伊洛前列素對低氧性肺動脈高壓大鼠肺部內(nèi)皮素-1表達(dá)的影響*

官 莉，金 柱，陳世雄，向光明，高寶安

(三峽大學(xué)呼吸病研究所/湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北宜昌 443003)

論著·基礎(chǔ)研究

伊洛前列素對低氧性肺動脈高壓大鼠肺部內(nèi)皮素-1表達(dá)的影響*

官 莉，金 柱，陳世雄，向光明，高寶安△

(三峽大學(xué)呼吸病研究所/湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北宜昌 443003)

目的 探討伊洛前列素對低氧性肺動脈高壓(HPH)大鼠肺部內(nèi)皮素-1(ET-1)的影響。方法 雄性SD大鼠32只，分為正常(NC)組，正常治療(NT)組，低氧(HC))組，低氧治療(HT)組，每組8只。NC組和NT組在常氧條件下飼養(yǎng) 3周；HC和 HT組放置于低氧艙(O2濃度10%)進(jìn)行缺氧處理 3周(8 h/d)；NT和HT組每天進(jìn)行伊洛前列素霧化吸入治療(2 μg/kg)。第3周結(jié)束時，測量各組平均肺動脈壓(mPAP)，右心室收縮期末壓力(RVSP)，右心室肥厚指數(shù)。HE染色觀察各組肺動脈形態(tài)學(xué)變化，計算肺小動脈的血管壁厚百分比(WT%)，RT-PCR分析各組肺組織勻漿中ET-1的變化趨勢。結(jié)果 HC組大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)較其他組明顯升高，HT組相關(guān)指標(biāo)表達(dá)與NC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。HC組較其他組肺動脈管壁增厚、管腔狹窄明顯；HT組則有不同程度逆轉(zhuǎn)。HC組大鼠肺組織勻漿中ET-1表達(dá)較NC組明顯升高，HT組中ET-1表達(dá)與NC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 伊洛前列素對HPH有明顯的治療作用，可以降低HPH大鼠肺部ET-1的釋放，阻止肺血管重塑。

高血壓,肺性；缺氧;伊洛前列素；內(nèi)皮素-1

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一種復(fù)雜的，由遺傳因素及多種病因引起的病理過程[1]。低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary artery hypertension，HPAH)是屬于PAH分類的第三大類，由高原疾病或肺部疾病所致的慢性持續(xù)缺氧誘發(fā)，有著很高的病死率[2]。HPAH特點(diǎn)是異常的肺血管收縮(hypoxic pulmonary vasoconstriction，HPV)和肺血管重塑(pulmonary artery remodeling，PAR)。這兩個過程導(dǎo)致肺血管阻力逐步增加，最終致使患者右心衰竭而死亡[3]。長時間持續(xù)性缺氧誘導(dǎo)會使血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，導(dǎo)致其合成和分泌各種血管舒縮因子失調(diào)。在病變早期引起HPV，后期則導(dǎo)致不可逆PAR。PAR是HPAH持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素，而內(nèi)皮損傷及功能紊亂是血管重塑的起點(diǎn)。如何逆轉(zhuǎn)和減輕PAR，一直以來就是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[4]。內(nèi)皮素-1 (endothelin-1,ET-1)是調(diào)節(jié)心血管功能的重要因子，對維持基礎(chǔ)血管張力與心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)起重要作用，是已知最強(qiáng)縮血管物質(zhì)。低氧時內(nèi)皮細(xì)胞功能失衡，ET-1顯著增加，誘發(fā)PAR[5]。伊洛前列素是類前列環(huán)素藥物，與前列環(huán)素受體有良好的親和力，有超強(qiáng)的選擇性擴(kuò)張肺血管作用。吸入型伊洛前列素在國內(nèi)外已經(jīng)用于治療原發(fā)PAH[6-7]，但其在低氧性PAH動物模型中的療效報道很少。資料顯示前列環(huán)素類藥物可拮抗ET的生成和分泌，改善血管內(nèi)皮功能紊亂。伊洛前列素對HPAH有效性及其對ET-1的影響是本研究的重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過建立HPAH大鼠模型，研究伊洛前列素對動物HPAH的治療作用，以及伊洛前列素對大鼠肺組織ET-1在低氧環(huán)境中分泌合成的影響，為HPAH的治療和新藥開發(fā)提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性 6 周齡SD 大鼠 32 只，體質(zhì)量 200～250 g，健康無疾病，由三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。吸入用伊洛前列素溶液 (2 mL∶20 μg，西班牙Bayer Pharma AG公司)，兔抗大鼠ET-1多克隆抗體(美國Genetex公司)，低氧艙(Oxycycler model A84XOV，美國Biospherix公司)，Nikon & Spot圖像采集處理系統(tǒng)(日本Nikon公司)，RM-6280多道智能生理信號記錄系統(tǒng)(成都儀器廠)，魚躍牌403C壓縮空氣式霧化器(中國江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司)，總RNA提取試劑盒(美國Life Technologies公司)，cDNA第一鏈合成試劑盒(美國Axygen Biosciences公司)，定量PCR試劑盒(美國Axygen Biosciences公司)。

1.2 方法 通過血流動力學(xué)測定及肺動脈形態(tài)學(xué)測量血管壁厚百分比(pencent wall thitkness,WT%)驗(yàn)證造模是否成功。

1.2.1 大鼠HPAH模型的建立及分組 32只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法均勻分為 4 組:正常組(NC組)，正常治療組(NT組)，低氧組(HC組)，低氧治療組(HT組)，每組8只。每組平均體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。NC和NT組在常氧條件下飼養(yǎng)3周；HC組和HT組置入一體化低氧艙中，調(diào)節(jié)氧氣(O2)濃度恒定為10%，每天 8 h，持續(xù) 3 周；NT組和HT組每天置入一大小為30 cm×20 cm×20 cm亞克力密閉容器內(nèi)霧化吸入治療，伊洛前列素加入氧氣霧化器中按 220 ng·kg-1·h-1劑量霧化吸入，氧流量為 3 L/min(折算氧濃度為33%)每次持續(xù) 7.5 min，每次伊洛前列素總劑量達(dá) 1 μg/kg，每天早晚各1次，持續(xù) 3 周。所有實(shí)驗(yàn)動物均自由攝取食水。

1.2.2 血流動力學(xué)測定 在第3周末對所有大鼠進(jìn)行處理，10% 水合氯醛腹腔注射(0.3 mL/100 g)麻醉后進(jìn)行固定，開放頸部，內(nèi)充肝素溶液(生理鹽水+肝素10 U/mL)的聚乙烯塑料微導(dǎo)管(直徑1 mm)緩慢插入右側(cè)頸外靜脈，導(dǎo)管另外一端連接壓力傳感器以便監(jiān)測壓力變化。由血管走行方向及壓力波形引導(dǎo)，導(dǎo)管途經(jīng)上腔靜脈進(jìn)入右心房、三尖瓣口、右心室，直至肺動脈干，待波形穩(wěn)定后測量平均肺動脈壓(mPAP)及右心室收縮期末壓力(RVSP)，RM-6280多道生理信號采集處理系統(tǒng)采集記錄信號。測壓結(jié)束后，解剖出大鼠心臟，剪去心房組織，分離出右心室(RV)和左心室+室間隔(LV+S)后濾紙吸干，稱量RV和LV+S的質(zhì)量，計算右心肥厚指數(shù)，右心肥厚指數(shù)=RV/(LV十S)。

1.2.3 肺動脈形態(tài)學(xué)指標(biāo)觀察 各組大鼠處死后，從右肺下葉相同部位取一組織塊，放置于中性甲醛溶液(100 g/L，pH=7.4)固定1周時間。標(biāo)本石蠟包埋、連續(xù)切片及 HE 染色，于400倍光鏡下觀察中小肺動脈(管徑：>15～<150 μm)的形態(tài)變化。應(yīng)用Nikon&Spot圖像采集處理系統(tǒng)分析計算血管WT%，公式：(外彈力膜直徑-內(nèi)彈力膜直徑)/外彈力膜直徑×100%。每組大鼠測量10個中型肺動脈及小型肺動脈取其均值。

1.2.4 ET-1表達(dá)檢測 使用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)技術(shù)檢測肺組織中ET-1表達(dá)變化。ET-1正向引物5′-TGC TCC TGC TCC TTG AT-3′ 和反向引向5′-TGG TCT GTG GTC TTT GTG GG-3′。將肺組織標(biāo)本剪成小塊放入裝滿液氮的研缽中勻漿，使用總RNA提取試劑盒提取總RNA,提取成功后，使用cDNA第1鏈合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，具體步驟為預(yù)變性 95 ℃1 min； 95 ℃15 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)；末段延伸 72 ℃ 5 min；溶解曲線72～95 ℃，每 20 s 升溫1 ℃，得到結(jié)果后對擴(kuò)增曲線進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 血流動力學(xué)指標(biāo)的測定 HC組mPAP較NC組[(14.6±3.7)mm Hg]和NT組[(14.5±2.5)mm Hg]顯著升高(P<0.05)，HT組[(17.1±2.1)mm Hg]相對于HC組明顯降低(P<0.05)。HC組[(47.5±5.9)mm Hg]RVSP高于NC組[(28.6±2.1)mm Hg]及NT組[(29.1±1.8) mm Hg，P<0.05]，亦高于HT組[(35.2±3.0)mm Hg，P<0.05],見圖1B。HC組右心肥厚指數(shù)也反映了同樣的趨勢，HC組(36.7±2.4)%,NC組(23.8± 4.9)%，NT組(25.7± 4.7)%，HT組(28.7± 3.1)%，見圖1C。

A：mPAP;B:RVSP;C：右心肥厚指數(shù)；a：P<0.05，與NC、NT組比較；b：P<0.05，與HC組比較。

圖1 各組大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)的比較

A：NC組；B:NT組；C:HC組；D:HT 組。

圖2 各組大鼠肺動脈形態(tài)學(xué)變化(HE×400)

2.2 肺動脈形態(tài)學(xué)指標(biāo)的變化 光鏡下觀察HE染色后的肺組織切片中顯色較好，彈力層清晰的中小肺動脈。NC組大鼠肺動脈內(nèi)膜完整光滑、管壁薄、肌層無增厚，HC組大鼠肺動脈出現(xiàn)管壁及中膜明顯增厚，管腔狹窄，細(xì)小動脈肌化等血管重塑的變化特點(diǎn)，見圖2。然而HT組有部分血管可以恢復(fù)到和NC組相當(dāng)?shù)乃?，說明伊洛前列素抑制了低氧肺血管重塑。相對于NC組，HC組的WT%明顯升高(P<0.05)，HT組WT%比HC組明顯降低(P<0.05)，HT組與NC組的WT%相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

a：P<0.05，與NC、NT組比較；b：P<0.05，與HC組比較。

圖3 各組大鼠WT%比較

2.3 各組大鼠肺組織ET-1表達(dá)的檢測 PT-PCR擴(kuò)增曲線分析顯示，HC組ET-1表達(dá)相對于NC組明顯升高(P<0.05)，HT組ET-1表達(dá)比HT組明顯降低(P<0.05)，HT組與NC組的WT%相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

a：P<0.05，與NC、NT組比較；b：P<0.05，與HC組比較。

圖4 各組大鼠肺組織ET-1表達(dá)的比較

3 討 論

PAH原在高原地區(qū)常見,但隨著近年來空氣污染的加重，肺部基礎(chǔ)疾病增多，繼發(fā)性HPAH慢性在非高原地區(qū)亦有增多。持續(xù)慢性低氧引起HPV，進(jìn)一步引起PAR。由于內(nèi)皮損傷后功能失調(diào)，造成多種血管活性因子分泌合成紊亂，如ET-1,血管緊張素Ⅱ,血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 、血小板衍生性生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)等，這種現(xiàn)象加重血管損傷，促進(jìn)PAR[8]。在血管重塑過程中，會出現(xiàn)無肌型動脈向肌型動脈轉(zhuǎn)化，細(xì)動脈肌型化，中小動脈中層增厚、管腔狹窄等一系列的典型改變。隨著PAR進(jìn)一步進(jìn)展，肺動脈壓力持續(xù)升高，終點(diǎn)為右心衰竭，機(jī)體死。HE染色中血管形態(tài)的改變，以及右心指數(shù)的升高，都驗(yàn)證了肺動脈高壓模型的成功建立。

ET是1988年由Yanagisawa等[9]發(fā)現(xiàn)的由21個氨基酸殘基組成的多肽，是已知最強(qiáng)縮血管物質(zhì)，分為ET-1、ET-2和ET-3三類。ET-1是惟一存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞的ET，能夠引起強(qiáng)力而持久的血管收縮，對平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞生長也具有強(qiáng)烈的促進(jìn)作用。肺部是ET-1作用和代謝的最重要的器官。在低氧時，內(nèi)皮細(xì)胞釋放ET-1增加，進(jìn)一步與血管平滑肌上的ETA、ETB 受體結(jié)合，促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，引起平滑肌過度收縮痙攣，還促使某些與細(xì)胞增殖有關(guān)的原癌基因如c-fos，c-myc的表達(dá)增加，多方面促進(jìn)血管重塑[10]。研究發(fā)現(xiàn)，肺動脈高壓患者血漿ET-1水平明顯升高，并且與肺血流量和心排出量呈負(fù)相關(guān)。動物實(shí)驗(yàn)顯示，肺動脈高壓大鼠肺動脈和肺組織勻漿中ET前體和ET-1及其受體ETA和ETB的 mRNA表達(dá)均明顯增多，均提示ET-1在 HPAH 形成中扮演著重要的角色。

伊洛前列素是人工合成的前列環(huán)素類似物，作用部位是血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞[11]。發(fā)揮作用的機(jī)制為激活腺苷酸環(huán)化酶，使環(huán)磷腺甘(cAMP)水平升高，激活過氧化物酶增殖物激活受體(PPARγ)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，使血管擴(kuò)張，因此伊洛前列素有很強(qiáng)的擴(kuò)張肺血管作用[12]。相對于其他前列環(huán)素藥物，伊洛前列素優(yōu)點(diǎn)在于可以優(yōu)先到達(dá)通氣良好的肺泡，直接選擇性作用于肺動脈血管床，避免肺內(nèi)分流，維持氧合穩(wěn)定[13]。此外伊洛前列素還有抑制血栓形成，抗增殖活性和抗纖維化活性。在缺氧環(huán)境下伊洛前列素能拮抗炎性介質(zhì)(如緩激肽、5-羥色胺、組胺等)引起的免疫反應(yīng)，降低血管內(nèi)皮通透性，維持內(nèi)皮完整性[14]。在本實(shí)驗(yàn)中，持續(xù)缺氧時伊洛前列素對低氧肺動脈高壓有確切的療效，抑制ET-1的過度增加，延緩乃至逆轉(zhuǎn)肺血管重塑，這可能是通過保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮作用的。但是伊洛前列素通過何種途徑影響內(nèi)皮細(xì)胞的ET-1合成和釋放，具體調(diào)節(jié)機(jī)制如何，都待進(jìn)一步研究。

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Effects of iloprost on expression of Endothelin-1 in lung in rats with hypoxic pulmonary hypertension*

GuanLi,JinZhu,ChenShixiong,XiangGuangming,GaoBaoan△

(InstituteofRespiratoryDiseaseofThreeGorgesUniversity/DepartmentofRespiratoryMedicine,YichangCentralPeople′sHospital,Yichang,Hubei443003,China)

Objective To investigate the influence of iloprost on the expression of lung endothelin-1(ET-1) in rats with hypoxic pulmonary hypertension(HPH).Methods Thirty-two male SD rats were randomly divided into four groups:normal control(NC) group,normal treatment(NT) group,hypoxia control(HC) group,hypoxia treatment(HT) group.NC group and NT group raised under normal Oxygen conditions 3 weeks.HC and HT group placed in a low Oxygen chamber (O210%) were treated 3 weeks of hypoxia 8 hours per day.NT and HT group were treated daily iloprost by inhalation therapy (2 μg/kg).Affer three weeks,measured mean pulmonary arterial pressure (mPAP),right ventricular systolic pressure (RVSP),index of right ventricular hypertrophy.HE staining was used to observe the morphological changes of pulmonary arteries and image analysis system was used to calculate the percentage of vascular wall thickness of small pulmonary arteries in each group,RT-PCR technique was used to assess the trends of ET-1 in lung tissue homogenates.Results The hemodynamics in HC group was significantly higher than other groups(P<0.05),there was no significant statistically difference of the hemodynamics in HT group compare with normal control group.Pulmonary arteries morphology，vessel wall thickening and vessel lumina stenosis in HC group than NC、NT、group.These indicators were significant improved in HT group.ET-1 expression in lung tissue were significantly increased in HC group than NC groups.No significant difference was found between and NC group HT group.Conclusion Aerosol inhalation of iloprost has exact therapeutic effect for rats with HPH.Iloprost reduced ET-1 overexpression in lung tissue in HPH rats and prevent pulmonary vascular remodeling.

hypoxic hypertension,pulmonary;anoxia;iloprost;endothelin-1

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.06.005

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012FFB06301)；湖北省自然科學(xué)基金指導(dǎo)性計劃項(xiàng)目(2014CFC1037)。

官莉(1977-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事低氧性肺動脈高壓的基礎(chǔ)及臨床研究?！?/p>

，E-mail:gaobaoan_hubei@163.com。

R543.2

A

1671-8348(2017)06-0735-03

2016-10-23

2016-11-21)