羊傳染性膿皰病毒CEV112基因的克隆與原核表達(dá)

楊小健，李亞穎，龐 峰，李國華，彭冬梅，朱 姝，聶 鑫，曹瑞勇，王鳳陽，杜 麗

(海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，海南省熱帶動(dòng)物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？谑袆?dòng)物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?570228)

羊傳染性膿皰病毒CEV112基因的克隆與原核表達(dá)

楊小健，李亞穎，龐 峰，李國華，彭冬梅，朱 姝，聶 鑫，曹瑞勇，王鳳陽，杜 麗*

(海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，海南省熱帶動(dòng)物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口市動(dòng)物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南海口 570228)

為了克隆羊傳染性膿皰病毒CEV112基因并對其進(jìn)行原核表達(dá),根據(jù)GenBank中CEV112基因序列信息設(shè)計(jì)1對引物，以CEV基因組為模板，采用PCR擴(kuò)增出1條大小為867 bp的CEV112基因，將其連接到pMD20-T載體上，構(gòu)建pMD20-T-CEV112重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。鑒定正確后構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-CEV112，轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物用SDS-PAGE和Western blot進(jìn)行分析。結(jié)果表明，成功構(gòu)建了pET-28a-CEV112原核表達(dá)載體，并在E.coliBL21(DE3)中表達(dá)了CEV112基因，表達(dá)的融合蛋白大小約36 ku,且主要以包涵體形式存在，為后續(xù)開展CEV112基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

羊傳染性膿皰病毒；CEV112基因；克??；原核表達(dá)

羊傳染性膿皰(Contagious ecthyma，CE)俗稱羊口瘡，是由羊傳染性膿皰病毒(CE virus，CEV)引起的山羊、綿羊的接觸性、嗜上皮性人獸共患傳染病[1]。臨床上主要以感染動(dòng)物的唇、鼻孔、口腔黏膜、乳房、陰部等部分皮膚形成紅斑、水皰、膿皰、丘疹和疣狀痂皮為特征[2]。

CEV屬于痘病毒科(Poxviridae)，副痘病毒屬(Parapoxvirus)，該病毒基因組大小為130 kb～150 kb，含有16個(gè)開放閱讀框，編碼132個(gè)基因，CEV112基因位于病毒基因組反向末端重復(fù)序列區(qū)[3-5]。CEV112基因編碼一種趨化因子結(jié)合蛋白(chemokine binding protein，CBP)，在病毒復(fù)制的早期，該蛋白能夠有效地結(jié)合趨化因子，阻止趨化因子與相應(yīng)的受體作用[6]。CEV-CBP擁有結(jié)合CC型炎癥趨化因子的能力，從而抑制單核-巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞向炎癥部位聚集，而其他痘病毒則不能。此外，CEV-CBP還能與C型趨化因子結(jié)合，進(jìn)而抑制中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞向炎癥部位聚集[7]，但是，CEV-CBP的具體作用機(jī)制尚不完全清楚。本試驗(yàn)成功克隆表達(dá)了CEV112基因，為進(jìn)一步深入開展CEV-CBP的功能研究夯實(shí)了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 CEV基因組提取自CEV HCE弱毒株，由本實(shí)驗(yàn)室保存；E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，由本實(shí)驗(yàn)室氯化鈣法制備。

1.1.2 載體及主要試劑 質(zhì)粒提取試劑盒，中科瑞泰(北京)有限公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒、T-Verctor、BamHⅠ和Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶，寶生物工程(大連)有限公司；T4 DNA ligase，Thermo Fisher公司產(chǎn)品；兔抗His多克隆抗體，Merck公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，InvitrogenTM公司產(chǎn)品；ECM of Western blot檢測試劑盒，博士德生物公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；PCR儀、生物分光光度計(jì)、小量高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)，美國BIO-RAD公司產(chǎn)品；全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋，日本SANYO公司產(chǎn)品；電泳儀，北京市六一儀器廠產(chǎn)品；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)合成 從NCBI網(wǎng)站的GenBank中查到CEV的基因組序列(GenBank登錄號(hào)：AY386264.1)，根據(jù)CEV基因組中CEV112基因編碼框DNA序列，利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)1對引物，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

上游引物CEV112-F：5′ -GCGCAAGCTTATGAAGGTGGTGTTGTTGCTAGTG-3′ (下劃線部分是添加的Hind Ⅲ酶切位點(diǎn))；下游引物CEV112-R：5′ -CATGGGATCCTCAATGGCCAGGGCTGAGGTTAAG-3′ (下劃線部分是添加的BamHⅠ酶切位點(diǎn))。

1.2.2 CEV112基因的克隆 以提取CEV基因組的DNA為模板，以CEV112-F/CEV112-R為引物配制PCR反應(yīng)體系，按以下程序進(jìn)行PCR反應(yīng)：94℃ 3 min；94℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 1 min，29個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min，16℃結(jié)束反應(yīng)。待PCR反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠檢測并回收目的基因片段。將回收產(chǎn)物連接到pMD20-T載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD20-T-CEV112，連接體系及反應(yīng)條件為：載體pMD20-T 1 μL，目的片段3 μL，ddH2O 1 μL，SolutionⅠ 5 μL，混勻后，4℃過夜連接。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性克隆菌落，37℃過夜搖菌，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。

1.2.3 重組質(zhì)粒pET-28a-CEV112的構(gòu)建 參照史巧蕓等[8]的方法，構(gòu)建pET-28a-CEV112重組質(zhì)粒，首先用Hind Ⅲ和BamHⅠ分別對酶切鑒定正確的pMD20T-CEV112重組質(zhì)粒與pET-28a(+)空載體進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，檢測正確后用膠回收試劑盒回收酶切片段。將經(jīng)雙酶切回收的CEV112基因與pET-28a(+)用T4 DNA ligase連接，22℃連接1 h以上，把連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)受體菌，挑取單菌落，37℃過夜搖菌，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并將鑒定正確的質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.4 CEV112基因的原核表達(dá)與鑒定 參照趙天靖等[9]的方法進(jìn)行原核表達(dá)及鑒定。將鑒定正確的陽性單菌落和含空載體的pET28a(+)單菌落分別接種于含卡那霉素的3 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min過夜振蕩培養(yǎng)。次日，按1∶100的比例將其分別轉(zhuǎn)接至含卡那霉素的20 mL LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，待菌液OD 600 nm達(dá)到0.5～0.6時(shí)，分別吸出1 mL菌液作為誘導(dǎo)前對照，剩余菌液分別加入IPTG至最適濃度1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)5 h后分別取1 mL菌液。將收集的菌液離心收集沉淀，盡量吸除上清，在沉淀中加入20 μL DTT和80 μL 2×SDS上樣緩沖液，充分吹打混勻，沸水煮沸10 min，冰上放置5 min，12 000 r/min，高速離心5 min，取上清。以未用IPTG誘導(dǎo)的菌體為對照，對誘導(dǎo)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.2.5 融合蛋白CEV-CBP的可溶性分析 收集10 mL IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌菌液，4℃、4 000 r/min離心10 min，收集濕菌，用5 mL 1×TE懸浮濕菌，加入50 μL溶菌酶至終濃度為0.1 mg/mL，4℃放置30 min。將懸浮細(xì)菌置于冰浴中進(jìn)行超聲破碎，直至破碎菌液清亮，低溫離心破碎菌液，分別收集上清和沉淀，取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以確定重組菌是否為可溶性表達(dá)。

1.2.6 融合蛋白CEV-CBP的Western blot鑒定 將誘導(dǎo)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜上，用含50 g/L脫脂牛奶粉的TBS室溫靜置封閉2 h，之后先用兔抗His多克隆抗體(1∶2 000稀釋)在室溫下孵育2 h，再用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)在室溫下孵育1.5 h，最后用ECM of Western blot檢測試劑盒顯色檢測。

2 結(jié)果

2.1 CEV112基因PCR結(jié)果

利用所設(shè)計(jì)的引物，以CEV基因組為模板，對CEV112基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用瓊脂糖凝膠電泳分析，在867 bp處出現(xiàn)特異條帶(圖1)，說明CEV112基因成功擴(kuò)增。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.CEV112基因的PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000;1.PCR production of CEV112 gene

圖1 PCR擴(kuò)增CEV112基因

Fig.1 PCR amplification of CEV112 gene

2.2 重組質(zhì)粒pET28a-CEV112的酶切鑒定

構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-CEV112，轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，提取重組質(zhì)粒，BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切該重組質(zhì)粒，得到867 bp片段(圖2)，與目的基因片段大小一致，經(jīng)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序結(jié)果顯示，目的基因成功連入表達(dá)載體。

2.3 重組質(zhì)粒pET28a-CEV112表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

含陽性質(zhì)粒的重組菌株用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物用SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白。CEV112基因編碼289個(gè)氨基酸，該目的蛋白分子質(zhì)量為31.41 ku，加上載體上His-tag，預(yù)計(jì)大小約為36 ku，SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果證實(shí)了這一預(yù)測，目的條帶約為36 ku(圖3)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.重組質(zhì)粒pET28a-CEV112用Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切

M.DNA Marker DL 2 000;1.Recombinant plasmid pET28a-CEV112 digested withHind Ⅲ andBamHⅠ

圖2 重組質(zhì)粒pET28a-CEV112雙酶切鑒定

Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET28a-CEV112 by double enzyme digestion

2.4 融合蛋白CEV-CBP的可溶性分析

收集IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的菌體，經(jīng)超聲波破菌處理后對沉淀和上清進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，融合蛋白CEV-CBP存在于沉淀里(圖4)，以包涵體的形式存在。

2.5 融合蛋白CEV-CBP的Western blot鑒定

將SDS-PAGE分離后的蛋白條帶電轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，進(jìn)行Western blot檢測。ECM顯色后，在分子質(zhì)量約為36 ku處有一條特異性抗體結(jié)合帶(圖5)，說明目的蛋白表達(dá)正確。

3 討論

CE分布廣泛，全世界有養(yǎng)羊的國家?guī)缀蹙性摬“l(fā)生的報(bào)道，近年來隨著全國各地肉羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，該病呈暴發(fā)趨勢，給我國養(yǎng)羊業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[10]。該病主要是通過損傷的皮膚和黏膜感染傳播，可以感染羊以外的其他動(dòng)物，現(xiàn)已有貓和家養(yǎng)馴鹿被感染的報(bào)道[11-12]。目前，已對CEV的基因結(jié)構(gòu)和功能、免疫逃避的分子機(jī)制、新型疫苗等方面進(jìn)行了大量研究，取得了顯著進(jìn)展，但是，由于CEV免疫的特殊性，迄今還沒有安全、高效的CEV疫苗問世，而當(dāng)前用于預(yù)防CE的疫苗主要是弱毒疫苗。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)CEV112基因編碼的CBP具有阻止趨化因子與相應(yīng)受體結(jié)合的作用，在CEV免疫逃避機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.E.coliBL21(DE3)陰性對照;2.轉(zhuǎn)化pET28a(+)空載體的E.coliBL21(DE3)未誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物;3.轉(zhuǎn)化pET28a(+)空載體的E.coliBL21(DE3)經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5 h表達(dá)產(chǎn)物;4.重組質(zhì)粒pET-28a-CEV112未誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物;5.重組質(zhì)粒pET-28a-CEV112經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5 h表達(dá)產(chǎn)物

M.Protein molecular weight Marker;1.E.coliBL21 (DE3) negative control;2.pET28a (+) expression products without IPTG induction;3.pET28a (+) expression products induced for 5 h by 1 mmol/L IPTG;4.Expression products ofE.coliBL21 (DE3) transformed with pET-28a-CEV112 without IPTG induction;5.Expression products ofE.coliBL21 (DE3) transformed with pET-28a-CEV112 induced for 5 h by 1 mmol/L IPTG

圖3 融合蛋白CEV-CBP的SDS-PAGE分析

Fig.3 SDS-PAGE analysis of CEV-CBP fusion protein

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.表達(dá)產(chǎn)物超聲破碎處理后的上清;2.表達(dá)產(chǎn)物超聲破碎處理后的沉淀;3.重組質(zhì)粒pET-28a-CEV112未加IPTG誘導(dǎo)陰性對照;4.重組質(zhì)粒pET-28a-CEV112經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5 h表達(dá)產(chǎn)物

M.Protein molecular weight Mmarker;1.Supernatant after ultrasonic treatment;2.Precipitate after ultrasonic treatment;3.Expression products ofE.coliBL21 (DE3) transformed with pET-28a-CEV112 without IPTG induction;4.Expression products ofE.coliBL21 (DE3) transformed with pET-28a-CEV112 induced for 5 h by 1 mmol/L IPTG

圖4 融合蛋白CEV-CBP的可溶性分析

Fig.4 Solublility analysis of CEV-CBP fusion protein

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.E.coliBL21(DE3)陰性對照;2.轉(zhuǎn)化pET28a(+)空載體的E.coliBL21(DE3)未誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物;3.轉(zhuǎn)化pET28a(+)空載體的E.coliBL21(DE3)經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5 h表達(dá)產(chǎn)物;4.重組質(zhì)粒pET-28a-CEV112未誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物;5.重組質(zhì)粒pET-28a-CEV112經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5 h表達(dá)產(chǎn)物
M.Protein molecular weight Marker;1.E.coliBL21 (DE3) negative control;2.pET28a (+) expression products without IPTG induction; 3. pET28a (+) expression products induced for 5 h by 1 mmol/L IPTG;4.Expression products ofE.coliBL21 (DE3) transformed with pET-28a-CEV112 without IPTG induction;5.Expression products ofE.coliBL21 (DE3) transformed with pET-28a-CEV112 induced for 5 h by 1 mmol/L IPTG

圖5 融合蛋白CEV-CBP的Western blot分析

Fig.5 Western blot anlysis of CEV-CBP fusion protein

CEV在與機(jī)體免疫系統(tǒng)相互作用過程中，形成了一套自身免疫逃避系統(tǒng)，用以抵御機(jī)體的清除。其中CEV-CBP是一種與免疫調(diào)節(jié)作用相關(guān)的蛋白，主要參與干擾宿主的免疫防御。CEV-CBP能夠激活細(xì)胞趨化蛋白-1、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1α和RANTES等細(xì)胞因子，這些因子主要協(xié)助IFN-γ增強(qiáng)免疫應(yīng)答，所以也被稱作Th1細(xì)胞因子，這些因子也可以激活巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞以及CD8+細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體Th1免疫應(yīng)答[13]。然而，CEV-CBP能夠與G蛋白競爭結(jié)合機(jī)體自身產(chǎn)生的CBP，來阻止信號(hào)的傳導(dǎo)和細(xì)胞因子的趨化，抑制宿主的免疫應(yīng)答，但其具體的控制機(jī)制還不清楚[14]。

研究發(fā)現(xiàn)CEV112基因與CEV的致病性和毒力有一定的關(guān)系，這對于CEV疫苗的研發(fā)具有重要意義。本試驗(yàn)對CEV112基因展開研究，通過分子生物學(xué)的方法，成功克隆表達(dá)了CEV112基因，并通過可溶性分析表明，表達(dá)產(chǎn)物存在于包涵體內(nèi)，這不僅為融合蛋白CEV-CBP的大量表達(dá)以及純化做了良好鋪墊，而且也為CEV-CBP蛋白功能的深入研究以及單克隆抗體和疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning and Prokaryotic Expression of CEV112 Gene of Contagious Ecthyma Virus

YANG Xiao-jian,LI Ya-ying,PANG Feng,LI Guo-hua,PENG Dong-mei, ZHU Shu,NIE Xin,CAO Rui-yong,WANG Feng-yang,DU Li

(KeyLaboratoryofAnimalGeneticEngineeringofHaikouCity,KeyLaboratoryofTropicalAnimalReproduction&BreedingandEpidemicDiseaseReseachofHainanProvince,CollegeofTropicalAgricultureandForestry,HainanUniversity,Haikou,Hainan，570228,China)

To clone the CEV112 gene and make prokaryotic expression inEscherichiacoli,one pair of primers were designed according to the CEV112 gene sequence in GenBank, and then a target gene fragment with 867 bp was amplified by PCR.The cloning recomenbinant plasimid pMD20-T-CEV112 was constructed and transformed into theE.coliDH5α.The prokaryotic expression recombinant plasmid pET-28a-CEV112 was constructed after appraising,and transformed into theE.coliBL21(DE3).After induction with IPTG,the protein was detected by SDS-PAGE and Western blot.The results showed that the pET-28a-CEV112 prokaryotic expression vector was successfully constructed and expressed inE.coliBL21(DE3).The expression fusion protein was about 36 ku in molecular weight and it existed in the form of inclusion bodies,which would provide the research basis in the future.

CEV;CEV112 gene;cloning; prokaryotic expression

2016-07-26

海南省重大科技計(jì)劃項(xiàng)目(ZDKJ2016017-01)

楊小健(1991-)，男，山東濱州人，碩士研究生,主要從事動(dòng)物功能基因組學(xué)研究。*通訊作者

S852.659.1;Q789

A

1007-5038(2017)03-0068-05