紅藻氨酸致癲癇大鼠腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的研究

魯建華

作者單位：湖北省咸寧市中心醫(yī)院 湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科 437000

紅藻氨酸致癲癇大鼠腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的研究

魯建華

作者單位：湖北省咸寧市中心醫(yī)院 湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科 437000

目的 通過(guò)觀察大鼠癇性發(fā)作后血清和腦脊液中炎癥因子白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)水平的動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)而探討炎癥反應(yīng)與癲癇的關(guān)系。方法 側(cè)腦室注射紅藻氨酸(Kainic acid，KA)建立顳葉癲癇大鼠動(dòng)物模型，用ELISA方法測(cè)定大鼠癇性發(fā)作后6小時(shí)、24小時(shí)、72小時(shí)、1周血清和腦脊液中IL-6的水平，并與對(duì)照組相比較。同時(shí)觀察癲癇發(fā)作后神經(jīng)元的病理變化。結(jié)果 血清和腦脊液中IL-6水平在癲癇發(fā)作后6小時(shí)逐漸增加，24小時(shí)達(dá)高峰，以后逐漸下降。致癇24小時(shí)后出現(xiàn)大量神經(jīng)元壞死。結(jié)論 炎癥反應(yīng)參與了癲癇后神經(jīng)元損傷。IL-6或許可作為癲癇腦損傷后的早期外周生化標(biāo)志物。

紅藻氨酸 癲癇 炎癥反應(yīng) IL-6

癲癇(epilepsy，EP)是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病、多發(fā)病。炎癥與癲癇的關(guān)系近幾年來(lái)受到較大關(guān)注。目前越來(lái)越多的證據(jù)顯示炎性反應(yīng)和炎性介質(zhì)在癲癇形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，炎癥反應(yīng)在一定程度上決定著癲癇的發(fā)生、發(fā)展[1]。癲癇發(fā)作能引起腦內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)增高，炎癥因子被認(rèn)為與癲癇的發(fā)生頻率、神經(jīng)元的存活及膠質(zhì)細(xì)胞的增生密切相關(guān)。IL-6是一種重要的炎性細(xì)胞因子，廣泛參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)利用側(cè)腦室注射紅藻氨酸建立大鼠癲癇模型，通過(guò)動(dòng)態(tài)觀察癲癇發(fā)作后血清和腦脊液中IL-6水平的變化以及致癇后海馬神經(jīng)元的病理改變，進(jìn)而探討炎癥反應(yīng)與癲癇間的關(guān)系。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠36只，體重250～300g，動(dòng)物被隨機(jī)分成對(duì)照組(6只)和模型組(24只)，模型組再隨機(jī)分為癲癇發(fā)作后6小時(shí)、24小時(shí)、72小時(shí)、1周共4組，每組6只。對(duì)照組用等體積生理鹽水代替KA行側(cè)腦室注射。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型制作:大鼠麻醉后，將大鼠頭部仰臥位固定在立體定向儀上，頭局部備皮、消毒，暴露前囟。按照大鼠腦立體定向圖譜定位側(cè)腦室：前囟后0.8mm，右側(cè)旁開1.5mm，深度達(dá)硬腦膜表面。將預(yù)先裝有KA的微量注射器沿鉆孔進(jìn)針，向側(cè)腦室內(nèi)注射1μg/μlKA溶液lμl，在10分鐘內(nèi)緩慢勻速注射，5分鐘后拔除穿刺針。最后，用骨蠟封閉顱骨鉆孔，縫合頭皮，放回籠中，觀察行為學(xué)。按Racine分級(jí)判斷癲癇發(fā)作程度，Ⅲ級(jí)以上為造模成功。

1.2.2 血清和腦脊液標(biāo)本采集：實(shí)驗(yàn)組大鼠在KA注射致癇后6小時(shí)、24小時(shí)、72小時(shí)、1周抽取血液和腦脊液。對(duì)照組大鼠注射生理鹽水24小時(shí)后取血和腦脊液。腦脊液經(jīng)枕大孔直接穿刺法采集大鼠腦脊液。每只大鼠采心臟血2.5ml。所有標(biāo)本在室溫下以3000r/min離心20分鐘，取上清液置-20℃冰箱內(nèi)保存待測(cè)。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清及腦脊液中IL-6水平：美國(guó)RD公司ELISA試劑盒，采用雙抗體夾心法測(cè)定大鼠血清和腦脊液中IL-6水平。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書的步驟規(guī)范操作。

1.2.4 Nissl染色及神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)：取癲癇后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織(背側(cè)海馬)經(jīng)石蠟包埋后作冠狀切片，片厚4μm。石蠟切片經(jīng)二甲苯、梯度酒精脫蠟至水，蒸餾水浸洗3分鐘；置于1%甲苯胺藍(lán)染液，60℃溫箱內(nèi)浸染40分鐘；蒸餾水漂洗3分鐘后，置于70%酒精脫水1分鐘；95%酒精分色：光鏡下控制時(shí)間，約3～5分鐘，直至尼氏體呈深藍(lán)色，背景透明為止；無(wú)水乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。每組Nissl染色切片在海馬CA3區(qū)隨機(jī)各取5個(gè)200倍視野觀察壞死神經(jīng)元并計(jì)數(shù)。

2.結(jié)果

2.1 癲癇發(fā)作后各時(shí)間點(diǎn)血清和腦脊液中IL-6水平的動(dòng)態(tài)變化 ①實(shí)驗(yàn)組大鼠致癇后，血清IL-6水平在6小時(shí)開始升高，24小時(shí)達(dá)峰值，以后逐漸降低，與對(duì)照組比較，致癇后24小時(shí)、72小時(shí)組IL-6水平均顯著升高 (P<0.01)；②腦脊液IL-6水平在致癇后6小時(shí)也開始升高，24小時(shí)達(dá)峰值，以后逐漸降低，與對(duì)照組比較，致癇后24小時(shí)、72小時(shí)組IL-6水平顯著升高(P<0.01)；③癲癇大鼠腦脊液和血清中的IL-6水平呈明顯的正性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.978 (P<0.01) (見表1)。

組別血清腦脊液對(duì)照組7.63±0.4010.01±0.866小時(shí)組59.54±3.82*76.87±5.85*24小時(shí)組125.75±7.43*151.32±7.88*72小時(shí)組75.80±4.62*108.73±6.02*1周組47.53±2.17*63.16±4.75*

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01，△P<0.05。

2.2 Nissl染色 對(duì)照組海馬錐體細(xì)胞排列整齊，核仁居中，胞質(zhì)內(nèi)見藍(lán)色斑塊狀或顆粒狀的尼氏體；癲癇后6小時(shí)，CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞腫脹、變圓，胞漿染色深淺不一；致癇后24小時(shí)，CA3區(qū)錐體細(xì)胞層次減少，排列稀疏，尼氏體減少，核仁模糊；致癇后72小時(shí)～1周，CA3區(qū)出現(xiàn)大量的壞死神經(jīng)元，細(xì)胞層次不清，胞體萎縮，尼氏體消失(見圖1)。

圖1 Nissl染色示KA注射后海馬CA3區(qū)；N-C依次為正常對(duì)照組，癲癇后6h、2h、1w組(200×)

2.3 海馬CA3區(qū)壞死神經(jīng)元的動(dòng)態(tài)變化 各組Nissl染色切片在海馬CA3區(qū)隨機(jī)各取5個(gè)200倍視野觀察并計(jì)數(shù)其均數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)致癇后早期(24小時(shí)內(nèi))，CA3區(qū)神經(jīng)元以腫脹、變性為主，未見明顯神經(jīng)元細(xì)胞壞死；致癇后24小時(shí)，CA3區(qū)錐體細(xì)胞層次明顯減少，出現(xiàn)壞死神經(jīng)元，表現(xiàn)為神經(jīng)元核固縮，胞體縮小變形，胞漿尼氏小體消失，隨時(shí)間推移，致癇后72小時(shí)～1周，壞死神經(jīng)元逐漸增多(見表2)。

分組24小時(shí)組72小時(shí)組1周組CA3區(qū)6.2±0.710.8±1.3△13.6±2.2*

注：與24小時(shí)組比較，△P<0.05，﹡P<0.01。

3.討論

目前普遍認(rèn)為神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)失衡是促進(jìn)癲癇發(fā)生發(fā)展的重要原因之一[2]。1969年Walker首先提出，細(xì)胞因子(cytokines，CKs)是神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)信息交流的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞分泌的多種CKs，如IL-1β，IL-2，IL-6，腫瘤壞死因子(TNF-α)等與其受體結(jié)合后導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性發(fā)生改變，參與癲癇的病理過(guò)程。

正常情況下，腦組織不表達(dá)或低水平表達(dá)細(xì)胞因子，而KA致興奮性毒性損傷后，活化的膠質(zhì)細(xì)胞可分泌大量的炎性細(xì)胞因子，通過(guò)受損的血腦屏障進(jìn)入血液中。IL-6是由淋巴細(xì)胞及非淋巴細(xì)胞(如星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞)等產(chǎn)生的具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，是參與細(xì)胞調(diào)節(jié)、炎性反應(yīng)的重要細(xì)胞因子。IL-6對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)及神經(jīng)毒性雙重作用。正常神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)低密度的IL-6，有中樞免疫介導(dǎo)和神經(jīng)修復(fù)等生理作用；癲癇后，腦內(nèi)的炎性細(xì)胞因子顯著升高，如IL-1β，TNF-α和IL-6均在癲癇發(fā)作后迅速增加[3]。我們的研究結(jié)果顯示，血清和腦脊液中IL-6水平在大鼠側(cè)腦室注射KA致癇后6小時(shí)均出現(xiàn)升高(P<0.01)，24小時(shí)達(dá)高峰(P<0.01)，隨后逐漸減低。兩者呈現(xiàn)出明顯的正性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.978 (P<0.01)，說(shuō)明癲癇發(fā)作后早期腦內(nèi)即存在炎癥反應(yīng)及血腦屏障破壞。癲癇后血清和腦脊液中的IL-6水平增高可能與膠質(zhì)細(xì)胞的活化以及血腦屏障的破壞有關(guān)[4]。其機(jī)理可能是與炎癥相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞因子多由膠質(zhì)細(xì)胞分泌產(chǎn)生，KA致癲癇后伴隨神經(jīng)元的損傷膠質(zhì)細(xì)胞早期激活，活化的膠質(zhì)細(xì)胞可分泌包括IL-6在內(nèi)的大量細(xì)胞因子，并能通過(guò)受損的血-腦屏障進(jìn)入血液中，啟動(dòng)腦內(nèi)甚至全身的炎性免疫應(yīng)答，影響癲癇的進(jìn)一步發(fā)生和發(fā)展以及調(diào)節(jié)神經(jīng)元的活動(dòng)。

膠質(zhì)細(xì)胞的激活和細(xì)胞因子的上調(diào)可導(dǎo)致海馬錐體細(xì)胞的病理改變，包括神經(jīng)元死亡及反應(yīng)性膠質(zhì)增生[5]。Nissl染色主要用于石蠟或冰凍切片神經(jīng)元細(xì)胞漿中的尼氏小體(Nissl body)染色。Nissl小體大而數(shù)量多，說(shuō)明神經(jīng)細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的功能較強(qiáng)，相反在神經(jīng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，Nissl小體的數(shù)量會(huì)減少。我們通過(guò)神經(jīng)元的這一特異性染色，觀察到大鼠致癇后神經(jīng)元細(xì)胞損傷的動(dòng)態(tài)變化。致癇后早期 (24小時(shí)內(nèi))，CA3區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)變性、水腫，而致癇24小時(shí)后，出現(xiàn)神經(jīng)元顯著壞死，并隨時(shí)間推移而增多。這表明膠質(zhì)細(xì)胞活化是腦內(nèi)炎癥反應(yīng)機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)，作為細(xì)胞因子主要來(lái)源的膠質(zhì)細(xì)胞在癲癇早期釋放大量的炎性細(xì)胞因子，啟動(dòng)腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，影響癲癇的發(fā)生與發(fā)展，進(jìn)而調(diào)節(jié)神經(jīng)元的活動(dòng)。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，癲癇大鼠腦內(nèi)存在急性炎癥反應(yīng)，這種炎癥反應(yīng)可能參與了癲癇發(fā)生及癲癇所致的腦損傷，涉及到膠質(zhì)細(xì)胞的活化、炎癥因子表達(dá)及神經(jīng)元死亡。IL-6或許可作為癲癇腦損傷后的早期外周生化標(biāo)志物。

1 LERNER-NATOLI M.Inflammation，angiogenesis and epilepsy[J].Biol Aujourdhui，2011，205(1):33-41.

2 VEZZANI A，F(xiàn)RIEDMAN A，DINGLEDINE RJ.The role of inflammation in epileptogenesis[J].Neuropharmacology，2013，69:16-24.

3 ULUDAG IF，DUKSAL T，TIFTIKCIOGLU BI，et al.IL-1β，IL-6 and IL1Ra levels in temporal lobe epilepsy[J].Seizure，2015，26:22-25.

4 VAN VLIET EA，ARONICA E，GORTER JA.Blood-brain barrier dysfunction，seizures and epilepsy[J].Semin Cell Dev Biol，2015，38:26-34.

5 GAO F，GAO Y，ZHANG S J，et al.Alteration of plasma cytokines in patients with active epilepsy[J].Acta Neurologica Scandinavica，2016，Sep 4.doi:10.1111/ane.12665.

Study on inflammation in kainic acid-induced epileptic rat

(LUJianhua.

XianningCentralHospital,Xianning437000,China.)

Objectives To investigate the levels of IL-6 in serum and cerebrospinal fluid (CSF) of rats with epilepsy，and then to approach the relationship between inflammatory and epilepsy.Methods An animal model of epilepsy was established in Male SD rat by intracerebroventricular injection of KA.The levels of IL-6 in serum and CSF was measured by ELISA at 4 different time points—6，24，72 hours and 1 week after seizures.And control group were set up to be contrasted and be observed.At the same time,the pathological changes of neuron were observed after seizures.Results In the experimental group，levels of IL-6 protein in both serum and CSF increased gradually 6 hours after seizures and declined gradually after reaching their highest level at the 24 hour time point.A large amount of of neuron necrosis in hippocampus appeared at 24 hours after seizures.Conclusion Inflammatory reaction maybe involve in seizure-induced brain damage.IL-6 may be a key biomarker for predicting early seizure-induced neuron damage and necrosis.

kainic acid, epilepsy, inflammatory, IL-6

魯建華，主治醫(yī)師，碩士研究生，主要從事癲癇、帕金森方面研究。

10.3969/j.issn.1672-4860.2017.01.006

2016-12-22