門(mén)菌作為腫瘤藥物投遞系統(tǒng)的研究進(jìn)展

韋瓊，陳錦飛

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院/南京市第一醫(yī)院 腫瘤科，江蘇 南京 210006；2.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009)

·綜 述·

沙門(mén)菌作為腫瘤藥物投遞系統(tǒng)的研究進(jìn)展

韋瓊1,2，陳錦飛1

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院/南京市第一醫(yī)院 腫瘤科，江蘇 南京 210006；2.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009)

活細(xì)菌載體在腫瘤治療方面的應(yīng)用是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，其可作為化療藥物的增敏劑、抗腫瘤藥物的投遞結(jié)構(gòu)及基因治療的載體等。沙門(mén)菌本身作為兼性厭氧菌可以選擇性地定植在乏氧的實(shí)體瘤內(nèi)部，在體內(nèi)引發(fā)高效的細(xì)胞、體液及黏膜免疫反應(yīng)，從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。同時(shí)具有腫瘤靶向性的沙門(mén)菌經(jīng)過(guò)進(jìn)一步改造后成為在實(shí)體瘤內(nèi)產(chǎn)生和輸送治療性藥物的重要工具。目前減毒沙門(mén)菌可通過(guò)不同的途徑如細(xì)菌轉(zhuǎn)染、DNA疫苗、細(xì)菌介導(dǎo)的蛋白及RNAi轉(zhuǎn)運(yùn)等應(yīng)用于腫瘤治療。作者對(duì)沙門(mén)菌作為抗腫瘤藥物投遞系統(tǒng)的研究進(jìn)展作一綜述。

沙門(mén)菌；腫瘤治療；細(xì)菌轉(zhuǎn)染；DNA疫苗；文獻(xiàn)綜述

目前化療、放療仍然是惡性腫瘤治療的主要方法，但存在不能有效地靶向腫瘤組織、副作用大和臨床療效差等缺點(diǎn)。雖然有關(guān)腫瘤發(fā)生演變的分子機(jī)制研究取得了相當(dāng)大的進(jìn)步，新的治療方法也在不斷地發(fā)展，但目前絕大多數(shù)惡性腫瘤的治療效果仍不盡如人意。

19世紀(jì)人們首次觀察到腫瘤患者細(xì)菌感染后腫瘤生長(zhǎng)速度減緩的現(xiàn)象，部分腫瘤患者發(fā)生氣性壞疽后，體內(nèi)的腫瘤被抑制甚至消退。這一現(xiàn)象啟發(fā)了人們將細(xì)菌應(yīng)用于腫瘤治療的研究思路。沙門(mén)菌屬于侵襲性胞內(nèi)菌，通過(guò)Ⅲ型分泌系統(tǒng)介導(dǎo)它與宿主之間的反應(yīng)，這種機(jī)制使細(xì)菌的毒力因子能直接轉(zhuǎn)移到真核細(xì)胞內(nèi)[1]。沙門(mén)菌具有向宿主細(xì)胞投遞多種效應(yīng)基因及治療性蛋白等特性，為將其用作腫瘤藥物投遞系統(tǒng)提供了可能。近年來(lái)迅速發(fā)展的基因工程技術(shù)能將沙門(mén)菌的致病基因敲除后得到減毒菌株，目前研究較為透徹的減毒菌株如下：(1)VNP20009，源于沙門(mén)菌ATCC14028，為msbB和purl基因缺陷菌株[2]；(2)A1-R，由沙門(mén)菌ATCC14028改造的另一減毒菌株，為雙重營(yíng)養(yǎng)缺陷菌株，依賴(lài)外源性精氨酸和亮氨酸生存[3]；(3)CRC2631，由野生型沙門(mén)菌LT2改造的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，可在室溫條件下存活于瓊脂糖培養(yǎng)基中，同時(shí)可產(chǎn)生顯著的遺傳多樣性如基因缺失、復(fù)制及移碼等[4]。目前用于投遞的腫瘤藥物主要有治療性的DNA、RNA及蛋白質(zhì)等。作者就減毒沙門(mén)菌作為腫瘤藥物投遞系統(tǒng)的研究進(jìn)展作一綜述。

1 沙門(mén)菌作為腫瘤藥物投遞系統(tǒng)的研究

將具有治療作用的DNA、RNA或蛋白質(zhì)直接投遞到腫瘤細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)腫瘤治療，在腫瘤實(shí)驗(yàn)與臨床治療研究中具有重要意義。其中選擇合適的載體一直是腫瘤藥物投遞系統(tǒng)研究的重點(diǎn)。目前大多數(shù)研究著重于有著高轉(zhuǎn)染效率的病毒載體(如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等)[5]。然而病毒載體存在著安全性低、花費(fèi)高、生物活性低、DNA負(fù)荷量少及誘發(fā)免疫原性和細(xì)胞毒性困難等問(wèn)題。因此，應(yīng)運(yùn)而生許多新的投遞載體，其中包括細(xì)菌載體[6]。20世紀(jì)90年代，人們利用細(xì)菌作為載體成功地將真核表達(dá)質(zhì)粒投遞到腫瘤細(xì)胞內(nèi)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，梭狀芽胞桿菌、減毒單核細(xì)胞增多性李斯特桿菌、志賀菌、耶爾森菌、侵襲型大腸桿菌均可用作腫瘤藥物投遞系統(tǒng)。

沙門(mén)菌是一類(lèi)胞內(nèi)侵襲性革蘭陰性兼性厭氧菌，在有氧及乏氧環(huán)境中均可生存，其本身也是一種天然的免疫佐劑，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎性因子來(lái)增強(qiáng)機(jī)體的先天保護(hù)性免疫反應(yīng)。而在細(xì)菌作為腫瘤藥物投遞系統(tǒng)的研究中發(fā)現(xiàn)，沙門(mén)菌有以下幾個(gè)潛在的優(yōu)勢(shì)：(1)可以靶向多種腫瘤組織；(2)可在乏氧的腫瘤內(nèi)部生存，而在正常組織中少；(3)可以表達(dá)自殺基因如單純皰疹病毒胸苷激酶(herpes-simplex virus thymidine kinase gene，HSVtk)。野生型沙門(mén)菌不能直接用于腫瘤治療目的。小鼠黑色素瘤模型中，荷瘤小鼠在注射治療劑量的野生型沙門(mén)菌后盡管發(fā)現(xiàn)細(xì)菌在腫瘤組織內(nèi)富集，但最終因毒性大導(dǎo)致小鼠死亡。此外，單純使用具有高侵襲性的減毒沙門(mén)菌突變株雖然仍具有腫瘤靶向性，但免疫原性大大降低，從而極大地削弱了其腫瘤殺傷作用。而將包含HSK-tk基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至減毒沙門(mén)菌后接種荷瘤小鼠，同時(shí)給予抗病毒藥物更昔洛韋治療，結(jié)果顯示，沙門(mén)菌抑制腫瘤生長(zhǎng)和延長(zhǎng)小鼠生存期的效果與更昔洛韋的劑量有相關(guān)性[7]。這些結(jié)果證實(shí)，沙門(mén)菌除了本身的抑瘤作用之外，其還作為抗腫瘤物質(zhì)的投遞系統(tǒng)。

2 減毒沙門(mén)菌作為腫瘤藥物投遞系統(tǒng)的應(yīng)用

2.1 腫瘤蛋白表達(dá)放大治療(tumor amplified protein expression therapy，TAPET)

TAPET最早由Vion Pharmaceutical公司提出[8]，即利用減毒沙門(mén)菌菌株作為細(xì)菌載體或運(yùn)載工具將抗腫瘤藥物投遞至實(shí)體瘤內(nèi)。經(jīng)證實(shí)，減毒沙門(mén)菌可富集在腫瘤組織內(nèi)，其濃度至少為正常組織內(nèi)的200倍，甚至可達(dá)1000倍[9]。同時(shí)基礎(chǔ)毒理學(xué)研究表明，減毒沙門(mén)菌具有良好的安全性，其無(wú)法改變感染細(xì)胞基因組，且對(duì)普通抗生素十分敏感。利用基因工程技術(shù)改造后的沙門(mén)菌可在腫瘤組織內(nèi)表達(dá)多種抗腫瘤蛋白、基因及基因表達(dá)產(chǎn)物。TAPET另一個(gè)重要的特性是減毒沙門(mén)菌定植在腫瘤組織內(nèi)，依賴(lài)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的DNA或者蛋白質(zhì)生存。這一特性可使得沙門(mén)菌逃避機(jī)體免疫監(jiān)測(cè)，增強(qiáng)TAPET抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力，同時(shí)又保證其僅在腫瘤細(xì)胞內(nèi)持續(xù)投遞抗腫瘤藥物。

美國(guó)國(guó)家癌癥研究所(National Cancer Institute，NCI)進(jìn)行的Ⅰ期臨床試驗(yàn)證實(shí)，進(jìn)展期腫瘤患者可以通過(guò)靜脈注射TAPET獲益。同時(shí)進(jìn)一步研究表明，TAPET與放療聯(lián)合使用可以增強(qiáng)療效。在多種小鼠腫瘤模型中聯(lián)合使用VNP20009和其他腫瘤治療方法正是時(shí)下研究的熱點(diǎn)。

2.2 細(xì)菌轉(zhuǎn)染

細(xì)菌轉(zhuǎn)染是一種利用細(xì)菌直接將基因傳遞至靶生物、靶器官或靶組織內(nèi)的方法[10]。在腫瘤治療中，構(gòu)建受真核啟動(dòng)子調(diào)控并且編碼治療基因的質(zhì)粒，利用細(xì)菌將其傳遞至腫瘤細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)細(xì)菌感染細(xì)胞，該質(zhì)粒被釋放至細(xì)胞質(zhì)中，后轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核隨宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。

以沙門(mén)菌作為真核表達(dá)質(zhì)粒的載體進(jìn)行腫瘤免疫治療已經(jīng)得到廣泛的研究，即由沙門(mén)菌介導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移抗腫瘤質(zhì)粒[11]。在一項(xiàng)研究中，經(jīng)過(guò)基因工程改造后的沙門(mén)菌攜帶有編碼人內(nèi)皮抑制素基因的真核表達(dá)質(zhì)粒。通過(guò)沙門(mén)菌將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至腫瘤細(xì)胞后，人內(nèi)皮素的表達(dá)特異性地抑制了腫瘤組織侵襲，同時(shí)觀察到腫瘤微血管密度降低導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)抑制[12]。相同的方法可以將多種細(xì)胞因子如IL-12、GM-CSF、IL-4 及IL-18等轉(zhuǎn)染至腫瘤細(xì)胞內(nèi)，均產(chǎn)生不同程度的抑瘤作用。此外，口服包含編碼CD40配體基因的鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤有著顯著的治療效果。除了轉(zhuǎn)染特定的抗腫瘤質(zhì)粒外，細(xì)菌轉(zhuǎn)染的方法可通過(guò)近似自然感染的黏膜途徑進(jìn)行免疫，同時(shí)沙門(mén)菌本身具有多種病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)，是天然免疫佐劑，容易誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的固有免疫應(yīng)答。該方法兼?zhèn)漯つっ庖吆虳NA疫苗的雙重優(yōu)點(diǎn)。

2.3 DNA疫苗

DNA疫苗指的是基因疫苗，即將編碼外源性抗原的基因插入到含真核表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒上，然后將質(zhì)粒直接導(dǎo)入人或動(dòng)物體內(nèi)，讓其在宿主細(xì)胞中表達(dá)抗原蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答[13]。

目前，多數(shù)DNA疫苗的抗腫瘤研究是利用減毒鼠傷寒沙門(mén)菌作為載體的[14]。在動(dòng)物惡性黑色素瘤、腸癌、腦膠質(zhì)瘤及肺癌模型中，口服含抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGFR-2)的沙門(mén)菌DNA疫苗，可以有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)。類(lèi)似的抗腫瘤效應(yīng)同樣產(chǎn)生于含細(xì)胞因子IL-18、凋亡抑制素等DNA疫苗。研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)DNA疫苗通過(guò)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[15]。因此，從腫瘤抗原中篩選出主要的T細(xì)胞抗原表位將是接下來(lái)DNA疫苗研發(fā)的重點(diǎn)。

2.4 細(xì)菌介導(dǎo)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)

細(xì)菌介導(dǎo)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)即利用轉(zhuǎn)基因細(xì)菌向宿主轉(zhuǎn)運(yùn)治療性蛋白，是細(xì)菌在腫瘤治療應(yīng)用中的新進(jìn)展。與細(xì)菌轉(zhuǎn)染和DNA疫苗方法不同，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)最大的優(yōu)勢(shì)在于細(xì)菌可以在靶組織內(nèi)持續(xù)存在，并且在原位不斷地產(chǎn)生治療性多肽。因此，在理想情況下，我們可以利用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的方法使某種抗腫瘤藥物持續(xù)作用于腫瘤組織。

基因介導(dǎo)酶前體藥物治療(gene directed enzyme prodrug therapy，GDEPT)就是利用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行抗腫瘤治療的重要手段[16]。GDEPT即向靶細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因，可激活特異性前體藥物成為細(xì)胞毒性產(chǎn)物從而發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞作用。GDEPT治療腫瘤主要分為兩個(gè)步驟：(1)外源性酶基因的投遞和在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的靶向性表達(dá)；(2)前體藥物的投遞，其可被轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤細(xì)胞內(nèi)的外源性基因編碼的酶激活為細(xì)胞毒性藥物。兩類(lèi)與細(xì)菌相關(guān)的前藥分別為可被細(xì)菌胞嘧啶脫氨酶活化的5-氟胞嘧啶和可被硝基還原酶激活的CB-1954。

在多項(xiàng)前期臨床模型中，減毒鼠傷寒沙門(mén)菌已經(jīng)成功地應(yīng)用于GDEPT，其中部分研究已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。Ⅰ期臨床試驗(yàn)中[17]，減毒鼠傷寒沙門(mén)菌成功地將胞嘧啶脫氨酶轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤細(xì)胞內(nèi)。這些研究證實(shí)，一定劑量的減毒鼠傷寒沙門(mén)菌可以安全地定植在腫瘤組織內(nèi)，但在臨床應(yīng)用中傳遞的蛋白似乎缺乏足夠的有效性。因此，蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)調(diào)控細(xì)菌表達(dá)治療性蛋白的能力成為GDEPT的關(guān)鍵部分。目前，在鼠傷寒沙門(mén)菌中成功地構(gòu)建了阿拉伯糖誘導(dǎo)的細(xì)菌啟動(dòng)子系統(tǒng)。該菌株通過(guò)靜脈注射可選擇性地富集在腫瘤組織內(nèi)，但僅有同時(shí)向靶細(xì)胞投遞阿拉伯糖才能誘導(dǎo)酶基因的表達(dá)。此外，利用細(xì)菌攜帶誘導(dǎo)性的自殺基因可以進(jìn)一步提高治療性基因的外源性調(diào)控。

2.5 細(xì)菌介導(dǎo)的RNAi轉(zhuǎn)運(yùn)

細(xì)菌介導(dǎo)的RNAi轉(zhuǎn)運(yùn)是一種新型的抗腫瘤療法，其聯(lián)合了兩種獨(dú)立的治療方法即細(xì)菌療法和RNAi[18]。RNAi是由雙鏈RNA引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)、調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制。細(xì)菌作為通用的基因投遞載體已被證實(shí)可將RNAi成功地轉(zhuǎn)運(yùn)至哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)[19]。目前，構(gòu)建包含編碼抗STATA3、MDR1以及凋亡抑制蛋白Bcl-2 shRNA的真核表達(dá)質(zhì)粒，分別在小鼠前列腺癌、舌癌及黑色素瘤模型中，利用鼠傷寒沙門(mén)菌將其投遞至腫瘤細(xì)胞內(nèi)，均產(chǎn)生不同程度的抗腫瘤效果[20]。細(xì)菌介導(dǎo)的RNAi轉(zhuǎn)運(yùn)為腫瘤的治療提供了新思路，其應(yīng)用需要進(jìn)行更多的研究。

3 小 結(jié)

利用細(xì)菌作為抗腫瘤藥物投遞系統(tǒng)，將具有治療作用的基因、蛋白或RNA投遞至腫瘤細(xì)胞內(nèi)是新的腫瘤治療途徑。減毒沙門(mén)菌作為良好的腫瘤藥物投遞系統(tǒng)已經(jīng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床Ⅰ、Ⅱ期試驗(yàn)中取得了較好的效果。但目前細(xì)菌的抗腫瘤治療尚處于摸索階段，許多在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中觀察到的結(jié)果無(wú)法在人體上復(fù)制，其臨床應(yīng)用還存在諸多問(wèn)題，如沙門(mén)菌如何高效地轉(zhuǎn)移至人腫瘤組織內(nèi)部和進(jìn)入靜止期腫瘤細(xì)胞、如何有效地減輕人體對(duì)重組載體的免疫作用，以及如何有效地與其他治療方法聯(lián)合使用等，而這些問(wèn)題正是接下來(lái)需要探究的重點(diǎn)。

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2016-07-24

2016-08-25

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81272469)

韋瓊(1992-)，女，安徽蕪湖人，在讀碩士研究生。E-mail:1534602112@qq.com

陳錦飛 E-mail:chenjinfei2016@163.com

韋瓊，陳錦飛.沙門(mén)菌作為腫瘤藥物投遞系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2017，36(1)：113-116.

R34

A

1671-6264(2017)01-0113-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2017.01.029