HPLC-Q-TOF法篩查雞肉中48種獸藥殘留

孫清榮，郭禮強(qiáng)，張金玲，劉永強(qiáng)

（1.山東科技職業(yè)學(xué)院，山東濰坊261053；2.濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東濰坊261041）

HPLC-Q-TOF法篩查雞肉中48種獸藥殘留

孫清榮1，郭禮強(qiáng)2，張金玲2，劉永強(qiáng)2

（1.山東科技職業(yè)學(xué)院，山東濰坊261053；2.濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東濰坊261041）

利用高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS）建立了雞肉中48種獸藥殘留的快速篩查和檢測方法。樣品采用乙腈/水（7∶3，體積比）提取，經(jīng)OasisPRiMEHLB固相萃取柱凈化，采用UPLC-Q-TOF/MS檢測，正離子全信息串聯(lián)質(zhì)譜模式掃描，外標(biāo)法定量。建立了目標(biāo)分析物一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫和譜圖庫，通過化合物的精確質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間等對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行檢索，從而在無對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品的情況下可以對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行定性鑒定。結(jié)果表明，雞肉中48種獸藥的定量限（LOQ，S/N=10）為3.0μg/kg～30μg/kg，在3.0μg/L～300μg/L范圍呈良好線性，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99。該方法靈敏、簡便、準(zhǔn)確，可用于雞肉中多種獸藥殘留的檢測分析。

飛行時(shí)間質(zhì)譜；高效液相色譜；獸藥；雞肉；多殘留

獸藥廣泛的應(yīng)用于肉雞養(yǎng)殖業(yè)中，一定量的使用可以預(yù)防和治療動(dòng)物疾病，減少養(yǎng)殖企業(yè)的損失，但是若違法添加、使用不當(dāng)或過量使用會(huì)引起雞肉組織中藥物過度殘留，并通過食物鏈進(jìn)入人體，導(dǎo)致人體產(chǎn)生抗藥性、過敏反應(yīng)等，獸藥殘留嚴(yán)重的甚至誘導(dǎo)疾病的發(fā)生，從而危害消費(fèi)者健康。因此，評(píng)估和監(jiān)管常用獸藥在雞肉制品中的藥物殘留對(duì)保護(hù)消費(fèi)者的權(quán)益和食品安全具有積極意義。

目前對(duì)獸藥殘留的檢測方法主要為液相色譜法[1]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[2-6]。雞肉基質(zhì)比較復(fù)雜，隨著食品安全越來越嚴(yán)厲的監(jiān)管需求，以及獸藥殘留標(biāo)準(zhǔn)的完善和限量要求越來越低，液相色譜法的靈敏度、通量和限量已經(jīng)不能滿足檢測需求，而液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜具有更高的靈敏度和選擇性，使其更適于多獸藥殘留同時(shí)檢測和微量殘留分析。四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜屬于高分辨質(zhì)譜，具有質(zhì)量范圍廣，質(zhì)量精度和分辨率高、分析全面等優(yōu)點(diǎn)，可根據(jù)化合物準(zhǔn)分子離子的精確分子質(zhì)量對(duì)其進(jìn)行定性分析，極大的提高了復(fù)雜背景下的抗干擾能力，而質(zhì)譜獲得的全掃描譜圖可以用于建立化合物質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，因此能夠在不使用標(biāo)準(zhǔn)品的情況下通過已有數(shù)據(jù)庫對(duì)未知樣品中的化合物進(jìn)行定性判斷[7-9]。目前國內(nèi)使用高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測雞肉中獸藥的報(bào)道較少，因此，其方法的開發(fā)利用在動(dòng)物源性食品獸藥殘留檢測方面具有良好的應(yīng)用前景。

本試驗(yàn)以雞肉為研究對(duì)象，以O(shè)asisPRiMEHLB固相萃取柱為凈化手段，采用液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜同時(shí)檢測雞肉中多種藥物殘留，并建立了其質(zhì)譜篩查庫。本方法具有快速、高效、準(zhǔn)確和高通量等特點(diǎn)，為食品質(zhì)量安全的監(jiān)控提供了新的檢測技術(shù)選擇。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent1260-G6530高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀[配電噴霧離子源（ESI）]：美國Agilent公司；5810R型離心機(jī)：Eppendorf公司；N-EVAP氮吹儀：Organomation Associates公司；Milli-Q純水機(jī)：美國Millipore公司；AE163天平：瑞士Mettler公司；T25均質(zhì)器、MS1振蕩器：德國IKA公司；5mL一次性注射器；0.22μm針頭過濾器。

Sulfaphenazole（磺胺苯吡唑）、Sulfabenzamide（磺胺苯酰）、Sulfanilacetamide（磺胺醋酰）、Sulfamoxol（磺胺惡唑）、Sulfamethazine（磺胺二甲基嘧啶）、Sulfamethoxazole（磺胺甲惡唑）、Sulfamethizole（磺胺甲二唑）、Sulfamethoxypyridazine（磺胺甲氧噠嗪）、Sulfameter（磺胺甲氧嘧啶）、Sulfamerazine（磺胺甲嘧啶）、Sulfamonomethoxine（磺胺間甲氧嘧啶）、Sulfochlorpyridazine（磺胺氯噠嗪）、Sulfisomidine（磺胺索嘧啶）、Sulfisoxazole（磺胺異惡唑）、Sulfapyridine（磺胺吡啶）、Sulfaquinoxaline（磺胺喹噁啉）、Sulfadiazine（磺胺嘧啶）、Sulfathiazole（磺胺噻唑）、Sulfaguanidine（磺胺脒）、Sulfadimethoxine（磺胺二甲氧嘧啶）、Sulfisomidine（磺胺二甲基異嘧啶）、Trimethoprim（甲氧芐啶）、Sulfadione（氨苯砜）、Oxolinic acid噁喹酸）、Danofloxacin（達(dá)氟沙星）、Triamcinolone acetodide（曲安奈德）、Flumequine（氟甲喹）、Ciprofloxacin（環(huán)丙沙星）、Lomefloxacin（洛美沙星）、Chloramphenicol（氯霉素）、Norfloxacin（諾氟沙星）、Pefloxacin（培氟沙星）、Sarafloxacin（沙拉沙星）、Cinoxacin（西諾沙星）、Ofloxacin（氧氟沙星）、Enoxacin（伊諾沙星）、Nalidixic acid（萘啶酸）、Orbifloxacin（奧比沙星）、Dexamethasone（地塞米松）、Methylprednisolone（甲基潑尼松龍）、Cortisone（可的松）、Cefotaxime（頭孢噻肟）、Hydrocortisone（氫化可的松）、Prednisolone（潑尼松龍）、Amantadine（金剛烷胺）、Penicillin V（青霉素V）、Ampicillin（氨芐青霉素）、Amoxicillin（阿莫西林）：購于德國Dr.Ehrenstorfer公司。

甲醇、乙酸乙酯、乙腈和甲酸（色譜純）：美國Biopure公司。

1.2 樣品處理

取絞碎雞肉樣品2.0g，加入70%乙腈水溶液10mL，均質(zhì)器均質(zhì)1min，10 000 r/min高速離心10min，取全部上清液直接加載到PRiMEHLB固相萃取柱，控制流速在1min 3mL，并用1mL乙腈沖洗萃取柱，收集全部流出液，加入10mL甲醇混勻，30℃水浴氮?dú)獯蹈?，用乙腈水?0∶30，體積比）1mL定容后過0.22μm濾膜后經(jīng)質(zhì)譜檢測。

1.3 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.3.1 液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1mm×100mm，1.7μm）。流動(dòng)相A：水/乙腈/甲酸（900∶99∶1，體積比）加5mmol乙酸銨。流動(dòng)相B：乙腈/甲酸（999∶1，體積比）。梯度洗脫程序：0→2.0min，5%B；2.0min→10.0min，5%B→80%B；10.0min→16.0min，80%B→95%B；16.0min→17.0min，95%B→5%B；平衡5.0min。進(jìn)樣體積：10μL。流速：0.3mL/min。參比質(zhì)量：質(zhì)量范圍（M/ Z）121.050 9和922.009 8。

1.3.2 質(zhì)譜條件

霧化器溫度：350℃；干燥器流量：10 L/min；噴霧器壓力：315 000Pa；離子極性：正離子；數(shù)據(jù)儲(chǔ)存方式：柱狀圖；電壓：4 000V。

1.4 建立篩查庫

[7]，配制濃度為1mg/L的獸藥標(biāo)準(zhǔn)品，在不同碰撞能量下分別對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行測定，采集二級(jí)譜圖庫所需數(shù)據(jù)，建立目標(biāo)化合物一級(jí)質(zhì)譜全掃描篩查庫。通過庫檢索，以目標(biāo)化合物的一級(jí)質(zhì)譜精確分子量、保留時(shí)間、同位素豐度匹配、特征離子等信息進(jìn)行定性分析。

表1 分析物的質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間Table1 MS/MS parameters and retention times of analytes

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

所測定的48種獸藥質(zhì)荷比在152～460，化學(xué)性質(zhì)相差較大，要達(dá)到良好分離比較困難，尤其是分子式相同或結(jié)構(gòu)式相近化合物，且有相近或相同的碎片離子，出峰時(shí)間不合適易造成譜圖干擾，影響譜庫檢索時(shí)化合物定性的判斷。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為甲醇-水（各含0.1%甲酸）時(shí)，磺胺類化合物的峰形不好，分離度達(dá)不到要求。參考文獻(xiàn)[6]，調(diào)整流動(dòng)相為乙腈-水，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)確定了“1.2”所述流動(dòng)相比例以及梯度洗脫方法，應(yīng)用該方法時(shí)基線平穩(wěn)，各組分能較好分離，化合物的二級(jí)譜圖無干擾且響應(yīng)值高。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

高分辨質(zhì)譜檢測流程簡單高效，非常適合做目標(biāo)分析物和未知樣品的篩查，對(duì)于已知化合物可通過標(biāo)準(zhǔn)品建立化合物的一級(jí)和二級(jí)譜圖庫，從而通過樣品質(zhì)譜掃描后分子式查找，原始數(shù)據(jù)提取，譜庫比對(duì)結(jié)果，直接對(duì)化合物定性、定量，從而大大提高工作效率。將目標(biāo)化合物分別配制成質(zhì)量濃度為10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用Q-TOF進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集，以環(huán)丙沙星（精確m/z為332.140 8）為例，圖1為全掃描下環(huán)丙沙星經(jīng)過譜庫檢索獲得的質(zhì)譜圖，通過譜庫檢索，可以初步推斷化合物的名稱、結(jié)構(gòu)式等。統(tǒng)計(jì)48種物質(zhì)的保留時(shí)間和質(zhì)譜信息（見表1），建成質(zhì)譜庫，包含保留時(shí)間、母離子、子離子等。

2.3 樣品提取條件的選擇

圖1 環(huán)丙沙星提取離子流圖Fig.1 High resolution extracted ion chromagograms of Ciprofloxacin

雞肉基質(zhì)干擾較多，若直接采用提取液提取禽肉中的目標(biāo)分析物，樣品中的脂肪、蛋白質(zhì)等會(huì)干擾目標(biāo)分析物在質(zhì)譜上的檢測，同時(shí)減少色譜柱的壽命。目前，國內(nèi)外在動(dòng)物源性食品中多種獸藥殘留的提取和凈化方法已有較多報(bào)道，萃取溶劑主要是乙腈[10-11]和甲醇[12]。試驗(yàn)考察了乙腈和甲醇對(duì)提取回收率的影響，結(jié)果表乙腈比甲醇有更好的去蛋白能力，回收率要比后者平均高5%以上。阿莫西林屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，極性偏高，過酸過堿溶液均不穩(wěn)定，若僅用乙腈提取回收率偏低，試驗(yàn)考察了不同體積比的乙腈水對(duì)回收率的影響，最終確定70%的乙腈水回收率最好。過凈化柱的溶液因?yàn)楹屑s30%的水，氮?dú)獠蝗菀状蹈汕視r(shí)間過長，影響目標(biāo)分析物的回收率，通過多次驗(yàn)證，試驗(yàn)中在凈化液中添加10mL甲醇混勻后氮吹，可以提高氮吹速度兩倍以上，降低了氮吹過程中目標(biāo)分析物的損失。

2.4 線性關(guān)系、檢出限與定量下限

根據(jù)目標(biāo)分析物在質(zhì)譜中響應(yīng)的強(qiáng)弱，配制不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（用空白雞肉提取液配制）進(jìn)行測定，以各化合物峰面積的平均值（Y）對(duì)其質(zhì)量濃度（X，μg/L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.99。參照標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度，通過在雞肉基質(zhì)中添加混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以信噪比（S/N）為3確定方法的檢測限（LOD），以信噪比（S/N）為10確定方法的定量下限（LOQ），48種獸藥的LOD在1.0μg/L～10μg/L之間，LOQ在3.0μg/L～30μg/L之間。48種獸藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量下限見表2。

2.5 實(shí)際樣品的測定

采用本方法對(duì)20份市場購買的雞肉樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一份雞肉樣品中檢出磺胺二甲氧嘧啶，含量為10.1μg/kg，為了檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們引用質(zhì)檢總局行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3155-2012《出口豬肉、蝦、蜂蜜中多類藥物殘留量的測定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》對(duì)陽性樣品進(jìn)行驗(yàn)證，檢測結(jié)果為10.3μg/kg，與篩查檢測結(jié)果比較吻合，結(jié)果見圖2。

表2 48種獸藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限與定量下限（n=6）Table2 Linear relationships，correlation coefficients（r），linear ranges，LODs and LOQs of 48 veterinary drugs（n=6）

圖2 陽性雞肉樣品譜庫檢索結(jié)果Fig.2 The search result to library of spectrogram for positive samples in chicken

3 結(jié)論

本文利用固相萃取凈化柱，結(jié)合液相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù)，建立了同時(shí)測定雞肉中48種獸藥殘留的分析方法。本方法快速、簡便、高效，適用于雞肉中獸藥的快速定性篩查。

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Screening and Determination of 48 Veterinary Drug Residues in Chicken by High Performance Liquid Chromatography/Quadrupole Time of Flight Mass Spectrometry

SUN Qing-rong1，GUO Li-qiang2，ZHANG Jin-ling2，LIU Yong-qiang2
（1.Shandong Vocational College of Science and Technology，Weifang261053，Shandong，China；2.Weifang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Weifang261041，Shandong，China）

An analytical method was established for the simultaneous determination of 48 veterinary drug residues in chicken by high performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time of flight mass spectrometry（UPLC-Q-TOF/MS）.The samples was extracted with acetonitrile and water（7∶3，volume ratio），and determined by UPLC-Q-TOF/MS after cleaned-up by solid phase extraction with a Oasis PRiME HLB cartridge.The target compounds was quantified by external standard method with acquisition under positive ion mode was performed to obtain accurate relative molecular masses.A date base containing the accurate mass numbers and a library which contains the 48 veterinary drugs were established.According to the characteristics of accurate mass，retention time and so on，the qualitative identifications of48 veterinary drugs were accomplished without the contrast of standard substances.The results showed that the calibration curves were linear in the range of3.0μg/L-300μg/L for 48 veterinary drugs with correlation coefficient（r）more than 0.99.The lim its of quantitation（LODs，S/N=10）were in the range of3.0μg/kg-30μg/kg.The method was sensitive，convenient and accurate，and could satisfy the demand of detection and analysis of veterinary drug residues in chicken.

time of flight mass spectrometry；high performance liquid chromatography；veterinary drug；chicken；multiresidue

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.027

2016-05-24

濰坊市2015年科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃（2015ZJ1101）；山東出入境檢驗(yàn)檢疫局科研基金項(xiàng)目（SK201420）

孫清榮（1970—），女（漢），副教授，碩士，主要研究方向：分析檢測。