枇杷葉多糖的分離純化及組分鑒定

黃素華，陳秋妹，陳瑞紅，洪燕萍

（龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖364000）

枇杷葉多糖的分離純化及組分鑒定

黃素華，陳秋妹，陳瑞紅，洪燕萍*

（龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖364000）

提取純化枇杷葉多糖，并對其組分進(jìn)行研究。枇杷葉多糖提取液經(jīng)大孔樹脂除雜，醇沉后干燥即得枇杷葉可溶性總多糖。經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析及Sephadex G-200葡聚糖凝膠柱層析，得到純化后多糖，并采用Sephadex G-200葡聚糖凝膠柱測定多糖的分子量，水解多糖后采用薄層層析對枇杷葉多糖進(jìn)行組分鑒定及單糖的組成比例測定。通過DEAE-52柱層析得3個(gè)枇杷葉多糖酸性組分，分別經(jīng)過SephadexG-200柱層析得到3個(gè)乳白色組分，分別為PSL-1、PSL-2、PSL-3。3個(gè)組分的洗脫曲線均為單一對稱峰，初步判斷3個(gè)組分含有單一成分的多糖。PSL-1、PSL-2、PSL-3分子量分別約為700、500、400 kDa。經(jīng)過薄層層析初步推斷出PSL-1含有鼠李糖和葡萄糖，含量之比為1∶0.602；PSL-2含有葡萄糖、半乳糖、鼠李糖，含量之比為1∶1.415∶1.408；PSL-3含有半乳糖和鼠李糖，含量之比為1∶1.03。

枇杷多糖；DEAE-52纖維素柱層析；Sephadex G-200葡聚糖凝膠柱層析；分子量測定；薄層層析；單糖組分

枇杷為薔薇科枇杷屬植物，在我國有2 200多年的栽培歷史，是一種傳統(tǒng)的中藥材，藥用歷史悠久，始載于《名醫(yī)別錄》，列為中品，具有清肺止咳、降逆止嘔的功效，試驗(yàn)研究表明具有抗炎和止咳作用[1]。

枇杷葉的藥用研究及應(yīng)用都很普遍，許多研究集中在萜類及黃酮類成分和活性的研究上[2]，對枇杷葉多糖的研究較少。對多糖活性研究發(fā)現(xiàn)，多糖及其復(fù)合物與細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)相關(guān)[3]。初步的研究發(fā)現(xiàn)枇杷葉多糖具有提高免疫力及抗氧化的功能[4]，因此枇杷葉多糖應(yīng)該也是枇杷葉活性成分的一個(gè)重要組成。枇杷葉多糖的初步純化，已見報(bào)道的不多，且采用的方式為常規(guī)的除雜蛋白的方法[5]（如酶法、TCA法、sevage法或兩種方法結(jié)合使用等），以及一些除色素的方法進(jìn)行純化。

ASD-7大孔吸附樹脂[6]是一種非極性吸附樹脂，具有表面和氫鍵吸附功能，樹脂性能穩(wěn)定。其對蛋白、黃酮和多酚類物質(zhì)有很好的吸附作用，可以用于多糖的除雜，而且在部分植物中已有初步應(yīng)用研究。DEAE纖維素陰離子柱可通過可吸附蛋白質(zhì)、酸性多糖等離子型物質(zhì)，去除雜質(zhì)，而大多數(shù)的中性多糖不被吸附，通過收集流出液可以達(dá)到回收多糖去除雜質(zhì)的目的。利用弱堿性樹脂DEAE纖維素還可以吸附酚型化合物色素[4]，達(dá)到去除多糖中色素的作用。同時(shí)DEAE還可起到分子篩的作用。

凝膠層析又稱分子排阻層析[7]，可以將混合物中不同分子量物質(zhì)進(jìn)行分離純化，為多糖的純化提供了一種溫和的分離方法。因此采用葡聚糖凝膠純化多糖能夠較好的保留多糖的性質(zhì)，純化效果顯著。通過已有的資料可得，枇杷葉多糖的分子量在43 000Da左右[8]，SephadexG-200分離范圍在5000Da～600000Da，適用于生物大分子純化、分子量測定，因此選用Sephadex G-200進(jìn)行對枇杷葉多糖進(jìn)行純化和分子量的測定[9]。

枇杷多糖的分離純化一般要經(jīng)過提取、脫蛋白、脫酚、脫色等幾個(gè)步驟才能得到精制多糖。多糖在植物體內(nèi)并不是以單一的形式存在，而是大多數(shù)以其他物質(zhì)結(jié)合的形式存在，水提醇沉法是現(xiàn)在提取粗多糖最常用的方法。而對多糖的純化有許多方法，可以采用金屬絡(luò)合法、季銨鹽沉淀法、部分沉淀法、甲醇分級沉淀法、親和層析法、離子交換柱色譜法等方法進(jìn)行純化。但目前采用較多的純化方法是DEAE-纖維素離子交換柱色譜和葡聚糖凝膠及其他凝膠柱色譜法[10]。

本文研究探討了枇杷多糖的提取及分離純化的方法，試驗(yàn)中采用大孔樹脂吸附法去除枇杷粗多糖中的雜蛋白及酚性色素，用DEAE-52纖維素柱層析、Sephadex G-200葡聚糖凝膠柱層析進(jìn)行分級分離純化，用凝膠柱測定多糖的分子量，再利用薄層層析對枇杷葉多糖的單糖的組成及組成比例進(jìn)行分析，對枇杷多糖的結(jié)構(gòu)作一些初步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

枇杷葉：采自福建龍巖紅坊鄉(xiāng)果園，葉片洗凈后陰干，粉碎得枇杷葉干粉。

大孔樹脂ADS-7：南開大學(xué)；DEAE-52填料、福林酚試劑、考馬斯亮藍(lán)G-250：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Sephadex G-200填料：Pharmacia進(jìn)口分裝；透析袋：分子截留量3 500 kDa，北京瑞達(dá)恒輝；標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖（Biopped Dextran T-20、T-40、T-50、T-70）：Blue 2000試劑有限公司；牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液：北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

UV-2000紫外可見分光光度計(jì)：尤尼柯；ALPHR 24 LD PLUS冷凍干燥機(jī)：德國Christ；FA-1004電子分析天平：上海良平儀器儀表有限公司；N-1001S旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：東京理化；SHB-3循環(huán)水多用真空泵；DHL-A恒流泵：上海滬西分析儀器有限公司；BSZ-100自動(dòng)部分收集器：上海滬西分析儀器廠。

1.2 多糖含量的測定—苯酚-硫酸法

采用苯酚-硫酸法[11]測定多糖含量。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，配制不同濃度梯度溶液，分別取1.0mL，加5%苯酚溶液1.6mL，隨后加入濃硫酸7mL，40℃水浴0.5 h反應(yīng)，取出冷卻至室溫。另取1.0mL蒸餾水同法操作，作為空白對照。測定493 nm處吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取適當(dāng)濃度多糖溶液0.1mL加入0.9mL蒸餾水，搖勻，立即加入5%苯酚溶液1.6mL，搖勻，再加入濃硫酸7mL，40℃水浴0.5 h，反應(yīng)結(jié)束后取出冷卻到室溫，于493 nm處測定吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖的濃度。

1.3 蛋白含量的測定—考馬斯亮藍(lán)法

采用考馬斯亮藍(lán)法[12]測定蛋白含量。配制系列濃度牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取1.0mL加入5mL考馬斯亮藍(lán)試劑，震蕩混勻，3min后于595 nm測定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取樣品液1mL，然后加入5mL考馬斯亮藍(lán)試劑，震蕩混勻，3min后于595 nm測定吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到相應(yīng)的濃度。

1.4 多酚含量的測定—福林酚法

采用福林酚氧化法[13]測定多酚含量。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，配制不同濃度溶液，分別取0.3mL不同濃度梯度沒食子酸溶液，加1.5mL福林酚試劑（原液濃度為2 mol/L，稀釋10倍），加1.2 mL 7.5%碳酸鈉，45℃水浴15min，于760nm測定吸光值。取適當(dāng)濃度的樣品溶液1mL，加1.5mL福林酚試劑（稀釋方法同1.3），加1.2mL 7.5%碳酸鈉，45℃水浴15min，于760 nm處測定吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。

1.5 枇杷粗多糖的提取及初步純化

提?。喝〗?jīng)工業(yè)酒精除雜后的枇杷葉干粉，沸水浸提兩次，趁熱過濾，將兩次濾液合并，經(jīng)減壓濃縮得粗多糖溶液，加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇至乙醇終濃度達(dá)85%，于4℃冰箱中靜置過夜，抽濾，所得濾餅置烘箱中60℃烘24 h，烘干后濾餅研磨得粗多糖干粉，冷藏備用[14]。

ADS-7大孔樹脂吸附法初步純化[6]：以一定濃度粗多糖溶液上樣，達(dá)到蛋白質(zhì)泄露點(diǎn)時(shí)停止上樣，以體積分?jǐn)?shù)10%乙醇，洗脫回收多糖，體積分?jǐn)?shù)95%乙醇洗脫蛋白質(zhì)和多酚，再生大孔樹脂。合并上樣流出液和10%乙醇洗脫液，為回收多糖溶液，經(jīng)減壓濃縮至適當(dāng)體積，加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇至乙醇最終濃度為85%，靜置過夜，抽濾，將所得濾餅置于60℃烘箱中干燥24 h，研磨得到初步純化多糖粉，冷藏備用[9]。

1.6 DEAE-52柱純化

將大孔樹脂純化后的多糖配制成8mg/mL溶液，經(jīng)過DEAE-Cellose-52色譜柱（6 cm×60 cm，填料量約1130mL）純化，上樣量為交換容量的15%，約為169mL。依次使用水、0.1mol/L NaCl和0.5mol/LNaCl分段洗脫，每50mL為一個(gè)流份；硫酸苯酚法檢測每個(gè)流份多糖含量，記錄洗脫體積，繪制洗脫曲線。依據(jù)洗脫曲線收集洗脫峰部分，分別合并各主峰的流份，重蒸水透析2 d，將脫鹽后的多糖主峰溶液分別冷凍干燥，得枇杷葉多糖[15]。

1.7 SephadexG-200柱純化

取經(jīng)DEAE-52純化收集處理后的多糖配置成8mg/mL，上樣量為交換容量的15%，約為10mL。用Sephadex G-200進(jìn)一步純化，將多糖溶液上樣后，以0.05mol/LNaCl洗脫，每30min收集5mL一流份，硫酸苯酚法檢測每個(gè)流份多糖含量，記錄洗脫體積，繪制洗脫曲線。依據(jù)洗脫曲線收集洗脫峰部分，分別合并各主峰的流份，重蒸水透析2 d，將脫鹽后的多糖主峰溶液分別冷凍干燥，得枇杷葉純化多糖[16]。

1.8 多糖的鑒定

多糖初步鑒定的方法如下[4]。

顏色、溶解性試驗(yàn)：取適量的多糖分別溶于熱水、冷水、乙醇、丙酮、乙醚等有機(jī)溶劑，觀察其溶劑速度的快慢及溶解程度，判斷其溶解性。

碘反應(yīng)：分別配制1mg/mL多糖溶液和淀粉溶液，以淀粉作為陽性對照，滴加碘液觀察多糖溶液顏色的變化。

茚三酮反應(yīng)：取1mL多糖溶液（1mg/mL），加入0.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%茚三酮乙醇溶液，搖勻，加熱沸騰1min～2min后冷卻，觀察顏色變化，以蒸餾水為陰性對照，氨基酸為陽性對照。

苯酚-硫酸試驗(yàn)：取配制好的多糖溶液1mL于20mL比色管中，加入1mL 5%的苯酚試液，搖勻，立即加入適量的硫酸（注意滴加硫酸要緩慢，以免反應(yīng)濺出），觀察溶液顏色的變化。

α-萘酚試驗(yàn)（Molish反應(yīng)）：取1mL多糖溶液，滴加2滴～3滴的5%α-萘酚試劑，混勻，緩慢加入濃硫酸1mL，觀察反應(yīng)后溶液的現(xiàn)象。

碘碘化鉀反應(yīng)：配置1mg/mL的多糖溶液，分別以蒸餾和淀粉溶液作為陰陽對照組，分別滴加于點(diǎn)滴板小孔內(nèi)，再滴加少量碘-碘化鉀溶液，觀察溶液顏色的變化。

1.9 多糖分子量的鑒定

采用柱層析方法測定分子量。多糖上樣濃度為10mg/mL，Sephadex G-200葡聚糖凝膠柱層析（2 cm× 30 cm），填裝量為柱體積的2/3，為63mL。上樣量為交換容量的15%，即為9mL流動(dòng)相為0.05mol/LNaCl（pH 7.0）緩沖液，流速為0.5mL/min，硫酸苯酚法檢測，記錄洗脫峰，求出洗脫體積[9]。用同樣方法測定4種已知分子量（T-20、T-40、T-50、T-70）的葡聚糖的洗脫體積Ve，用藍(lán)色葡聚糖測出柱床的外水體積V0，將Ve/V0與分子量對數(shù)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，以回歸方程求得樣品的平均分子量。

1.10 枇杷多糖組分分析

1.10.1 多糖的水解

取PSL-2 10mg，加入1mol/LH2SO4溶液3mL，封管100℃下水解5 h，取出，加入BaCO3中和，離心除去BaSO4沉淀，取上清液，點(diǎn)樣分析鑒定[17]。

1.10.2 薄層層析法

薄層層析板：將硅膠板活化，即放入105℃烘箱中干燥30min，取出冷卻至室溫。110℃活化1 h。

展開劑[19]為正丁醇∶乙酸乙酯∶異丙醇∶乙醇∶水= 7∶20∶12∶7∶6；展開PSL-1和PSL-3水解樣品時(shí)，取1mL展開劑于層析缸中，展開PSL-2水解樣品時(shí)加1 mL展開劑后再加0.1mL氨水于層析缸中。顯色劑采用苯胺-二苯胺-磷酸-丙酮試劑[18]。

點(diǎn)樣展開[19]：用毛細(xì)管吸取微量配好糖液點(diǎn)于距薄層板下端上1.5 cm處，不要靠近層析板的邊緣，避免發(fā)生邊緣效應(yīng)。分次點(diǎn)樣，每點(diǎn)一次樣應(yīng)立刻吹干，點(diǎn)樣直徑不超過0.3mm，將點(diǎn)好樣的薄層板置于飽和過的層析缸中密閉展開，溶劑距薄層上端約1 cm時(shí)取出。

顯色：將薄層板取出，電吹風(fēng)迅速吹干，浸泡于染色劑中迅速取出，在110℃條件下10min即可顯色。

以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、鼠李糖、甘露糖作為對照，薄層層析、顯色、觀察斑點(diǎn)，計(jì)算遷移率。

1.10.3 杷葉多糖的單糖比例分析

根據(jù)薄層層析判斷出各個(gè)組分含有的單糖，利用硫酸-酚法制作判斷出單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，制作方法與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線一致。標(biāo)準(zhǔn)品與樣品薄層層析顯色后，再制作一個(gè)未染色的薄層層析板，與顯色后的薄層層析板對比，分別刮下不同條帶的硅膠，溶于1mL甲醇中，加入苯酚和硫酸，分別于分光光度493 nm處測定吸光度A。以標(biāo)準(zhǔn)單糖濃度C為自變量，吸光度A為因變量作標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程并計(jì)算樣品的濃度，即可求出各個(gè)單糖比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=6.002 1x-0.001 6，R2=0.998 8，濃度范圍0.05mg/mL～0.40mg/mL。

蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=1.867 9x+0.004 1，R2=0.999 3，濃度范圍0.01mg/mL～0.08mg/mL。

多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=13.149x+0.025 1，R2=0.999 6，濃度范圍0.01mg/mL～0.06mg/mL。

2.2 DEAE-52柱層析

將經(jīng)大孔樹脂除雜后的枇杷葉多糖，用DEAE-52離子交換作用對其進(jìn)行純化。依次用含有0、0.1、0.5 mol/L的NaCl梯度洗脫[20]，每20mL一流份，苯酚-硫酸法檢測試驗(yàn)結(jié)果如圖1。

圖1 DEAE-52柱層析多糖梯度洗脫曲線Fig.1 Gradient elution curve of polysaccharides in DEAE-52 column chromatography

由圖1可看出有3個(gè)洗脫峰，第一個(gè)洗脫峰的洗脫劑為蒸餾水，峰在第14管，收集洗脫液約700mL；第二個(gè)洗脫峰的洗脫劑為0.1moL/LNaCl，峰在36管，收集洗脫液約250mL；第三個(gè)峰在第68管，收集洗脫液約400mL。分別收集3個(gè)峰，濃縮后，重蒸水透析2 d，冷凍干燥后得到灰白色絮狀物多糖，冷藏備用。分別將3個(gè)組分命名為PSL-1、PSL-2、PSL-3。經(jīng)過DEAE-52柱層析后的3個(gè)組分均由深褐色變?yōu)榛野咨?，說明DEAE-52柱層析具有吸附色素的作用[4]。

2.3 PSL-1、PSL-2、PSL-3分別經(jīng)Sephadex G-200柱純化結(jié)果

利用Sephadex G-200對枇杷葉多糖進(jìn)行分離，依次將PSL-1、PSL-2、PSL-3 3個(gè)組分上Sephadex G-200柱，得到以下3個(gè)洗脫曲線，如圖2～圖4。

圖2 PSL-1經(jīng)Sephadex G-200柱洗脫曲線Fig.2 Elution curve of PSL-1 in Sephadex G-200 column chromatography

圖3 PSL-2經(jīng)Sephadex G-200柱洗脫曲線Fig.3 Elution curve of PSL-2 in Sephadex G-200 column chromatography

圖4 PSL-3經(jīng)Sephadex G-200柱洗脫曲線Fig.4 Elution curve of PSL-3 in Sephadex G-200 column chromatography

由這3個(gè)圖可以看出，經(jīng)過兩次過柱，3個(gè)組分都得到單一對稱性很好的洗脫峰，可初步斷定3個(gè)組分均為單一組分。3個(gè)組分洗脫峰的洗脫體積分別為40、47.5、65mL，大致可以判斷3個(gè)組分分子量的大小，PSL-3＜PSL-2＜PSL-1。為得到相對分子質(zhì)量均一的組分，分別收集3個(gè)洗脫峰，冷凍干燥后得到乳白色的絮狀物多糖，冷藏保存。

2.4 多糖的鑒定

對PSL-1、PSL-2、PSL-3經(jīng)過Sephadex G-200純化后得到的組分進(jìn)行一般理化性質(zhì)鑒定，結(jié)果顯示：PSL-1、PSL-2、PSL-3純化物凍干后均呈乳白色絮狀物，無臭無味，無明顯的熔點(diǎn)；溶于水，不溶于乙醇、乙醚和丙酮等有機(jī)溶劑；苯酚-硫酸試驗(yàn)反應(yīng)呈紅色，α-萘酚反應(yīng)生成紫色，證實(shí)了3個(gè)組分是糖類；與茚三酮反應(yīng)未出現(xiàn)紫色沉淀，說明3個(gè)組分不含氨基酸雜質(zhì)。3個(gè)組分的水溶液與碘—碘化鉀溶液反應(yīng)呈陰性，表明它們可能為β構(gòu)型的多糖。

2.5 PSL-1、PSL-2、PSL-3分子量的測定

利用Sephadex G-200柱層析，用藍(lán)色葡聚糖測定Sephadex G-100層析柱的外水體積V0為17.1mL，葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品Dextran T70、T50、T40及T20的洗脫體積Ve分別為20.9、22.5、23、25.5mL，按lgMr-Ve/V0關(guān)系作圖得相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線，其方程為y=-0.482 9x+ 2.121 9，R2=0.992。多糖相對分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5。

圖5 多糖相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.5 The standard curve of relative molecular weight of polysaccharides

根據(jù)PSL-1、PSL-2、PSL-3各自的洗脫體積分別為21.0、22.2、23.0mL，代入回歸方程，可得PSL-1、PSL-2、PSL-3的相對分子質(zhì)量分別為700、500、400 kDa。

2.6 枇杷多糖組分分析

2.6.1 薄層層析

將Sephadex G-200分離純化后3個(gè)多糖分別進(jìn)行水解，進(jìn)行薄層層析見圖6。

圖6 單糖組分薄層層析圖Fig.6 Thin-layer chromatography of monosaccharide components

圖6-a的展開劑為正丁醇：乙酸乙酯：異丙醇：乙醇：水=7：20：12：7：6，標(biāo)準(zhǔn)單糖的顏色為：木糖淺棕色、果糖淺棕色、半乳糖淺藍(lán)色、葡萄糖淺藍(lán)色、甘露糖淺藍(lán)色、鼠李糖淺黃色，PSL-1由下到上3個(gè)點(diǎn)的顏色分別為淺棕色、淺藍(lán)色、淺黃色，PSL-3的顏色與PSL-1的顏色一致。圖6-b的的展開劑為正丁醇∶乙酸乙酯∶異丙醇∶乙醇∶水=7∶20∶12∶7∶6，取1mL再加0.1m L的氨水，標(biāo)準(zhǔn)單糖顯色與圖6-a一致。因PSL-2由下到上3個(gè)點(diǎn)顏色為淺藍(lán)色、淺藍(lán)色、淺黃色，所以排除木糖和果糖。

2.6.2 樣品的比移值Rf

樣品和標(biāo)準(zhǔn)單糖的比移值Rf見表1及表2。

表1 多糖樣品水解單糖組分的比移值RfTable1 The Rf value of monosaccharide components of acid hydrolysis polysaccharids

表2 不同單糖標(biāo)準(zhǔn)品比移值RfTable2 The Rf value of monosaccharide standard

根據(jù)樣品薄層層析板的顏色以及Rf與標(biāo)準(zhǔn)樣品對比，可以看出PSL-1和PSL-3均有一個(gè)點(diǎn)未能與標(biāo)準(zhǔn)單糖吻合，未能判斷單糖種類，其余單糖根據(jù)顏色及比移值，初步推斷出PSL-1含有鼠李糖和葡萄糖及一個(gè)未知單糖，PSL-2含有葡萄糖、半乳糖、鼠李糖，PSL-3含有半乳糖和鼠李糖[16]及一個(gè)未知單糖。

2.7 杷葉多糖的單糖含量分析

2.7.1 半乳糖及鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別以半乳糖和鼠李糖為標(biāo)準(zhǔn)品，取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液經(jīng)顯色反應(yīng)，測定493 nm的OD值。分別以半乳糖、鼠李糖的濃度（mg/mL）為x軸，吸光值為y軸，得到半乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=6.184 8x-0.065 1，R2=0.989 7，線性濃度范圍0.05mg/mL～0.40mg/mL，鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=4.685x+0.139 3，R2=0.990 0，線性濃度范圍0.05mg/mL～0.40mg/mL。

2.7.2 PSL-1、PSL-2和PSL-3單糖的組成比例分析

3個(gè)樣品經(jīng)薄層層析顯色后，再分別制作一個(gè)未染色的薄層層析板，與顯色后的薄層層析板對比，分別刮下不同條帶的硅膠，溶于1mL甲醇中，加入苯酚和硫酸，分別于分光光度計(jì)493 nm處測定吸光度A。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各個(gè)單糖的濃度，分別計(jì)算出3個(gè)樣品單糖的比例：PSL-1中葡萄糖、鼠李糖的含量之比為1∶0.602；PSL-2中葡萄糖、鼠李糖、半乳糖的含量之比為1∶1.415∶1.408；PSL-3中半乳糖、鼠李糖的含量之比為1∶1.03。

3 結(jié)論

采用水提醇沉法提取枇杷葉粗多糖，經(jīng)過大孔樹脂初步除雜，得到初步純化的多糖。與常規(guī)的多糖脫蛋白和多酚方法相比，大孔吸附樹脂具有吸附容量大、吸附快、解吸溫和、再生方便、環(huán)保節(jié)約等優(yōu)點(diǎn)。因此采用大孔樹脂吸附法純化枇杷多糖，進(jìn)行雜蛋白和多酚的脫除，是一種較為可行的方法。

大孔樹脂純化后的多糖經(jīng)過DEAE-52純化后，得到3個(gè)洗脫峰，分別為PSL-1、PSL-2和PSL-3。經(jīng)過DEAE-52柱層析后的3個(gè)組分均由深褐色變?yōu)榛野咨?，說明DEAE-52柱層析具有純化、吸附色素的作用。

PSL-1、PSL-2和PSL-3經(jīng)過Sephadex G-200柱層析后，3個(gè)組分都得到單一對稱性很好的洗脫峰，可初步斷定3個(gè)組分均為單一組分。枇杷葉多糖的黏性比較大，過Sephadex G-200葡聚糖凝膠柱的上樣量不宜大。

經(jīng)多糖的性質(zhì)鑒定試驗(yàn)，從外觀，溶解性及α-萘酚試驗(yàn)等證實(shí)了純化的3個(gè)組分是糖類；碘反應(yīng)不變藍(lán)，碘-碘化鉀反應(yīng)未變藍(lán)及茚三酮反應(yīng)呈陽性，說明不含淀粉及氨基酸雜質(zhì)。

經(jīng)過這3種層析柱可以得到單一組分的多糖，說明此純化路線是可行，而且能夠較為完整的保留多糖的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。

通過Sephadex G-200柱層析測定Sephadex G-200純化后PSL-1、PSL-2和PSL-3 3個(gè)組分的分子量分別為700、500、400 kDa。

多糖水解的難易與單糖組成、水解試劑、水解溫度等因素有關(guān)。以2mol/L硫酸水解，BaCO3中和，水解條件最好，斑點(diǎn)完整清晰。經(jīng)過薄層層析對PSL-1、PSL-2和PSL-3的單糖組成分析，初步推斷出PSL-1含有鼠李糖和葡萄糖，PSL-2含有葡萄糖、半乳糖、鼠李糖，PSL-3含有半乳糖和鼠李糖。PSL-1和PSL-3均有一個(gè)點(diǎn)未能與標(biāo)準(zhǔn)單糖吻合。3個(gè)樣品單糖的比例：PSL-1中葡萄糖、鼠李糖的含量之比為1∶0.602；PSL-2中葡萄糖、鼠李糖、半乳糖的含量之比為1∶1.415∶1.408；PSL-3中半乳糖、鼠李糖的含量之比為1∶1.03。

枇杷不僅是一種亞熱帶果樹，其成熟葉也是一種傳統(tǒng)中藥，目前研究發(fā)現(xiàn)其主要化學(xué)成分如三萜酸、黃酮等具有止咳、祛痰、抗炎、抗腫瘤等多藥理活性[2]，但枇杷葉多糖化學(xué)組分的研究目前還不深入，相關(guān)的活性研究也較少。為了更好地利用這一資源，本論文通過對枇杷葉多糖的初步純化及分離和結(jié)構(gòu)研究，將為枇杷葉多糖的進(jìn)一步研究開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。此外多糖是生物大分子，其生物活性與其相對分子質(zhì)量、黏度、糖鏈結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[21]。本試驗(yàn)對枇杷葉多糖純化方法和單糖的組成進(jìn)行了初步研究分析，枇杷葉多糖的絕對構(gòu)型、多糖藥理學(xué)作用等，還有待進(jìn)一步的深入研究。

[1]鄭少泉.枇杷品種與優(yōu)質(zhì)高效栽培技術(shù)原色圖說[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2005:1-2

[2]彭方毅,姜海榮,陳遠(yuǎn)翔,等.枇杷葉有效成分的研究進(jìn)展[J].重慶工學(xué)院報(bào),2009,23(9):37-39

[3]熊子仙.植物多糖與保健[J].云南師范大學(xué)學(xué)報(bào),2004,24(3):41-43

[4]洪雷.枇杷葉分離純化及生物活性研究[D].福州:福建農(nóng)林大學(xué), 2008

[5]史德芳,楊洋,孫曉雪,等.仙人掌多糖提取過程中三種脫蛋白方法的比較研究[J].現(xiàn)代食品科技,2006(4):93-95

[6]戴婉妹,蔡雅醇,湯燦城,等.枇杷葉多糖純化大孔樹脂種類篩選的研究[J].龍巖學(xué)院學(xué)報(bào),2014,32(5):52-57

[7]鄭必勝,唐芳勇,何祿英,等.凝膠滲透色譜法表征廣東蟲草多糖柱層析分離純化效果的研究[J].食品科技,2009(5):298-303

[8]龐振凌,田龍.枇杷多糖的提取純化及理化性質(zhì)初步研究[J].食品研究與開發(fā),2007(4):14-16

[9]張玉香,尹卓容.甘露糖蛋白的提純及分子量測定[J].釀酒技術(shù), 2005(4):72-74

[10]朱穎.雪靈芝多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其生物活性研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2008

[11]王超,張曜武.苯酚-硫酸法的改進(jìn)發(fā)展[J].天津化工,2011,25(6): 16-17

[12]孫青士,王少杰.考馬斯亮藍(lán)法快速測定乳品中蛋白質(zhì)含量[J].山東科學(xué),2011(6):53-55

[13]卜彥花,周娜娜,王春悅,等.福林酚試劑法和紫外分光光度法測定冬棗多酚含量的比較研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2012(12):212-217

[14]周玉波,高曉忠,昊毅斌.枇杷葉及其炮制品中總黃酮和多糖的含量分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(9):270-272

[15]黃斌,林文庭.滸苔多糖的分離純化和成分分析[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2014,24(3):359-362

[16]Du Xiuju,Zhang Jingsong,Yang Yan.Purification,chemical modification and immunostimulating activity of polysaccharides from Tremella aurantialba fruit bodies[J].Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine&Biotechnology),2010,11(6):437-442

[17]林標(biāo)聲.茯苓多糖的發(fā)酵、提取及其理化、結(jié)構(gòu)性質(zhì)鑒定的研究[D].開封:河南大學(xué),2008

[18]張艷芳,陳代,聞亞琴.一種用于葡萄酒多糖組分鑒定的薄層層析法[J].中外葡萄與葡萄酒,2008(5):4-7

[19]張瑞英,胡嵐嵐,武金霞.單糖薄層層析實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)[J].實(shí)驗(yàn)室科學(xué),2012,15(5):45-49

[20]段國峰,余伯陽,鄔瑞斌,等.枇杷葉多糖的組分及含量分析[J].海峽藥學(xué),2009,21(2):50-53

[21]劉捷,張?bào)w祥,于立芹,等.紅薯葉多糖的分離純化及其結(jié)構(gòu)鑒定[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,31(5):46-50

Purification and Identification of Polysaccharide from Loquat Leaf

HUANG Su-hua，CHEN Qiu-mei，CHEN Rui-hong，HONG Yan-ping*
（College of Life Science，Longyan University，Longyan 364000，F(xiàn)ujian，China）

Polysaccharides of loquat leaf was extracted and purified，and its composition was studied.The total soluble polysaccharide of loquat leaf was prepared from the crude extract which was primary purified by macroporous resin and then precipitated by adding alcohol.Pure polysaccharides were obtained by DEAE-52 cellulose column chromatography and Sephadex G-200 gel column chromatography，and then the molecular weights of polysaccharides were determined by Sephadex G-200 gel column chromatography.The polysaccharides were hydrolyzed，and then the monosaccharide component and ratio were identified by thin layer chromatograph. Three fractions were obtained by DEAE-52 column chromatography，and then three components were obtained through Sephadex G-200 column chromatography that confirmed to be single component based on single symmetrical pea of the elution curves respectively，named PSL-1，PSL-2 and PSL-3.The molecular weight of PSL-1，PSL-2 and PSL-3 were 700，500，400 kDa respectively.The monosaccharide component and ratio of the three polysaccharides of loquat leaf were identified by thin layer chromatograph.PSL-1 contains rhamnose and glucose，and the ratio was 1∶0.602.PSL-2 contains glucose，galactose and rhamnose，and their ratio was 1∶1.415∶1.408.PSL-3 contains galactose and rhamnose，and their ratio was 1∶1.03.

loquat polysaccharide；DEAE-52 cellulose column chromatography；Sephadex G-200 column chromatography；determination of molecular weight；thin layer chromatography；monosaccharide composition

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.010

2016-06-07

福建省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2012N00190）；福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012D100）；福建省教育廳項(xiàng)目（JB12204）；福建省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201511312058）

黃素華（1968—），女（漢），副教授，本科，研究方向：果樹生物技術(shù)，天然產(chǎn)物提取與應(yīng)用。

*通信作者：洪燕萍（1970—），女，教授，研究方向：果樹生物技術(shù)，天然產(chǎn)物提取與應(yīng)用。