秋茄(Kandeliacandel L.)響應(yīng)重金屬脅迫的數(shù)字基因表達(dá)譜1)

袁柳嬌 傅夢(mèng)妮 余如鳳 黎海利 袁長(zhǎng)春 陳燕 劉鍇棟

(嶺南師范學(xué)院，湛江，524048)

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秋茄(KandeliacandelL.)響應(yīng)重金屬脅迫的數(shù)字基因表達(dá)譜1)

袁柳嬌 傅夢(mèng)妮 余如鳳 黎海利 袁長(zhǎng)春 陳燕 劉鍇棟

(嶺南師范學(xué)院，湛江，524048)

基于高通量測(cè)序的數(shù)字基因表達(dá)譜(DGE)技術(shù)，對(duì)重金屬污水脅迫處理組和對(duì)照組秋茄材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。結(jié)果表明，重金屬污水脅迫處理樣品與對(duì)照樣品相比，共篩選出的3 097個(gè)差異表達(dá)基因，其中2 202個(gè)表達(dá)上調(diào)，895個(gè)表達(dá)下調(diào)。GO功能顯著性富集分析出38個(gè)GO分類(lèi)條目，大量與生長(zhǎng)發(fā)育，代謝調(diào)控，環(huán)境刺激響應(yīng)相關(guān)的基因表現(xiàn)為富集。進(jìn)一步的KEGG代謝途徑分析表明，差異表達(dá)基因主要與糖類(lèi)、核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子代謝、能量代謝以及次生代謝過(guò)程有關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子分析發(fā)現(xiàn)bHLH，MYB，NAC和WRKY在重金屬脅迫中發(fā)揮重要作用。此外，重金屬脅迫還促進(jìn)萜類(lèi)、黃酮類(lèi)化合物生物合成的關(guān)鍵酶基因(牻牛兒基焦磷酸合酶(Unigene0029352)、黃酮醇合成酶(Unigene0010384))的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)秋茄有效成分的積累；顯著誘導(dǎo)細(xì)胞分裂素相關(guān)基因type-b響應(yīng)調(diào)節(jié)子ARR2(Unigene0033740)的表達(dá)、抑制油菜素內(nèi)酯的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組分基因BSK(Unigene0008986)的表達(dá)，進(jìn)而提高秋茄對(duì)重金屬脅迫的適應(yīng)能力。實(shí)驗(yàn)選取了5個(gè)與環(huán)境刺激響應(yīng)密切相關(guān)的基因，通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證了它們?cè)谥亟饘傥鬯{迫處理下的表達(dá)差異，結(jié)果與數(shù)字基因表達(dá)譜分析的結(jié)果較為一致，證實(shí)了差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)的有效性。說(shuō)明在重金屬脅迫處理下，秋茄通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)提高自身對(duì)污染脅迫的耐受能力。

秋茄；重金屬；污水脅迫處理；數(shù)字基因表達(dá)譜(DEG)；差異表達(dá)基因

Digital Gene Expression Profiling (DGE) technique was used to analyze the differences in gene expressions ofKandeliacandelunder artificial heavy metal treatment. A total of 3097 differential expressed genes (DEGs) were screened. Compared with the control treatment samples, 2202 DEGs were up-regulated and 895 DEGs were down-regulated in the heavy metal water treatment samples. By gene ontology (GO), 38 DEGs were enriched in the processes of growth, metabolism regulation and environmental stimuli response. KEGG pathway enrichment analysis showed that these DEGs were involved in various pathways of biological macromolecules metabolism, energy metabolism and secondary metabolism, such as sugar, protein, nucleic acid and lipid biosynthesis pathways. By transcription factor analysis, bHLH, MYB, NAC and WRKY played vital role in response to heavy metal stress. The geranyl pyrophosphate synthase (Unigene0029352) and flavonol synthase (Unigene0010384) involved in terpenoid and flavonoid biosynthesis were up-regulated by heavy metal stress might be the reason for the enhancement for the active ingredients accumulation inK.candel. The significantly promotion of the type-b response regulatorARR2 (Unigene0033740) involved in the signal transduction of cytokinins by heavy metal stress, and the inhibition of serine/threonine-protein kinase BSK (Unigene0008986) involved in the signal transduction of brassinolide by heavy metal stress might enhance the stress tolerance inK.candel. Five randomly selected ‘responses to stimulus’ related genes were used to confirm the accuracy of DGE.

紅樹(shù)林為木本植物，分布于熱帶與亞熱帶海岸潮間帶，在維護(hù)生態(tài)平衡和保護(hù)環(huán)境有著不可或缺的作用[1]。秋茄(KandeliacandelL.)，又名水筆仔、茄行樹(shù)，是紅樹(shù)植物中為數(shù)眾多的物種之一，在植物學(xué)分類(lèi)中為紅樹(shù)科秋茄屬的唯一物種，其株高為1～2 m，其樹(shù)皮呈現(xiàn)紅褐色而且比較光滑。在一定的地理?xiàng)l件下，秋茄可以形成單優(yōu)勢(shì)種灌木群落[2]。

隨著我國(guó)沿海地區(qū)工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展以及城市化區(qū)域的不斷擴(kuò)大，工農(nóng)廢水和生活污水的排放量越來(lái)越大。大量污水涌入江河海灣造成了很大的環(huán)境壓力[3]。作為一個(gè)典型的熱帶、亞熱帶帶生態(tài)系統(tǒng)，海岸紅樹(shù)林濕地對(duì)泥灘中的污染物和有毒物質(zhì)有著較強(qiáng)的耐受及吸附作用。成片的紅樹(shù)林可以通過(guò)汲取、蓄積各種重金屬離子來(lái)凈化水體和濕地土壤[4-5]。然而，污水排放對(duì)紅樹(shù)林植物造成的正負(fù)影響在學(xué)術(shù)界一直存在爭(zhēng)議的。紅樹(shù)植物一方面可以從排放的污水中攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有利于植物的生長(zhǎng)；但是另一方面，污水中的重金屬離子也會(huì)對(duì)紅樹(shù)植物造成毒害[6]。因此，研究紅樹(shù)植物污水脅迫機(jī)理，對(duì)沿海灘涂的造林綠化、植被恢復(fù)以及林木作物抗污性育種具有重要的理論及指導(dǎo)意義。從20世紀(jì)80年代開(kāi)始，一些研究人員對(duì)秋茄在污染脅迫下的生理學(xué)及次級(jí)代謝物質(zhì)的變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)總酚、單寧和縮合單寧參與了秋茄根和葉對(duì)鎘的螯合，增強(qiáng)了秋茄對(duì)鎘的耐性，同時(shí)秋茄幼苗通過(guò)改變體內(nèi)類(lèi)黃酮和葉綠素含量促進(jìn)秋茄對(duì)生活污水脅迫的耐性[7-8]，但是從分子層面分析重金屬污水脅迫對(duì)秋茄的影響以及秋茄的耐受機(jī)制尚少見(jiàn)報(bào)道。

數(shù)字基因表達(dá)譜(digital gene expression profiling，DGE)是一種高通量測(cè)序技術(shù)，可以全面、快速檢測(cè)某一物種特定組織在特定狀態(tài)下基因表達(dá)情況。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序不依賴(lài)于基因組序列，是研究無(wú)參考基因組物種基因表達(dá)與調(diào)控的一把利器。隨著新一代測(cè)序平臺(tái)的研發(fā)及市場(chǎng)化，基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的DGE技術(shù)大量被應(yīng)用于不同處理下差異基因的檢測(cè)與功能基因的挖掘。目前已有學(xué)者利用該技術(shù)分析了鳳丹[9]、白樺[10]、長(zhǎng)白落葉松[11]、壇紫菜[12]、花生[13]等植物在不同脅迫環(huán)境下轉(zhuǎn)錄水平的差異。本文采用基于高通量測(cè)序的數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)研究重金屬污水脅迫處理下秋茄的基因表達(dá)變化，從分子的層面分析秋茄對(duì)重金屬污染脅迫的耐受機(jī)制，為深入研究重金屬污水脅迫對(duì)紅樹(shù)植物生長(zhǎng)的影響機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)試劑：Hoagland營(yíng)養(yǎng)液；Trizol試劑盒(TaKaRa,大連，中國(guó))；瓊脂糖；寡聚(dT)-纖維素；片段化緩沖液(fragmentation buffer)；dNTPs；六堿基隨機(jī)引物；RNase H；DNA polymerase I；QiaQuick PCR試劑盒；EB緩沖液；PrimeScriptTMRT Master Mix (TaKaRa，大連，中國(guó))；SYBR Green supermix；儀器：PCR儀型Bio-Rad CFX96 touchTM。

1.1 材料處理和收集

2015年3月在湛江雷州附城鎮(zhèn)紅樹(shù)林育苗場(chǎng)采集秋茄幼苗，選取株高約20～30 cm，具有3～4對(duì)葉片的秋茄幼苗。將株高相近、長(zhǎng)勢(shì)旺盛、完好無(wú)損的36株秋茄幼苗隨機(jī)分成重金屬處理組和對(duì)照組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。隨后加入1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液于室溫條件下進(jìn)行復(fù)壯培養(yǎng)(室溫約20 ℃)，30 d后處理組進(jìn)行人工重金屬污染脅迫處理。人工重金屬污水脅迫處理參照Z(yǔ)hang et al[14]中的方法，其中Pb2+、Cd2+、Hg2+作為外界脅迫因素，它們的質(zhì)量濃度分別為10、2、2 mg·L-1。對(duì)照組用等量的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液處理。對(duì)照組和處理組在相同的環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)2 d后分別摘取無(wú)缺損、完全開(kāi)展的嫩葉。將所得秋茄葉片保存于液氮中備用。

1.2 總RNA提取和基因表達(dá)譜測(cè)序

污水脅迫處理組和對(duì)照組的秋茄葉片樣品總RNA抽取采用Trizol法。對(duì)照和處理各3份生物學(xué)重復(fù)。然后將對(duì)照和處理的各自3份RNA樣品等量混合，由廣州基迪奧公司構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，采用Illumina HiSeqTM 2000平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3 序列比對(duì)及差異表達(dá)基因的篩選

預(yù)處理后序列與胡楊、麻風(fēng)樹(shù)參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。根據(jù)與參考基因組比對(duì)情況計(jì)算序列的全基因組覆蓋情況并計(jì)算RNA的表達(dá)量。在RNA-seq分析中，利用定位到基因表達(dá)區(qū)域測(cè)序序列的序列計(jì)數(shù)對(duì)該基因的表達(dá)水平進(jìn)行估計(jì)，用edgeR軟件對(duì)基因表達(dá)水平分析中得到的序列計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，并以P<0.05，|lbx|>1(x為差異倍數(shù))的篩選閾值篩選出差異表達(dá)基因，其中差異倍數(shù)為重金屬污水脅迫處理樣本與對(duì)照樣本中各基因表達(dá)量的比值。對(duì)于差異表達(dá)基因，其lbx>1時(shí)，則認(rèn)為該差異表達(dá)基因是上調(diào)的，反之，若lbx<-1，認(rèn)為該差異表達(dá)基因是下調(diào)的。

1.4 Gene Ontology(GO)基因功能注釋和KEGG代謝通路分析

采用GO數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.geneontology.org/)對(duì)重金屬污水脅迫后的紅樹(shù)秋茄植物進(jìn)行GO功能顯著性富集分析，并對(duì)篩選得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類(lèi)分析。通過(guò)GOseq方法假設(shè)驗(yàn)證得到一個(gè)特定的P，并以此界定差異表達(dá)基因在特定GO中的富集程度。一般校正后的P<0.05，則表明差異表達(dá)基因在該功能GO中出現(xiàn)了富集。使用KOBAS(2.0)進(jìn)行Pathway富集分析，當(dāng)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率<0.05時(shí)，表示差異表達(dá)基因在該通路中顯著性富集。

1.5 qRT-PCR驗(yàn)證

選取植物環(huán)境刺激響應(yīng)相關(guān)的差異表達(dá)基因，利用qRT-PCR技術(shù)，驗(yàn)證數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序的可靠性。表1為相關(guān)引物。

表1 引物序列

利用Premier primer 5軟件設(shè)計(jì)紅樹(shù)植物秋茄中各基因的RT引物，擴(kuò)增平均長(zhǎng)度在200～250 bp。以秋茄組成型表達(dá)基因tubulin作為內(nèi)參基因。秋茄對(duì)照樣本及重金屬污水脅迫處理樣本各取1 μg總RNA，采用PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa，大連，中國(guó))試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用于實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)。反應(yīng)體系如下：總體系為10 μL，含有SYBR Green supermix(2×)5 μL，上游引物0.2 μmol/L，下游引物0.2 μmol/L，cDNA 1 μL，ddH2O 3.6 μL。本試驗(yàn)共進(jìn)行3次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)，并采用2-ΔΔCt的方法計(jì)算相關(guān)的差異表達(dá)基因相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序質(zhì)量分值

對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的數(shù)據(jù)分析表明，對(duì)照樣本和重金屬污水脅迫處理樣本經(jīng)過(guò)除雜后獲得的有效序列與原始序列比例接近，對(duì)照樣本的有效序列為99.19%，重金屬污水脅迫處理樣本的有效序列為99.14%，說(shuō)明構(gòu)建cDNA文庫(kù)和測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量比較高。因?yàn)槭艿郊t樹(shù)植物秋茄的遺傳背景不同和注釋信息量差異的限制，對(duì)照樣本有效序列中基因并未完全被注釋?zhuān)蠹s89.06%的基因被注釋?zhuān)Ｏ碌?0.94%的有效序列未能注釋到對(duì)應(yīng)的功能基因，重金屬污水脅迫處理樣本的有效序列的注釋情況與對(duì)照樣本具有較高的一致性。另外，大部分注釋基因只有一種序列(占對(duì)照樣本的74.92%，重金屬污水脅迫處理樣本的74.26%)。根據(jù)測(cè)序隨機(jī)性分析可知，在基因中序列的分布具有較好的均一性，說(shuō)明測(cè)序樣本的mRNA沒(méi)有被降解。

本試驗(yàn)利用測(cè)序飽和度來(lái)檢驗(yàn)紅樹(shù)植物秋茄的測(cè)序量與檢測(cè)到的基因數(shù)量之間的協(xié)同性。在試驗(yàn)中，當(dāng)測(cè)序量達(dá)到60百萬(wàn)以上時(shí)，檢測(cè)到的基因數(shù)目趨于飽和。比較對(duì)照樣本與重金屬污水脅迫處理樣本的差異發(fā)現(xiàn)，對(duì)照樣本的被檢測(cè)基因量趨于飽和的曲線(xiàn)比較平緩，重金屬污水脅迫處理樣本的被檢測(cè)基因量趨于飽和的曲線(xiàn)相對(duì)更快達(dá)到飽和。

通過(guò)樣品基因覆蓋度的分析可知，對(duì)照組樣品基因覆蓋度主要在80%～100%，共39 298個(gè)基因，占總基因數(shù)的89.93%；重金屬污水脅迫處理組樣品共有42 140個(gè)基因的覆蓋度在80%～100%，占總基因96.43%，這說(shuō)明物種內(nèi)遺傳變異相對(duì)比較保守。另外進(jìn)一步對(duì)對(duì)照樣本的差異表達(dá)基因與重金屬污水脅迫處理樣本差異表達(dá)基因相比較，發(fā)現(xiàn)重金屬污水脅迫處理組樣本的差異表達(dá)基因的覆蓋程度更廣泛根據(jù)樣品表達(dá)量豐度分布分析可知，對(duì)照樣品和重金屬污水脅迫處理樣品的基因表達(dá)最集中的區(qū)域在lgx(x表示基因表達(dá)量值)的值為0～1.5，而且比較2組不同處理樣本的差異基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)重金屬污水脅迫處理組樣品的差異表達(dá)基因的表達(dá)量更為豐富。

2.2 差異表達(dá)基因篩選

差異基因篩選基于兩組樣本所有基因的表達(dá)量值，利用MeV軟件對(duì)樣本和基因間的關(guān)系進(jìn)行層級(jí)聚類(lèi)，并使用熱圖來(lái)呈現(xiàn)聚類(lèi)結(jié)果。結(jié)果表明兩組樣品中部分基因表達(dá)量水平有著較大的差異。通過(guò)比較對(duì)照樣本與重金屬污水脅迫處理樣本基因表達(dá)譜，共篩選到3097個(gè)表達(dá)量發(fā)生顯著變化的基因，其中上調(diào)基因有2 202個(gè)，下調(diào)基因895個(gè)。進(jìn)一步，我們通過(guò)針對(duì)差異基因的火山圖(Volcano plot)分析發(fā)現(xiàn)，差異基因的呈現(xiàn)正態(tài)分布。

2.3 差異表達(dá)基因的GO顯著性富集分析

在GO功能顯著性富集分析中，通過(guò)與參考基因相比較，將篩選出的差異表達(dá)基因富集于不同的GO分類(lèi)條目中，得到與差異表達(dá)基因相關(guān)的主要生物學(xué)功能分類(lèi)。通過(guò)GO基因功能分類(lèi)體系對(duì)重金屬污水脅迫處理組和對(duì)照組間差異表達(dá)的基因進(jìn)行注釋后，發(fā)現(xiàn)38個(gè)GO分類(lèi)條目，其中生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分過(guò)程和分子功能的相關(guān)條目的GO條目分別是19、11、8條，分別占50.00%、28.95%和21.05%。其中生物過(guò)程中差異基因的上調(diào)基因2 681個(gè)、下調(diào)基因745個(gè)；細(xì)胞組分過(guò)程中差異基因的上調(diào)基因1 442個(gè)，下調(diào)基因489個(gè)；分子功能中差異基因的上調(diào)基因925個(gè)，下調(diào)基因285個(gè)。另外我們發(fā)現(xiàn)生物學(xué)過(guò)程中被注釋的差異表達(dá)基因主要包括有機(jī)代謝、細(xì)胞代謝、初級(jí)代謝以及次生代謝等不同代謝過(guò)程。與細(xì)胞組分相關(guān)的差異表達(dá)基因主要包括細(xì)胞、細(xì)胞外組分和細(xì)胞內(nèi)組分等。與分子功能有關(guān)的差異表達(dá)基因主要涉及催化活性、結(jié)合活性、和轉(zhuǎn)移酶活性等功能(圖1)。

2.4 差異基因Pathway顯著性富集分析

利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行注釋和分類(lèi)，并根據(jù)KEGG pathway富集分析可知差異表達(dá)基因主要參與的生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。結(jié)果表明秋茄在重金屬污水脅迫處理下的差異表達(dá)基因廣泛涉及物質(zhì)代謝、能量代謝和新陳代謝等不同代謝與信號(hào)途徑。其中有關(guān)核糖體(7.99%)、噬菌體(2.46%)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(5.84%)、DNA復(fù)制(2%)、糖類(lèi)轉(zhuǎn)換(1.69%)、卟啉與葉綠素代謝(2%)、苯丙氨酸代謝(2.15%)、苯丙氨酸合成(3.69%)、類(lèi)黃酮合成(3.07%)和雙萜類(lèi)合成(0.77%)的基因大量富集。除了基本代謝途徑外，還有16.28%的基因參與了次生代謝物的生物合成及表達(dá)調(diào)控。

2.5 重金屬污水脅迫下的轉(zhuǎn)錄因子分析

在秋茄轉(zhuǎn)錄組注釋信息中，一共鑒定得到了分屬于54個(gè)家族的6 460個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(表2)。通過(guò)對(duì)這些轉(zhuǎn)錄因子的深入分析，發(fā)現(xiàn)bHLH，MYB，NAC和WRKY是秋茄中成員最多的轉(zhuǎn)錄因子家族。除此之外，其他一些已知與環(huán)境脅迫響應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族也都得到了鑒定，如bZIP，ARR-B和ARF等家族。眾多的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游功能基因，形成一個(gè)完整的網(wǎng)絡(luò)，共同參與秋茄對(duì)污水脅迫的響應(yīng)。

前1條線(xiàn)為對(duì)照組;后1條線(xiàn)為重金屬污水脅迫處理組。

轉(zhuǎn)錄因子家族轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量/個(gè)上調(diào)數(shù)量/個(gè)下調(diào)數(shù)量/個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量/個(gè)上調(diào)數(shù)量/個(gè)下調(diào)數(shù)量/個(gè)bHLH658239Dof6561MYB446127E2F/DP5950NAC409239Nin-like5941WRKY373195AP25530B3324127GeBP5020C2H229972NF-YC4121FAR1283112NF-YA4100C3H279143BES13601ERF27697CO-like3610bZIP255225CPP3621G2-like235127STAT3420GRAS20364NF-X13410HD-ZIP19862DBB3221HSF14483BBR-BPC3021HB-oth-er12842WOX3010GATA11264ZF-HD2810S1Fa-like10340ARR-B2411Trihelix10350CAMTA1910LBD9941SRS1810MIKC9640HB-PHD1400M-type9330GRF1110TALE9020RAV1010NF-YB8822LSD900ARF8641EIL700YABBY8421HRT-like610TCP6741Whirly600SBP6732VOZ600

注：轉(zhuǎn)錄因子總數(shù)量6 460個(gè)，上調(diào)基因總數(shù)270個(gè)，下調(diào)基因總數(shù)為94個(gè)。

2.6 重金屬污水脅迫處理對(duì)秋茄中植物激素相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控

前面根據(jù)KEGG pathway富集分析得知秋茄在重金屬污水脅迫處理下的差異表達(dá)基因在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(5.84%)中富集。而植物激素是植物中的重要化學(xué)物質(zhì)，它們參與絕大部分和植物生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程[15]。通過(guò)對(duì)秋茄轉(zhuǎn)錄組DEGs的分析，我們發(fā)現(xiàn)了重金屬污水脅迫處理對(duì)生長(zhǎng)素，乙烯，細(xì)胞分裂素，脫落酸，赤霉素和油菜素內(nèi)酯等一系列植物內(nèi)源激素的生物合成，體內(nèi)運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)基因都有一定的影響(表3)。

在污水脅迫處理下，生長(zhǎng)素運(yùn)輸載體AUX1基因(Unigene0007561)的表達(dá)受到上調(diào)，而一個(gè)SAURfamily protein(Unigene0028568)的表達(dá)受到顯著抑制。此外，在乙烯信號(hào)途徑中，兩個(gè)乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子ERF1(Unigene0030198)、ERF5(Unigene0041579)都受到誘導(dǎo)。多個(gè)細(xì)胞分裂素相關(guān)的基因得到了鑒定，它們的表達(dá)水平都受到污水脅迫處理的誘導(dǎo)，如細(xì)胞分裂素水解酶CKX7(Unigene0017080)，type-b響應(yīng)調(diào)節(jié)子ARR2(Unigene0033740)，一個(gè)含有組氨酸的磷酸轉(zhuǎn)移蛋白AHP1(Unigene0018785)和一個(gè)雙組份響應(yīng)因子ARR5(Unigene0015908)。其中ARR2受到顯著誘導(dǎo)。另一個(gè)內(nèi)源細(xì)胞分裂素相關(guān)基因玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶ZEP(Unigene0000118)在污水脅迫處理下表達(dá)水平上升了數(shù)十倍。多個(gè)脫落酸基因也得到了鑒定，一個(gè)脫落酸不敏感基因ABI5(Unigene0025625)的表達(dá)受到顯著的下調(diào)而它的一個(gè)受體蛋白編碼基因PYL8(Unigene0016779)受到輕微誘導(dǎo)。有趣的是，油菜素內(nèi)脂的一個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組分基因BSK(Unigene0008986)的表達(dá)受到極大的抑制，而油菜素內(nèi)脂受體基因BRI1(Unigene0011111)的表達(dá)卻受到極大的誘導(dǎo)，它們的變化都達(dá)到幾十倍差異。

表3 激素相關(guān)基因在污水脅迫下的表達(dá)差異

注：lbx中x表示差異倍數(shù)。

2.7 重金屬污水脅迫處理對(duì)秋茄次級(jí)代謝重要酶編碼基因的差異表達(dá)

前面根據(jù)KEGG pathway富集分析得知秋茄在重金屬污水脅迫處理下的差異表達(dá)基因在類(lèi)黃酮合成(3.07%)和雙萜類(lèi)合成(0.77%)中富集。我們通過(guò)對(duì)秋茄轉(zhuǎn)錄組中的DEGs進(jìn)行KEGG分類(lèi)發(fā)現(xiàn)，污水脅迫處理可顯著地誘導(dǎo)秋茄中萜類(lèi)和黃酮類(lèi)基因的表達(dá)，具體見(jiàn)表4。其中，萜類(lèi)物質(zhì)生物合成的限速酶甲基赤蘚醇磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶(Unigene0019445)，牻牛兒基焦磷酸合酶(Unigene0029352)和牻牛兒基轉(zhuǎn)移酶(Unigene0003919)的表達(dá)都受到污水脅迫的誘導(dǎo)。另外，黃酮類(lèi)生物合成的幾個(gè)關(guān)鍵酶。如：查爾酮合成酶(Unigene0033021)，黃酮醇合成酶(Unigene0010384)和黃酮醇磺基轉(zhuǎn)移酶(Unigene0007965)的編碼基因表達(dá)水平也受到不同程度的誘導(dǎo)，尤其是黃酮醇合成酶的表達(dá)顯著提高。

表4 響應(yīng)污水脅迫的次生代謝相關(guān)基因

注：lbx中x表示差異倍數(shù)。

2.8 差異基因的qRT-PCR驗(yàn)證

為了進(jìn)一步篩選秋茄污水脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵基因，我們對(duì)顯著富集的GO分類(lèi)條目“response to stimulus”(GO:0050896)中的5個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR分析，以驗(yàn)證數(shù)字基因表達(dá)譜的可靠性。這5個(gè)基因分別為：Unigene0006285，Unigene0017050，Unigene0002022，Unigene0007043和Unigene0016871，它們都是植物響應(yīng)外界刺激的關(guān)鍵基因。實(shí)驗(yàn)表明，這5個(gè)基因的qRT-PCR結(jié)果與數(shù)字基因表達(dá)譜中檢測(cè)到的表達(dá)趨勢(shì)有著較高的一致性。上述5個(gè)基因的表達(dá)都受到污水處理的誘導(dǎo)，其中Unigene0007043被誘導(dǎo)超過(guò)10倍以上。

3 結(jié)論與討論

在重金屬污水脅迫處理下，紅樹(shù)植物秋茄可以通過(guò)自身調(diào)控改變基因的表達(dá)，從而在轉(zhuǎn)錄和翻譯等不同水平上作出相應(yīng)的反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控不同代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。通過(guò)數(shù)字基因表達(dá)譜分析在轉(zhuǎn)錄水平上獲得39 480個(gè)基因的真實(shí)序列信息，大多數(shù)基因的覆蓋率較高，注釋基因的覆蓋度在80%～100%，占總基因96.43%，說(shuō)明物種內(nèi)基因組的遺傳變異相對(duì)保守。根據(jù)注釋基因拷貝數(shù)的不同，可以直接反映相應(yīng)基因的表達(dá)差異結(jié)果。進(jìn)一步分析上述基因的拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)3 097個(gè)差異表達(dá)基因在表達(dá)量上發(fā)生顯著的變化，這些基因?yàn)槲覀冊(cè)诜肿铀窖芯考t樹(shù)科植物秋茄提供了可能和深入研究秋茄的污水脅迫耐受特性提供了基礎(chǔ)。

相較之于對(duì)照樣本，重金屬污水脅迫處理組樣品的差異表達(dá)基因表現(xiàn)出廣泛的功能多樣性。根據(jù)GO功能分析，我們發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因涉及的范圍十分廣，幾乎包括整一個(gè)生物生化過(guò)程，其中還包括糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子以及各種分子功能，這說(shuō)明秋茄的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)是一個(gè)高度靈敏的開(kāi)放式表達(dá)調(diào)控體系，轉(zhuǎn)錄調(diào)控是秋茄污水脅迫耐受性的遺傳基礎(chǔ)。通過(guò)對(duì)GO分類(lèi)的深入研究，我們發(fā)現(xiàn)“response to stimulus”(GO:0050896)相關(guān)基因的表達(dá)在對(duì)照與處理樣本之間存在顯著差異。其中，164個(gè)環(huán)境刺激響應(yīng)基因顯著上調(diào)，68個(gè)基因顯著下調(diào)。通過(guò)對(duì)五個(gè)隨機(jī)選擇的環(huán)境刺激響應(yīng)基因的qRT-PCR檢測(cè)，我們驗(yàn)證了上述差異的可靠性。污水脅迫作為一種強(qiáng)烈的環(huán)境刺激，秋茄可能通過(guò)調(diào)控大量刺激響應(yīng)基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)對(duì)污水脅迫的耐受性。

污水中含有大量氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，秋茄可以通過(guò)吸收污水中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以供自身生長(zhǎng)發(fā)育[16]。許多有關(guān)重金屬污水脅迫處理秋茄方面的研究表明，低濃度重金屬污水脅迫處理下可以促進(jìn)紅樹(shù)植物的生長(zhǎng)，在一定程度內(nèi)，隨著污水脅迫濃度增加促進(jìn)作用加強(qiáng)；達(dá)到頂點(diǎn)后，隨著污水脅迫濃度升高促進(jìn)作用下降，最后抑制紅樹(shù)植物的生長(zhǎng)[8]。這表明，隨著污水脅迫濃度的升高，重金屬的毒害作用超過(guò)了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的促進(jìn)作用。進(jìn)一步研究重金屬對(duì)紅樹(shù)植物生理代謝的影響發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)正常濃度重金屬污水脅迫處理后，發(fā)現(xiàn)秋茄等紅樹(shù)植物的超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)等抗氧化酶系統(tǒng)的活力得到了提高，說(shuō)明秋茄等紅樹(shù)植物本身具有一定的污染耐受性[17]。本試驗(yàn)通過(guò)KEGG Pathway富集分析數(shù)據(jù)可知，大量差異表達(dá)基因與植物激素信號(hào)(生長(zhǎng)素，乙烯，細(xì)胞分裂素，脫落酸，赤霉素和油菜素內(nèi)酯)及次生代謝調(diào)控(黃酮類(lèi)、萜類(lèi)、卟琳)等有關(guān)，表明紅樹(shù)植物可能通過(guò)改變體內(nèi)植物激素的生物合成、體內(nèi)運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并增加次生代謝物的積累來(lái)抵抗污水脅迫。大量研究表明，植物激素參與植物的抗逆反應(yīng)[18]。針對(duì)秋茄轉(zhuǎn)錄組的分析，得到了一系列激素相關(guān)基因的編碼和轉(zhuǎn)錄差異信息，這為我們分析激素參與秋茄重金屬污水脅迫耐受性形成的分子機(jī)制打下了基礎(chǔ)。在模式植物中，生長(zhǎng)素運(yùn)輸載體參與植物激素與脅迫響應(yīng)的機(jī)制得到了初步揭示。在鹽和干旱脅迫下，水稻的LAX和ABCB家族基因普遍上調(diào)，這與秋茄中的AUX1(Unigene0007561)的表達(dá)差異相一致[19]。在擬南芥和苜蓿中，鎘、銅或者汞脅迫顯著誘導(dǎo)了ERF家族基因的表達(dá)[20-21]。本研究中，2個(gè)乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子ERF1(Unigene0030198)、ERF5(Unigene0041579)都受到誘導(dǎo)，這與模式植物的表達(dá)情況一致。細(xì)胞分裂素具有促進(jìn)細(xì)胞分裂的作用，在擬南芥中，細(xì)胞分裂素相關(guān)基因type-b響應(yīng)調(diào)節(jié)因子ARR2基因的過(guò)量表達(dá)促進(jìn)了主根的生長(zhǎng)和下胚軸的伸長(zhǎng)[22]，而本研究中，秋茄的type-b響應(yīng)調(diào)節(jié)因子ARR2基因(Unigene0033740)在重金屬脅迫下被顯著誘導(dǎo)，說(shuō)明脅迫可能促進(jìn)根細(xì)胞的增殖，以此來(lái)緩解脅迫帶來(lái)的影響。在擬南芥中，脫落酸受體蛋白PYL5被證實(shí)與植物的環(huán)境脅迫抗性有關(guān)，而另一個(gè)脫落酸受體蛋白PYL4則通過(guò)茉莉酸信號(hào)途徑來(lái)發(fā)揮其功能[23-24]。在我們的研究中，秋茄的脫落酸受體蛋白PYL8得到了鑒定，它的表達(dá)受到污水脅迫處理的誘導(dǎo)，這說(shuō)明脫落酸也參與了秋茄對(duì)污水脅迫的響應(yīng)。此外，在植物組織的非酶抗氧化系統(tǒng)中，類(lèi)黃酮發(fā)揮重要的作用，可以清除植物體內(nèi)的自由基和抑制脂質(zhì)的過(guò)氧化，類(lèi)黃酮化合物的積累與代謝對(duì)植物產(chǎn)生應(yīng)答逆境脅迫具有重要的作用[25]。本研究中類(lèi)黃酮合成酶基因及萜類(lèi)合成酶基因表達(dá)增加，特別是黃酮醇合成酶(Unigene0010384)和牻牛兒基焦磷酸合酶(Unigene0029352)受到顯著誘導(dǎo)，這些基因的誘導(dǎo)表達(dá)能夠促進(jìn)秋茄萜類(lèi)、類(lèi)黃酮類(lèi)等次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累。這些化學(xué)成分具有滲透調(diào)節(jié)、清除自由基等功能，有利于秋茄適應(yīng)重金屬脅迫。

眾多的轉(zhuǎn)錄因子家族參與了植物環(huán)境脅迫的快速響應(yīng)[26]。在擬南芥中，鎘脅迫誘導(dǎo)了許多轉(zhuǎn)錄組因子的表達(dá)，其中主要包括bHLH，WRKY，MYB和AP2/EREBP等家族[27]。水稻中過(guò)量的銅離子影響WRKY,MYB和NAC等基因的表達(dá)量，這些基因參與了銅毒害的耐受性[28]。在小麥中，TabHLH13的全長(zhǎng)序列得到了克隆，它的表達(dá)水平在鹽，PEG，低溫脅迫等處理下，表現(xiàn)出顯著的差異[29]。秋茄轉(zhuǎn)錄組中注釋為bHLH家族的成員多達(dá)658個(gè)，大大超過(guò)擬南芥的140個(gè)和水稻的160個(gè)，這說(shuō)明秋茄的基因組具有更高的復(fù)雜性[30]。從陸地棉晉棉—19中分離到了6個(gè)NAC型脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GhNAC1-GhNAC6，它們?cè)诜巧锩{迫的信號(hào)調(diào)控中起著重要的作用[31]。而秋茄中，第二大的轉(zhuǎn)錄因子家族NAC也有446個(gè)成員得到了初步的分析。WRKY53在鎘處理的遏藍(lán)菜中差異表達(dá)，這個(gè)基因也能被鹽脅迫和旱脅迫調(diào)控，同時(shí)參與脅迫相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑[32]。同時(shí)，WRKY在麻風(fēng)樹(shù)響應(yīng)鎘脅迫中發(fā)揮重要作用[33]。依據(jù)秋茄轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，一共373個(gè)WRKY家族成員得到了鑒定。這些都在一定程度上說(shuō)明bHLH，MYB，NAC和WRKY在秋茄響應(yīng)重金屬脅迫中發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)分析得到的轉(zhuǎn)錄因子家族成員為未來(lái)進(jìn)一步深入研究提供了一定的候選基因，為揭示秋茄污水脅迫耐受性形成的分析機(jī)制打下了基礎(chǔ)。

總結(jié)而言，通過(guò)對(duì)秋茄進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，比較了污水處理組和對(duì)照組之間的差異，我們發(fā)現(xiàn)大量與生長(zhǎng)發(fā)育，代謝調(diào)控，環(huán)境刺激響應(yīng)相關(guān)的基因及代謝途徑參與了秋茄對(duì)污水脅迫的響應(yīng)。以上研究結(jié)果初步探討了重金屬污染脅迫對(duì)秋茄次級(jí)代謝和生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)制，也表明了秋茄對(duì)重金屬脅迫響應(yīng)機(jī)制的復(fù)雜性。對(duì)其中一些關(guān)鍵基因進(jìn)行深入研究將有助于全面了解其分子機(jī)制，并進(jìn)一步通過(guò)基因工程手段推動(dòng)植物修復(fù)的發(fā)展。

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Kandelia candel; Heavy metals; Sewage treatment; Digital gene expression profiling; Differential expressed gene

1)廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2013KJCX011-03，2015KJCX025)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目(201510579277)；嶺南師范學(xué)院自然科學(xué)研究項(xiàng)目(LZL1507)；嶺南師范學(xué)院協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目(CIL1503)；湛江市熱帶特色資源植物技術(shù)開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(2014A06008)。

袁柳嬌，女，1997年3月生，嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，在讀本科生。E-mail:415592550@qq.com。

劉鍇棟，嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，副研究員。E-mail:liukaidong2001@126.com。

2016年8月25日。

S718.4

責(zé)任編輯：潘 華。