纖維素酶輔助粉葛糖化工藝的研究

李妍，林文珍

（肇慶學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東肇慶526061）

纖維素酶輔助粉葛糖化工藝的研究

李妍，林文珍

（肇慶學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東肇慶526061）

在常規(guī)糖化工藝基礎(chǔ)上，添加纖維素酶輔助粉葛的糖化。采用單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)優(yōu)化得到纖維素酶解的最優(yōu)工藝條件為：纖維素酶用量為0.6%，酶解溫度為55℃，酶解時(shí)間為60min，最終糖化液的還原糖含量為8.312 g/100mL，未加纖維素酶處理的糖化液還原糖含量為7.385 g/100mL，說明纖維素酶處理能夠改善粉葛糖化的效果。

粉葛；糖化；纖維素酶；還原糖

粉葛是豆科植物甘葛藤的干燥根，主產(chǎn)于廣東、廣西，四川、云南等地亦產(chǎn)。粉葛口感佳，可藥食兩用，其功效在于解肌退熱、生津止渴、升陽止瀉[1]。新鮮粉葛中淀粉含量在20%～25%[2]，通過測定烘干至恒重后的廣州食用葛的淀粉含量為（35.46±1.379）%，可溶性糖含量為（16.70%±0.800）%[3]，粗纖維含量在4%～5%[4]。粉葛還含有多種人體必需的氨基酸和鐵、鈣、鋅等微量元素[5]及葛根素等黃酮類物質(zhì)[6]。以粉葛為原料進(jìn)行的開發(fā)研究主要包括粉葛全粉加工[7]、黃酮含量檢測[8]、不同產(chǎn)地成分對比[9]、重金屬和微量元素檢測[5，10]、貯藏[11]、葛根黃酒[12]、葛根醋飲料[13]研制等。對于粉葛淀粉的研究主要包括淀粉改性[14-15]、酶水解工藝[16]等。黃群等[16]研究了α-淀粉酶和糖化酶協(xié)同作用水解葛根淀粉分子，并建立了酶解動(dòng)力學(xué)模型。鐘紅蘭等[17]以超聲為輔助手段，利用中溫α-淀粉酶對葛根粉進(jìn)行酶解，通過此方法改善了葛根粉的溶解性。

常規(guī)的糖化工藝是采用α-淀粉酶和糖化酶進(jìn)行處理，為了有效利用粉葛中的淀粉和纖維素，本試驗(yàn)研究應(yīng)用纖維素酶輔助優(yōu)化粉葛的糖化工藝，提高粉葛的糖化效率，為進(jìn)一步開發(fā)利用粉葛資源提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

粉葛：市售，新鮮產(chǎn)品；α-淀粉酶（活力為2000U/g）、糖化酶（活力為10萬U/g，食品級）、纖維素酶（活力為2萬U/g，食品級）：均購自南寧龐博生物工程有限公司；食鹽：市售；檸檬酸（食品級）：購自南京松冠生物科技有限公司；碘、酒石酸鉀鈉（分析純）：上海展云化工有限公司；碘化鉀、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸銅（CuSO4· 5H2O）、次甲基藍(lán)、亞鐵氰化鉀：均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠；葡萄糖（分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器

XS-10B 500g多功能粉碎機(jī)：東莞布隆鑫機(jī)電公司；BS210S電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；DHG-9070B數(shù)顯電熱恒溫干燥箱：上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；HH-6恒溫水浴鍋：蘇州金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 方法

采用相同的液化和糖化工藝，通過加入纖維素酶進(jìn)行預(yù)處理，進(jìn)而提高糖化效果，對纖維素酶處理的工藝參數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化。

1.3.1 粉葛的預(yù)處理

粉葛粉制備工藝流程為：粉葛→清洗→去皮→切片→護(hù)色→烘干→粉碎→粉葛粉。

將粉葛切成長寬2 cm、厚度0.5 cm的小片狀，并在護(hù)色液（食鹽∶檸檬酸∶水=10∶1∶1 000，質(zhì)量比）浸泡20min～30min[7]，且粉葛片與護(hù)色液質(zhì)量比為1∶3。然后于60℃真空干燥，粉碎備用。

1.3.2 粉葛的糖化

稱取粉葛粉10 g于燒杯中，加入100mL水?dāng)嚢杈鶆?，配制?00 g/L的乳液，于85℃～100℃下攪拌糊化。采用α-淀粉酶和糖化酶進(jìn)行粉葛的糖化，加入粉葛粉質(zhì)量0.4%的α-淀粉酶，于自然pH進(jìn)行水解，溫度為70℃，水解時(shí)間為60min，液化期間不斷攪拌。然后將液化粉葛漿冷卻至60℃，加酸調(diào)pH至4.5，加入粉葛粉質(zhì)量0.4%的糖化酶，糖化時(shí)間為2 h。其后煮沸滅酶，冷卻過濾，量取1.5mL濾液于100mL容量瓶中稀釋至刻度，測定還原糖的含量。

1.3.3 還原糖含量的測定

還原糖含量的測定采用直接滴定法[18]。

1.3.4 纖維素酶用量的單因素試驗(yàn)

稱取5份粉葛粉，每份10 g，經(jīng)糊化后調(diào)節(jié)其pH值為5.0左右，于55℃水浴鍋中，加入纖維素酶的量分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%（均為與粉葛粉質(zhì)量的比例），恒溫水浴加熱90min，期間要不斷攪拌保證酶和樣品充分接觸。然后按照1.3.2的操作進(jìn)行粉葛的糖化，通過比較樣品濾液的還原糖含量，確定適宜的纖維素酶用量。

1.3.5 纖維素酶作用時(shí)間的單因素試驗(yàn)

稱取5份粉葛粉，每份10 g，經(jīng)糊化后調(diào)節(jié)其pH值為5.0左右，于55℃水浴鍋中，加入0.6%（與粉葛粉量的比例）的纖維素酶，恒溫水浴加熱時(shí)間分別為30、50、70、90、110min，期間要不斷攪拌保證酶和樣品充分接觸。然后按照1.3.2進(jìn)行粉葛的糖化，通過比較樣品濾液的還原糖含量，確定適宜的纖維素酶作用時(shí)間。

1.3.6 纖維素酶作用溫度的單因素試驗(yàn)

稱取4份粉葛粉，每份10 g，經(jīng)糊化后調(diào)節(jié)其pH值為5.0左右，分別于35、45、55、65℃水浴鍋中，纖維素酶加入量為0.6%，恒溫水浴加熱50min，期間要不斷攪拌保證酶和樣品充分接觸。然后按照1.3.2進(jìn)行粉葛的糖化，通過比較樣品濾液的還原糖含量，確定適宜的酶解溫度。

1.3.7 正交試驗(yàn)優(yōu)化纖維素酶解工藝

針對纖維素酶作用溫度、酶解時(shí)間、酶用量3個(gè)影響因素，以樣品濾液的還原糖含量為評價(jià)指標(biāo)，做三因素三水平的正交試驗(yàn)[19]，按照L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)，確定纖維素酶解的最優(yōu)工藝。

1.3.8 空白試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取粉葛粉2份，每份10 g，其中一份不添加纖維素酶，直接按照1.3.2的操作進(jìn)行糖化，另外一份采用纖維素酶的最優(yōu)工藝處理后，按照1.3.2的操作進(jìn)行糖化，分別測定2份樣品濾液的還原糖的含量，進(jìn)行對比分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維素酶用量的確定

纖維素酶用量與樣品濾液還原糖含量的關(guān)系見圖1。

圖1 纖維素酶的用量對粉葛糖化的影響Fig.1 The effect of cellulase dosage on kudzu saccharification

由圖1可以看出，當(dāng)酶用量達(dá)到0.6%時(shí)，還原糖得率最高，此時(shí)的還原糖含量為8.265 g/100mL。原因在于，當(dāng)纖維素酶濃度達(dá)到一定值時(shí)，纖維素表面上纖維素酶的吸附達(dá)到最大值，反應(yīng)速度也達(dá)到相應(yīng)的最大值，故繼續(xù)增加溶液中酶濃度時(shí)，還原糖得率也不再提高[20]。因此，確定適宜的纖維素酶用量為0.6%。

2.2 纖維素酶作用時(shí)間的確定

纖維素酶作用時(shí)間與樣品濾液還原糖含量的關(guān)系見圖2。

由圖2可以看出，反應(yīng)初始還原糖得率逐漸增加，50min時(shí)還原糖得率達(dá)到最大值，還原糖含量為8.355 g/100mL，后又有所降低，這主要是在反應(yīng)初期酶解速度較快，隨著時(shí)間的延長，反應(yīng)液中還原糖的濃度逐漸增加，產(chǎn)生生成物抑制，同時(shí)酶活性隨著反應(yīng)時(shí)間的增加逐漸降低。因此，確定適宜的纖維素酶作用時(shí)間為50min。

圖2 纖維素酶作用時(shí)間對粉葛糖化的影響Fig.2 The effect of enzymatic hydrolysis time on kudzu saccharification

2.3 纖維素酶作用溫度的確定

纖維素酶作用溫度與樣品濾液還原糖含量的關(guān)系見圖3。

圖3 纖維素酶的作用溫度對粉葛糖化的影響Fig.3 The effect of enzymatic hydrolysis temperature on kudzu saccharification

一般來說，酶的水解反應(yīng)存在適宜的溫度范圍，在此范圍內(nèi)，溫度的提高有利于纖維素酶活性的提高[21]。由圖3可知，纖維素酶處理粉葛的適宜溫度是55℃。

2.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，確定可選擇的因素水平為纖維素酶的酶用量（0.5%、0.6%、0.7%）、酶解時(shí)間（40、50、60min）、酶解溫度（50、55、60℃）[10]。因素水平見表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析見表2。

表1 因素水平表Table1 Levels and factors of orthogonal experiment

從表2的極差值（R）可知，影響粉葛糖化的因素主次順序依次為A＞B＞C，其最優(yōu)方案為A2B2C3，即酶解溫度55℃、纖維素酶量0.6%、酶解時(shí)間60min，以此最優(yōu)方案進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析Table2 Design and results analysis of orthogonal experiment

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)與空白試驗(yàn)的結(jié)果對比

按照纖維素酶解最優(yōu)方案試驗(yàn)條件進(jìn)行糖化，同時(shí)做不加纖維素酶的空白糖化試驗(yàn)，二者樣品濾液的還原糖含量測定結(jié)果見表3。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)與空白試驗(yàn)的結(jié)果Table3 The results of verification test and blank test

由表3結(jié)果可知，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果試樣中還原糖的含量為8.312 g/100mL，空白試驗(yàn)還原糖的含量為7.385 g/100mL，說明纖維素酶對粉葛糖化有一定的輔助作用。這是因?yàn)榉鄹鹬泻幸欢康睦w維素，在纖維素酶的作用下，水解成葡萄糖等還原糖，而且纖維素的適度水解也有利于后續(xù)粉葛淀粉的糖化。將最優(yōu)方案A2B2C3與正交表中最好的第8號(hào)試驗(yàn)A3B2C3作對比，其試樣中還原糖含量分別為8.312 g/100mL和8.294 g/100mL，顯然最優(yōu)方案的試驗(yàn)結(jié)果更好，因此，最終確定A2B2C3為真正的最優(yōu)方案。

3 結(jié)論

通過上述試驗(yàn)結(jié)果表明，纖維素酶處理能夠改善粉葛糖化的效果。試驗(yàn)得到纖維素酶輔助粉葛糖化的最優(yōu)工藝條件為：纖維素酶用量為0.6%，酶解溫度為55℃，酶解時(shí)間為60min，最終糖化液的還原糖含量為8.312 g/100mL，未加纖維素酶處理的糖化液還原糖含量為7.385 g/100mL。

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Study on Saccharification Technology of Kudzu with Cellulase

LI Yan，LIN Wen-zhen
（College of Chemistry and Chemical Engineering，Zhaoqing University，Zhaoqing526061，Guangdong，China）

On the basis of common saccharification process，the saccharification conditions of kudzu was studied by adding cellulase.Using the single factor tests and orthogonal tests，the optimum saccharification conditions were obtained.The kudzu was hydrolyzed by adding 0.6%cellulase to react at 55℃for 60min.The con tent of reducing sugar of saccharification liquid was 8.312g/100mL，while that of the blank test was7.385g/100mL. The results showed that adding cellulase could improve the effect of kudzu saccharification.

kudzu；saccharification；cellulase；reducing sugar

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.019

2016-06-12

廣東省高等學(xué)校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計(jì)劃資助項(xiàng)目（Yq2013164）

李妍（1978—），女（漢），副教授，博士，研究方向：食品加工技術(shù)與應(yīng)用。