星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化知母總皂苷提取工藝

孫士林(西北民族大學(xué) 化工學(xué)院， 甘肅 蘭州 730030)

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化知母總皂苷提取工藝

孫士林(西北民族大學(xué) 化工學(xué)院， 甘肅 蘭州 730030)

目的：采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化知母總皂苷提取工藝。方法：以知母皂苷元為指標(biāo)，選取乙醇作為提取溶劑，以乙醇濃度、固液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)為自變量，知母總皂苷提取效率為因變量，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法對(duì)知母總皂苷提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果：確定了知母總皂苷提取最佳條件：乙醇濃度70%、固液比1:6、提取時(shí)間75分鐘、2次提取為最優(yōu)條件。結(jié)論：該工藝可用于知母總皂苷提取，工藝流程簡(jiǎn)單，預(yù)測(cè)性好。

知母；響應(yīng)面法；星點(diǎn)設(shè)計(jì)；知母總皂苷；提取工藝

中 藥 知 母 為 百 合 科 植 物 知 母(Anemarrhenaasphodeloides Bge.)的干燥根莖，史載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有清熱瀉火、生津潤(rùn)燥的功效，用于治療溫?zé)岵。盁峥菏?、壯熱、煩渴[1]。知母為常用大宗“道地”中藥材,產(chǎn)自河北歷縣，習(xí)稱(chēng)“西陵知母”。知母根莖中含大量甾體皂苷，已分離鑒定出多種皂苷。知母總皂苷元能明顯降低衰老小鼠腦β受體cAMP系統(tǒng)的反應(yīng)性，重現(xiàn)知母的下調(diào)作用，是由知母藥材經(jīng)水解提取精制而成[2]。目前對(duì)知母的利用基本上停留在作為處方藥材進(jìn)行簡(jiǎn)單的丸劑、散劑、制劑加工，對(duì)于其中有效成分知母總皂苷元的提取、純化以及加工利用程度還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

知母總皂苷提取工藝的工業(yè)化生產(chǎn)有深遠(yuǎn)的意義,深圳太太藥業(yè)股份有限公司近年已將知母皂苷元開(kāi)發(fā)成為一個(gè)中藥二類(lèi)新藥，主要治療現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中老年癡呆癥和學(xué)習(xí)、記憶減退或某些性格改變等腦功能減退癥狀，因此,就目前而言，知母總皂苷提取方法有：大孔樹(shù)脂吸附法母制劑[3]、水解法[4]、膜分離法[5]以及溶劑提取法，前四種方法雖然相對(duì)溶劑提取法而言有提取效率高、純度大的優(yōu)點(diǎn)但其成本造價(jià)太高、操作相對(duì)繁瑣不適宜工業(yè)生產(chǎn)采用，因此溶劑提取法仍然作為現(xiàn)如今知母皂苷生產(chǎn)常用方法。知母皂苷化合物分子量較大,易溶于熱水、乙醇等極性溶劑[6]，就知母皂苷提取而言，知母皂苷受提取條件影響大，故而篩選出最優(yōu)條件對(duì)知母皂苷生產(chǎn)有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)對(duì)知母總皂苷提取工藝外部條件進(jìn)行篩選，再結(jié)合Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行電腦模擬預(yù)測(cè)，回歸現(xiàn)實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，篩選出知母總皂苷提取條件，為知母的開(kāi)發(fā)及工業(yè)化提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

西陵知母(產(chǎn)自河北易縣)，知母皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品(含量98%，購(gòu)自上海譜振生物科技有限公司，批號(hào)：ZY161102)，乙醇、甲醇、香草醛、高氯酸、冰醋酸等均為國(guó)產(chǎn)市售AR級(jí)試劑。

1.2 儀器

電子分析天平(FA1204B上海精科)，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Heλiosβ 美國(guó)熱電)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52C 常州諾基)，水浴鍋。

2 方法與結(jié)果

2.1 知母總皂苷含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照溶液制備

取知母皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品適量，加甲醇定容至50ml棕色容量瓶留用。

2.1.2 供試品溶液制備

取干燥知母根莖，粉碎，過(guò)20目藥篩，取10g知母粉，加入60ml70%乙醇，精密稱(chēng)重并于60℃水浴回流提取1h，補(bǔ)足重量，提取液過(guò)濾，取10ml濃縮至干，取分析純?nèi)軇┤芙獠⒍ㄈ葜?00ml容量瓶。于10ml容量瓶中添加0.2ml高氯酸、0.8ml5%香草醛-冰醋酸溶液，以上述溶液進(jìn)行定容，60℃恒溫水浴顯色20min，取出立即冰浴5min，靜置10min，于430nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度A。

2.1.3 最大吸收波長(zhǎng)的確定[3]

精密吸取2.1.1中知母皂苷元對(duì)照溶液，采用2.1.2中顯色方法進(jìn)行顯色，以試劑為空白對(duì)照，在200-1000nm波長(zhǎng)范圍掃描，結(jié)果為430nm處吸光度最大，故以430nm為最大吸收波長(zhǎng)。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備[4]

精密移取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml于10ml容量瓶，按照2.1.2顯示方法進(jìn)行顯色，以無(wú)水甲醇進(jìn)行定容。以無(wú)水甲醇按照上述方法進(jìn)行顯色最為對(duì)照。于430nm波長(zhǎng)處測(cè)定紫外吸收。標(biāo)準(zhǔn)品加入量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一樣品按照2.1.3進(jìn)行操作，每隔10min測(cè)定一次，結(jié)果表明在30min內(nèi)同一樣品測(cè)定結(jié)果基本穩(wěn)定。

2.1.6 精密度試驗(yàn)

取5份同一樣品，按2.1.2操作方法進(jìn)行紫外吸收測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定其RSD值為1.0%，結(jié)果表明本方法精密度好。

2.1.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

按2.1.2操作平行制備5份樣品，每份吸取1.0ml，測(cè)定紫外，RSD值為1.1%，表明重現(xiàn)性好。

2.1.8 回收實(shí)驗(yàn)

取已知知母總皂苷含量的知母粉5份，每份10g，分別加入適量知母皂苷元對(duì)照品，進(jìn)行回流提取，濾液定容至10ml容量瓶。按2.1.2處理，并且顯色。結(jié)果顯示知母總皂苷的平均加樣回收率為98.2%。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 提取溶劑濃度對(duì)知母總皂苷提取的影響

按照2.1.2操作，分別取溶劑濃度50%、60%、70%、80%、90%，固液比1:6，提取1次，提取60min，并按照2.1.2顯色、測(cè)定紫外吸收。

測(cè)定結(jié)果如圖1所示，通過(guò)圖一可以看出當(dāng)乙醇濃度上升時(shí)，知母總皂苷提取率上升，當(dāng)上升到一定程度時(shí)開(kāi)始下降，最適濃度為70%，此時(shí)知母總皂苷提取效果最優(yōu)，提取率為64.2mg/g。

圖1 乙醇濃度對(duì)提取率影響

2.2.2 固液比對(duì)知母總皂苷提取的影響

選取乙醇濃度70%，提取時(shí)間為60min，提取一次，固液比分別取1:3、1:4,、1:5、1:6、1:7、1:8、1:10，按照2.1.2操作進(jìn)行提取以及顯色。測(cè)定知母總皂苷提取率，隨著固液比的上升，知母總皂苷提取效果呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)固液比1:6時(shí)，知母總皂苷提取率隨著固液比增加提取效果變化最大。當(dāng)固液比超過(guò)1:6時(shí)，知母總皂苷提取效果變化趨勢(shì)不大，從節(jié)約成本考慮，固液比1:6為最適固液比。

2.2.3 提取次數(shù)對(duì)知母總皂苷提取影響

選取乙醇濃度70%、固液比1:6，提取時(shí)間為60min，提取次數(shù)分別為1、2、3、4、5次，按2.1.2操作進(jìn)行處理及顯色。測(cè)定知母總皂苷提取率，隨著提取次數(shù)的增加，知母總皂苷提取效果在1到2次時(shí)變化最為明顯，在3次以后變化趨勢(shì)不明顯，故而可以認(rèn)定提取次數(shù)為2次時(shí)知母總皂苷提取效率最優(yōu)。

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)知母總皂苷提取影響

選取乙醇濃度70%、固液比1:6，提取次數(shù)2次，提取時(shí)間分別為30、60、90、120、150min，按2.1.2進(jìn)行處理及顯色操作。測(cè)定知母總皂苷提取率，隨著提取時(shí)間的增加，知母總皂苷提取效果相對(duì)應(yīng)產(chǎn)生變化，在提取時(shí)間大約為80min時(shí)，知母總皂苷提取效果達(dá)到最大，當(dāng)提取時(shí)間再次增加時(shí)，提取效率反而下降。因此確定知母總皂苷提取時(shí)間80min最佳。

圖3 提取次數(shù)與提取率

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化知母總皂苷提取率

根據(jù)星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取提取溶劑濃度、提取次數(shù)、提取時(shí)間為三個(gè)考察因素，以知母總皂苷提取率為因變量，以Design-Expert 8.0.6軟件實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的三因素三水平實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行研究。

表2 實(shí)驗(yàn)因素水平編碼

圖4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.1 模擬方程建立及方差分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)上表數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，得回歸方程：Y=-351.48733+6.52578*X1+132.86326X2 +2.12981*X3-0.29400*X1X2--003*X1 *X3+0.021960*X2*X3-0.032937* X12-25.30811* X22-003*X32。其中，方程中各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性可從F檢驗(yàn)，prod>F值越小，則相應(yīng)的顯著程度越好。

2.3.2 工藝參數(shù)優(yōu)化與預(yù)測(cè)

根據(jù)響應(yīng)面軟件實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所得結(jié)果計(jì)算出最佳提取工藝條件：乙醇濃度70%，提取次數(shù)2次，提取時(shí)間75min。(分析結(jié)果見(jiàn)附圖)

2.3.3 實(shí)際驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面軟件預(yù)測(cè)結(jié)果，進(jìn)行5次最佳條件下的提取驗(yàn)證，結(jié)果表明，知母總皂苷提取率達(dá)到150.337mg/g，相比于預(yù)測(cè)結(jié)果降低1.231%，表明結(jié)果達(dá)到模型預(yù)測(cè)效果。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)提取溶劑濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)、固液比單因素對(duì)知母總皂苷提取率影響的考察，確定主要影響因素，利用Desig Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行試驗(yàn)預(yù)測(cè)，通過(guò)實(shí)際驗(yàn)證確定了知母總皂苷最佳提取工藝：乙醇濃度70%，提取兩次，提取75min為最佳提取條件，單因素實(shí)驗(yàn)確定了最佳固液比1:6。整個(gè)提取工藝流程簡(jiǎn)單，提取率高，可為后續(xù)知母產(chǎn)業(yè)工業(yè)化提供理論依據(jù)。

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附圖