H5亞型流感病毒HA頭部球狀結(jié)構(gòu)域在畢赤酵母中的高效表達(dá)及其免疫原性分析

范文輝，王萌,2，劉麗蓉,2，張鶴，張爽，凌紅麗，劉文軍,2，李晶,2

1 中國科學(xué)院微生物研究所 中國科學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)重點實驗室，北京 100101

2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

3 青島蔚藍(lán)生物制品有限公司，山東 青島 266114

流感病毒 (Influenza virus) 屬于正粘病毒科，是單股負(fù)鏈分節(jié)段的RNA病毒。根據(jù)核蛋白(NP) 和基質(zhì)蛋白 (M1) 上抗原決定簇的不同，流感病毒可分為A、B、C、D四型[1-3]，其中A型和B型可給人類的健康帶來威脅，尤其是A型，每年因全球季節(jié)性流感和散發(fā)性流感而導(dǎo)致大約30萬–50萬人死亡，死亡率高達(dá)60%[4-5]。除了感染人類外，A型流感病毒還可以引起禽類、豬及其他哺乳動物流感的發(fā)生[6]。在雞群中流行的A型流感病毒包括H5N1、H5N2、H7N9及H9N2等亞型，其中，H5N1和H7N9已引起了全世界的關(guān)注，因為這些亞型不但可以引起人類感染發(fā)病并造成較高的死亡率，且有潛力發(fā)生變異，更容易出現(xiàn)跨物種傳播[7]。根據(jù)流感病毒對禽類的致病力不同，可將其分為高致病性禽流感病毒 (HPAI)和低致病性禽流感病毒 (LPAI)[8]。1997年香港發(fā)生的直接由雞群傳染給人的高致病性禽流感，造成了18人感染6人死亡，其病原即為高致病性禽流感病毒 (H5N1亞型)[9-10]。最近，由HPAI導(dǎo)致的禽流感在韓國和日本也有發(fā)生，HPAI作為一種人畜共患病病原，不但給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且對人類的公共衛(wèi)生安全也造成了嚴(yán)重的威脅[11]，因此，對HPAI的防控顯得尤為重要。

禽流感的防控一直是全世界關(guān)注的焦點，也是世界性難題。目前防治禽流感發(fā)生的主要手段為疫苗接種[12]，常用的H5亞型流感疫苗為全病毒滅活疫苗，如我國市售的Re-1、Re-4、Re-5、Re-6、Re-7、Re-8和Re-10株等，但該類型的疫苗在生產(chǎn)過程中涉及到了活病毒的操作，所以存在生物安全風(fēng)險。除此之外，還有重組活載體疫苗、DNA疫苗等，由于重組載體疫苗存在影響二次免疫，DNA疫苗免疫期長且需多次免疫，不適用于緊急預(yù)防，所以市場上未見大量應(yīng)用，因此研發(fā)出新型高效的H5亞型亞單位疫苗已是迫在眉睫[13-14]。亞單位疫苗是利用微生物的某種表面結(jié)構(gòu)成分 (抗原) 制成無核酸且能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體的疫苗，與常規(guī)疫苗相比生產(chǎn)簡單、快速且安全[15]。HA蛋白是流感病毒表面的主要保護(hù)性抗原，也是研究亞單位疫苗的主要靶標(biāo)抗原。研究人員認(rèn)為HA蛋白頭部球狀結(jié)構(gòu)是禽流感主要的保護(hù)性抗原。HA抗體滴度的高低從某種程度上能夠反映機(jī)體對于禽流感病毒的抵抗力。隨著基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，研究人員將HA基因克隆至真核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化至真核生物或細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有蛋白翻譯后的修飾功能，因此該系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于異源蛋白的高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫原性[16]。

本研究利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，將編碼HA蛋白頭部球狀結(jié)構(gòu)的基因插入至pPICZαA表達(dá)載體，并電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母，篩選得到高效表達(dá)重組菌，然后進(jìn)行發(fā)酵罐高密度發(fā)酵，濃縮純化得到目的蛋白，加入佐劑，研制成亞單位疫苗進(jìn)行免疫效果評價，為H5亞型流感的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株及實驗動物

大腸桿菌 TOP10、畢赤酵母X33菌株及pPICZαA 空載、MDCK細(xì)胞由本實驗室保存，SPF雞胚 (10日齡)、SPF雞 (1日齡、21日齡) 購自 (北京) 梅里亞動物保健有限公司；5周齡雌性BALB/c小鼠、4月齡雌性日本大耳白兔購自 (北京) 梅里亞動物保健有限公司。

1.2 主要試劑

Pfu酶、Taq酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶購自寶生物工程 (大連)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、TMB底物顯色液購自天根生化科技 (北京)有限公司；96孔酶標(biāo)板購自上海源葉生物科技有限公司；Ni-NTA His Bind Resin購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；蛋白預(yù)染 marker購自寶林科(北京) 生物科技有限公司；辣根過氧化物酶(HRP) 標(biāo)記的羊抗雞IgG購自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；小鼠抗6×His標(biāo)簽單克隆抗體購自博奧瑞京 (北京) 科技發(fā)展有限公司(Anti-His Tag Mouse Monoclonal Antibody，貨號：ABI001t)；白油購自鄭州索飛經(jīng)貿(mào)有限公司 (貨號：VG5852674P)；H5N1陽性血清及SPF雞陰性血清購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。甲醇購自上海晶純生化科技股份有限公司；市售疫苗為廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司 (重組禽流感病毒滅活疫苗，H5N1亞型，Re-6株，批號：獸藥臨字190022297)；所有引物均由深圳華大基因科技有限公司合成。

1.3 表達(dá)載體的構(gòu)建

參照 GenBank (登錄號 KC261467.1) 中H5N1亞型流感病毒血凝素基因的頭部球狀區(qū)序列 (60–300 aa)，對其進(jìn)行酵母表達(dá)密碼子優(yōu)化，使其利于在畢赤酵母中表達(dá)，將優(yōu)化后的目的片段連入pPICZαA載體，獲得重組質(zhì)粒pPICZαA-H5HA。

1.4 重組質(zhì)粒pPICZαA-H5HA線性化

將帶有重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-H5HA的大腸桿菌TOP10置于LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12–15 h，提取pPICZαA-H5HA質(zhì)粒。利用SacⅠ酶切pPICZαA-H5HA質(zhì)粒使其線性化，獲得線性化質(zhì)粒。

1.5 畢赤酵母X33的電轉(zhuǎn)化

向90 μL X33感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)加入10 μL線性化的pPICZαA-H5HA質(zhì)粒，混勻后將其加入預(yù)冷的石英電轉(zhuǎn)化杯中，冰浴5 min后放入電轉(zhuǎn)儀的槽中進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化后的混合液轉(zhuǎn)入離心管后置于30 ℃孵箱中，靜置1 h。然后將離心管中的混合液以2 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心2 min，用200 μL上清重懸細(xì)胞沉淀，然后將重懸細(xì)胞均勻涂布于含100 μg/mL Zeocin的YPDS平板上，30 ℃孵育3–5 d觀察，挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)、鑒定。

1.6 重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)和目的蛋白鑒定

將鑒定為陽性的菌液取500 μL加入到含25 mL BMGY培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，30 ℃、300 r/min培養(yǎng)至OD600為2–6。將培養(yǎng)液離心(5 min，3 000 r/min)，棄上清，將菌體用15 mL BMMY重懸，調(diào)整OD600為1.0左右并將菌體轉(zhuǎn)移至150 mL的搖瓶中，置于30 ℃、300 r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)。每間隔24 h向培養(yǎng)基中添加100%的甲醇溶液至終濃度為0.5%–1.0%進(jìn)行誘導(dǎo)。分別于誘導(dǎo)后0 h、24 h、48 h、72 h取樣進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting分析，鑒定目的蛋白表達(dá)情況及最佳誘導(dǎo)時間。

1.7 重組蛋白的純化及候選疫苗制備

將發(fā)酵液以12 000 r/min離心10 min，去除上清中的雜質(zhì)，然后用10 kDa的濃縮管進(jìn)行濃縮。將濃縮后上清用鎳柱進(jìn)行親和層析純化，然后再利用Superdex 2000層析柱進(jìn)行分子篩純化，收集目的蛋白H5HA所在的洗脫峰，SDS-PAGE檢測蛋白純度。

將純化后H5HA蛋白與白油混合：首先在H5HA蛋白中加入終濃度為4%的吐溫-80，然后再加入等體積的白油，充分乳化制成候選疫苗LW001 (含20 μg/200 μL H5HA) 和候選疫苗LW002 (含50 μg/200 μL H5HA)，用于注射免疫。將純化后 H5HA 蛋白與寡聚脫氧核苷酸(CpG-ODNs)[17-18]混合，向每200 μL的H5HA蛋白中加入50 μg的CpG-ODNs，并將二者混合均勻后制成候選疫苗LW003 (含20 μg/200 μL H5HA)和候選疫苗LW004 (含50 μg/200 μL H5HA)，用于滴鼻免疫。同時設(shè)置市售滅活疫苗及PBS陰性對照組。

1.8 SPF雞免疫試驗

將SPF雞隨機(jī)分為8組，每組6羽，試驗分組見表1，初次免疫14 d后加強(qiáng)免疫1次，每羽雞免疫劑量為200 μL。于14 d和28 d經(jīng)翅靜脈采血并分離得到血清，進(jìn)行血凝抑制 (HI) 效價及ELISA效價檢測。

1.9 間接ELISA檢測血清IgG

用大腸桿菌表達(dá)的純化后的H5HA蛋白作為包被抗原 (200 ng/孔，100 μL孔)，pH 9.6的碳酸鹽作為包被液，4 ℃過夜包被。包被后用洗滌液 (NaCl 8 g/L，KCl 0.2 g/L，Na2HPO4·12H2O 3.58 g/L，KH2PO40.24 g/L，Tween-20 0.05%，pH 7.2) 洗滌3次，之后每孔加入200 μL復(fù)合封閉液 (NaCl 8 g/L，KCl 0.2 g/L，Na2HPO4·12H2O 3.58 g/L，KH2PO40.24 g/L，山羊血清 50 mL/L，明膠溶液 5 mL/L，酪蛋白 2 g/L，蔗糖 10 g/L，pH 7.2)，37 ℃封閉2 h后洗滌3次。加入用復(fù)合抗體稀釋液 (NaCl 8 g/L，KCl 0.2 g/L，Na2HPO4·12H2O 3.58 g/L，KH2PO40.24 g/L，山羊血清 20 mL/L，酪蛋白1 g/L，蔗糖 5 g/L，吐溫-20 0.05%，pH 7.2) 稀釋的待檢血清，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h后洗滌。加入HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h后洗滌5次。加入顯色液和終止液。最后用酶標(biāo)儀測定450 nm下的吸光值 (OD450值)。

1.10 血凝抑制試驗

利用流感病毒血凝抑制試驗方法[19]，測定免疫后14 d及28 d血清中抗體效價，評價免疫效果。當(dāng)被檢血清HI效價大于等于4 log2時，可判定為H5亞型流感病毒抗體陽性。

1.11 動物安全性試驗

選取1日齡雛雞10羽，于腿部肌肉分別注射候選疫苗 (LW001和LW002) 0.1 mL；5周齡雌性BALB/c小鼠10只，于腿部肌肉分別注射候選疫苗0.1 mL (LW001和LW002)；4月齡健康的雌性日本大耳白種兔6只，腿部肌肉注射候選疫苗0.4 mL (LW001和LW002)；7日齡雛雞10羽，滴鼻接種候選疫苗 (LW003和LW004) 0.1 mL；5周齡雌性BALB/c小鼠10只，滴鼻免疫候選疫苗0.1 mL (LW003和LW004)；4月齡健康的雌性日本大耳白種兔6只，滴鼻免疫候選疫苗0.4 mL(LW003和LW004) 觀察14 d，記錄局部反應(yīng)和臨床癥狀。

1.12 血清-病毒中和試驗

用含10%胎牛血清的DMEM將MDCK細(xì)胞分至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100 μL/孔，5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)至90%匯合度時待用；將SPF雞血清于56 ℃滅活30 min，并進(jìn)行2倍倍比稀釋后與含100 TCID50H5N1流感病毒的無血清DMEM均勻混合后，37 ℃孵育1 h；棄去96孔板中細(xì)胞培養(yǎng)基，加入血清-病毒混合物100 μL/孔，置于培養(yǎng)箱中吸附1 h；棄去96孔板中的血清-病毒混合物，吸干各孔中的殘留液后，加入含1% FBS的DMEM，培養(yǎng)3 d；然后于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞病變 (CPE)，記錄病變孔數(shù)目，運(yùn)用Reed-Muench法計算中和抗體效價。H5亞型流感病毒強(qiáng)毒感染試驗均在中國科學(xué)院武漢病毒研究所生物安全三級實驗室操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 融合HA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

將人工合成的H5亞型流感病毒HA蛋白頭部球狀結(jié)構(gòu)域基因克隆至pPICZαA，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-H5HA并將其電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母中后涂布抗性平板，隨機(jī)挑取5個單克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在750 bp處出現(xiàn)特異性片段(圖1)，與預(yù)期的結(jié)果相符。同時，對重組質(zhì)粒pPICZαA-H5HA進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明，目的基因序列正確，且未發(fā)生堿基突變，重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2 目的蛋白的表達(dá)、純化及鑒定

分別收取甲醇誘導(dǎo)前與誘導(dǎo)后24、48、72 h酵母上清進(jìn)行SDS-PAGE。因為在酵母發(fā)酵過程中，隨著酵母培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)液會逐漸減少且污染機(jī)會大大增加，因此選擇72 h作為最佳誘導(dǎo)時間。將誘導(dǎo)72 h后的培養(yǎng)液離心后上清用濃縮管濃縮，再用鎳柱親和層析及Superdex 2000分子篩層析進(jìn)行純化。圖2A為誘導(dǎo)不同時間后發(fā)酵液上清中目的蛋白的表達(dá)情況，由結(jié)果可見，未添加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)時，目的蛋白不表達(dá)，添加甲醇誘導(dǎo)后，目的蛋白開始表達(dá)，且表達(dá)量在誘導(dǎo)后的24–72 h內(nèi)隨著誘導(dǎo)時間的延長，表達(dá)量逐漸升高，以72 h時發(fā)酵液上清中目的蛋白含量達(dá)到最高，達(dá)到0.2 mg/mL，且分子量大小符合預(yù)期，約為37 kDa。圖2B為純化后的目的蛋白H5HA，由結(jié)果可見，純化后的目的蛋白條帶單一、純度較高。

圖1 重組酵母菌的PCR產(chǎn)物鑒定Fig.1 Identification of recombinant yeasts by PCR.M:DNA marker; 1: product using plasmid pPICZαA-H5HA as amplification template; 2: product using empty plasmid pPICZαA as amplification template; 3–5: product using three different recombinant yeast cells as amplification template.

圖2 重組蛋白H5HA表達(dá)及純化的SDS-PAGE鑒定Fig.2 Identification of expression and purification of H5HA by SDS-PAGE.(A) M: marker; 1: the supernatant before induction; 2–4: the supernatant after 24 h, 48 h and 72 h induction, respectively.(B) M: marker; 1:supernatant before induction; 2: supernatant after 72 h induction; 3: purified H5HA protein.

目的蛋白帶有6×His標(biāo)簽，因此可采用抗6×His標(biāo)簽的抗體檢測H5HA蛋白的特異性。Western blotting分析結(jié)果顯示，目的蛋白能夠和抗6×His標(biāo)簽的抗體產(chǎn)生特異性反應(yīng)，分子量大小正確且條帶單一，說明目的蛋白具有良好的特異性 (圖3)。

2.3 免疫后SPF雞血清中IgG抗體水平

用間接 ELISA方法檢測各組SPF雞初次免疫后14 d與二次免疫后14 d時血清中IgG的含量，如圖4所示，橫坐標(biāo)為免疫時間，縱坐標(biāo)為血清的OD450值。血清中IgG的含量越高，OD450值也越高。結(jié)果顯示，肌肉注射50 μg/羽免疫組(Group 2) 初次免疫及二次免疫后血清中IgG水平明顯高于對照組血清的IgG水平，與對照組相比差異極顯著 (P<0.01)。肌肉注射25 μg/羽免疫組 (Group 1) 初次免疫及二次免疫后血清中IgG水平也高于對照組血清的IgG水平，與對照組相比差異顯著 (P<0.05)。肌肉注射50 μg/羽免疫組(Group 2) 初次免疫及二次免疫后血清中IgG水平與同條件下免疫市售疫苗免疫組 (Group 3) 相比，其差異不顯著，表明酵母表達(dá)的H5HA蛋白具有較高的免疫原性。

圖3 H5HA蛋白的Western blotting分析Fig.3 Western blotting analysis of the induced recombinant H5HA protein.M: marker; 1: products from the induced; 2: the supernatant before induction.

圖4 各組SPF雞血清不同時間點的IgG含量Fig.4 IgG level induced by H5HA in SPF chickens.*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

2.4 免疫后SPF雞血清HI效價

根據(jù)HI試驗的操作方法，測定SPF雞初次免疫后14 d及二免后14 d血清HI效價，結(jié)果重復(fù)3次，取平均值。結(jié)果表明，HI試驗的結(jié)果與間接ELISA的結(jié)果相符，當(dāng)重組目的蛋白劑量為50 μg/羽，使用白油作為佐劑，且采用肌肉注射時HI能夠達(dá)到較高水平，僅次于同種免疫方式下的市售滅活疫苗 (表2)。

表2 免疫H5HA的各組SPF雞的HI效價Table 2 HI titers induced by H5HA in SPF chicken

2.5 動物安全性試驗檢測

為了檢測亞單位疫苗實驗室制品的安全性，分別給健康的雛雞、BALB/c小鼠及日本大耳白種兔接種候選疫苗，結(jié)果顯示，免疫的動物均無紅腫、硬結(jié)和流感的臨床癥狀 (表3)。

表3 亞單位疫苗實驗室制品的安全性檢測Table 3 The safety of different batches of H5HA subunit vaccines

2.6 血清-病毒中和試驗結(jié)果

根據(jù)中和試驗的操作方法，對SPF雞初次免疫后14 d和二免后14 d的血清進(jìn)行中和抗體效價測定，結(jié)果重復(fù)3次，取平均值。結(jié)果顯示，病毒中和試驗的結(jié)果與間接ELISA及HI試驗的結(jié)果相符。當(dāng)重組目的蛋白劑量為50 μg/羽，使用白油作為佐劑，且采用肌肉注射時血清中的中和抗體效價為1∶218，與同等免疫條件下的市售滅活疫苗相比差異不顯著 (圖5)。

圖5 各組SPF雞血清不同時間點的中和抗體效價Fig.5 Neutralizing antibody titer induced by H5HA in SPF chickens.*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

3 討論

A型流感病毒作為人畜共患的病原，每年都會引起流感的暴發(fā)，引起較高的發(fā)病率和死亡率[20]，其宿主范圍廣泛，包括人、豬、馬、海洋哺乳動物、各類家禽野鳥等[21]。在長期的進(jìn)化中，廣泛的宿主為A型流感病毒提供了更多點突變及重組重配機(jī)會，形成了新的人畜共患毒株，給人類及畜禽健康帶來嚴(yán)重威脅。

接種疫苗是預(yù)防流感的有效途徑，也是目前防控流感的主要手段。我國常用的H5亞型流感疫苗為滅活疫苗，隨著不同毒株的流行，曾使用過Re-1、Re-4、Re-5、Re-6、Re-7、Re-8和Re-10株等市售疫苗，但該類疫苗在生產(chǎn)過程中涉及到了活病毒的操作，所以存在生物安全風(fēng)險，因此研發(fā)能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高中和活性抗體的亞單位疫苗已成為目前研究的熱點。亞單位疫苗的成分一般為病毒的主要表面蛋白，不涉及活病毒操作，且免疫效果良好，是一種安全、有效的疫苗。

酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用較為廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)，不但具有翻譯后修飾、加工、折疊等優(yōu)點，而且酵母適合大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)、生產(chǎn)成本低，已被廣泛應(yīng)用于亞單位疫苗、蛋白藥物、食品保健等研究中[22]，目前已有30多種生物制品 (經(jīng)FDA許可) 由酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)，包括HBV的表面抗原亞單位疫苗等[23-26]。

HA是A型流感病毒表面主要糖蛋白之一，其通過與宿主靶細(xì)胞上的唾液酸受體結(jié)合介導(dǎo)病毒的侵入[27]。由于禽流感病毒的HA蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，HA蛋白頭部球狀結(jié)構(gòu)是禽流感病毒主要的保護(hù)性抗原區(qū)域。HA誘導(dǎo)的抗體效價的高低從某種程度上能夠反映機(jī)體對于禽流感病毒的抵抗力[28-29]。目前已有利用酵母表達(dá)的H5N1亞型流感病毒HA蛋白作為亞單位疫苗的報道[14,30-31]，結(jié)果均表明，重組表達(dá)的HA蛋白免疫動物后血清中抗體的ELISA效價及血凝抑制效價均較高，如Murugan等利用酵母表達(dá)的HA蛋白進(jìn)行小鼠試驗發(fā)現(xiàn)，免疫后49 d，10 μg劑量組的血清抗體效價 (間接ELISA法檢測) 可高達(dá)1∶700以上，同時血凝抑制效價高達(dá)1∶200以上[14]。另外，Bright等利用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)了由H5N1的HA、NA及M1組裝而成的VLPs，并將其免疫小鼠，結(jié)果表明，VLPs誘發(fā)小鼠體內(nèi)較高的T細(xì)胞及B細(xì)胞免疫應(yīng)答，保護(hù)了小鼠免受致死劑量的重組H5N1流感病毒的攻擊，但該研究未開展靶動物驗證試驗[32]。

本研究結(jié)果表明，重組H5HA蛋白以分泌表達(dá)的方式大量存在于發(fā)酵液中，蛋白濃度可達(dá)0.2 mg/mL，且純度較高。另外，本研究將重組H5HA蛋白與佐劑聯(lián)用制成亞單位疫苗，用SPF雞進(jìn)行免疫原性評價的結(jié)果顯示，當(dāng)重組H5HA蛋白免疫劑量為50 μg/羽，使用白油作為佐劑且采用肌肉注射時，血清的HI效價能達(dá)到較高水平，具有較好的免疫原性，僅次于市售滅活疫苗。血清-病毒中和抗體效價為1∶218，與市售滅活疫苗相比，差異不顯著。

本研究獲得了重組目的蛋白H5HA，實現(xiàn)了H5N1亞型流感病毒HA抗原基因在酵母表達(dá)系統(tǒng)中的高效表達(dá)，可作為H5N1流感病毒亞單位疫苗和診斷試劑的候選抗原。但重組蛋白H5HA作為亞單位疫苗免疫靶動物，抗體水平與市售滅活疫苗相比還有待提高。因此，本研究后續(xù)將從佐劑種類篩選、劑量篩選、與抗原混勻條件等方面繼續(xù)優(yōu)化工藝，同時補(bǔ)充穩(wěn)定性試驗、保存期試驗、批間重復(fù)性試驗等，為重組蛋白H5HA作為亞單位疫苗的使用提供理論支持。