豬五種繁殖障礙性疫病病原體多重PCR的建立及初步應(yīng)用

王苗苗，張凡慶，王 曼，朱建國

(上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院/上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240)

豬五種繁殖障礙性疫病病原體多重PCR的建立及初步應(yīng)用

王苗苗，張凡慶，王 曼，朱建國*

(上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院/上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240)

為了建立能夠同時(shí)檢測(cè)豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和豬細(xì)小病毒(PPV)的多重PCR，并用于豬場(chǎng)感染情況的動(dòng)態(tài)監(jiān)控以及臨床診斷，根據(jù)GenBank中已發(fā)表的5種病毒的基因序列，針對(duì)CSFV的E2、PRRSV的Nsp2、PRV的gB、PCV2的ORF2和PPV的VP2基因，分別設(shè)計(jì)了特異性引物。在建立的單項(xiàng)PCR基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了能同時(shí)檢測(cè)5種病毒的多重PCR，并具有較高的靈敏性和良好的特異性。采用建立的多重PCR對(duì)127份疑似病豬的扁桃體活體組織進(jìn)行檢測(cè)，檢出了5種病毒的存在，其中感染2種及以上病毒的樣品比例為38.6%(49/127)，表明該方法是一種快速、靈敏、高效的病原學(xué)檢測(cè)手段。

豬瘟病毒；豬繁殖與呼吸綜合征病毒；豬偽狂犬病病毒；豬圓環(huán)病毒2型；豬細(xì)小病毒；多重聚合酶鏈反應(yīng)

在豬場(chǎng)常發(fā)生的各類疫病中，豬繁殖障礙性疾病給豬場(chǎng)的整體經(jīng)濟(jì)效益造成了嚴(yán)重影響[1-3]，這類疫病主要表現(xiàn)為感染母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等，公豬發(fā)生一定的繁殖障礙，感染仔豬出現(xiàn)大量死亡，或發(fā)生混合感染和繼發(fā)感染[4]。如何有效預(yù)防和控制此類傳染性疾病的發(fā)生，保證豬群的良性發(fā)展，是一項(xiàng)亟待解決的艱巨任務(wù)，因此，做好豬群的疫病監(jiān)控工作就顯得尤為重要。豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)和豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起豬繁殖障礙性疫病的主要病原[5-6]。由于這幾種疫病在臨床上呈現(xiàn)相似的癥狀，又常常發(fā)生混合感染，根據(jù)臨床癥狀較難進(jìn)行鑒別診斷[5,7]。常規(guī)的診斷方法如病毒分離、血清學(xué)診斷方法等存在著耗時(shí)長、敏感度低的缺陷，已不能滿足現(xiàn)實(shí)臨床診斷需要。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，各種分子生物學(xué)檢測(cè)手段接連出現(xiàn)，大大提高了疫病的檢測(cè)水平，其中多重PCR具有敏感性高且可以一次檢測(cè)多種病原的優(yōu)勢(shì)，更加適于混合感染的快速診斷[8]。因此，建立能夠同時(shí)檢測(cè)CSFV、PRRSV、PRV、PCV2和PPV的多重PCR診斷方法，并用于豬群的實(shí)時(shí)監(jiān)控，及時(shí)準(zhǔn)確地對(duì)疫病進(jìn)行定性檢測(cè)，對(duì)于這些疫病的防控具有重要意義，也可為流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)手段[9]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 樣品采集于2014年—2015年間上海、江蘇、安徽地區(qū)部分豬場(chǎng)，采集臨床表現(xiàn)疑似患病豬的扁桃體活體組織，共127份。

1.1.2 病毒株、陽性對(duì)照 豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)，上海交通大學(xué)抗體工程實(shí)驗(yàn)室保存；豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬瘟病毒(CSFV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)，上海市動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心提供。

1.1.3 主要試劑 Trizol Reagent，Invitrogen公司產(chǎn)品；dNTP、TaqDNA 聚合酶、質(zhì)粒抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker DL 2 000、Agarose，TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA 瓊脂糖凝膠回收試劑盒，Axygen公司產(chǎn)品；病毒DNA抽提試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；DH5α感受態(tài)細(xì)胞，上海交通大學(xué)抗體工程實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank已發(fā)表的序列，應(yīng)用Primer5.0軟件對(duì)各自保守區(qū)設(shè)計(jì)5對(duì)引物(表1)，分別選擇CSFV的E2基因、PRRSV的NSP2基因、PRV的gB基因、PCV2的ORF2基因、PPV的VP2基因?yàn)槠鋽U(kuò)增靶序列，同時(shí)通過NCBI網(wǎng)站對(duì)其特異性進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，所設(shè)計(jì)引物均具有良好的特異性。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 多重PCR引物

1.2.2 病毒核酸的提取 取疑似病豬扁桃體活體組織于DEPC水處理過的2 mL離心管中，并加入1 mL PBS(pH7.2)，經(jīng)全自動(dòng)組織研磨機(jī)混合研磨勻漿后，反復(fù)凍融3次，8 000 r/min離心5 min，上清轉(zhuǎn)移至DEPC水處理過的1.5 mL離心管中，按照DNA/RNA提取試劑盒說明書操作步驟分別進(jìn)行。

1.2.3 RNA病毒模板制備 取抽提好的病毒RNA，按TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系為10 μL，其中RNA 8 μL、TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒中5×Primer Script RT Master Mix 2 μL。經(jīng)37℃1 5min，85℃ 5 s，4℃ 1 min后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 單項(xiàng)PCR檢測(cè)方法的建立 分析測(cè)定PCR最佳反應(yīng)條件，包括退火溫度、引物濃度、MgCl2濃度等。分別確定每種病毒的單項(xiàng)PCR最佳反應(yīng)條件。單項(xiàng)PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL∶150 mmol/L MgCl22 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，10×Taqbuffer 2.5 μL，上、下游引物各0.5 μL(每條引物濃度25 nmol/L)，模板1 μL，0.5 U/μLTaq酶2 μL，加滅菌雙蒸水補(bǔ)足25 μL。單項(xiàng)PCR擴(kuò)增條件：CSFV、PRRSV擴(kuò)增：95℃ 5 min;94℃ 30 s，55℃ 50 s，72℃ 30 s，循環(huán)30次；72℃延伸10 min。PRV、PCV2、PPV擴(kuò)增：95℃ 5 min;94℃ 30 s，56℃ 50 s，72℃ 45 s，循環(huán)30次；72℃延伸10 min。

1.2.5 構(gòu)建模板質(zhì)粒 將得到的陽性樣品PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化后，分別克隆至PMD-18T Vector載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后用質(zhì)粒抽提試劑盒進(jìn)行提取。提取的質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度。

1.2.6 多重PCR檢測(cè)方法的建立 在建立的5種病毒單項(xiàng)PCR基礎(chǔ)上，對(duì)多重PCR反應(yīng)體系中各項(xiàng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定多重PCR最佳反應(yīng)條件：總體積25 μL，包括150 mmol/L MgCl22 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10×Taqbuffer 2.5 μL，5種病毒上下游引物各0.5 μL(每條引物濃度25 nmol/L)，DNA/cDNA模板2 μL，0.5 U/μLTaq酶2 μL，加滅菌雙蒸水補(bǔ)足25 μL。多重PCR擴(kuò)增條件：95℃ 5 min;94℃ 30 s，56℃ 50 s，72℃ 45 s，循環(huán)35次；72℃延伸10 min。

1.2.7 敏感性試驗(yàn) 采用超微量紫外可見分光光度計(jì)對(duì)5種病毒的質(zhì)粒濃度進(jìn)行測(cè)定，PRV、CSFV、PCV2、PRRSV、PPV初始濃度分別為92、39、12、10、21 ng/μL，然后分別進(jìn)行10倍系列稀釋，100～10-5倍。等比混合后按上述優(yōu)化后的多重PCR反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)，確定其敏感性。

1.2.8 特異性試驗(yàn) 在加入5種被檢病毒引物的前提下，分別對(duì)CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、PPV及該5種病毒混合物、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、豬鏈球菌(S.streptococcus)、副豬嗜血桿菌(H.parasuis)、大腸埃希菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)及陰性對(duì)照進(jìn)行多重PCR，以檢測(cè)其特異性。

1.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 采用已優(yōu)化的多重PCR對(duì)PRV、CSFV、PCV2、PRRSV、PPV 5種病毒的陽性樣品各2份重復(fù)試驗(yàn)3次，以確定該多重PCR的穩(wěn)定性。

1.2.10 臨床樣品檢測(cè) 從上海及其周邊地區(qū)部分豬場(chǎng)采集疑似病豬活體的扁桃體組織樣品，用已建立的多重PCR進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.11 序列分析 將PRV、CSFV、PCV2、PRRSV、PPV 5種病毒的陽性PCR產(chǎn)物膠回收并純化后，連接至PMD-18T Vector載體，轉(zhuǎn)化后進(jìn)行質(zhì)粒提取，將提取的質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，以驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增

用相應(yīng)引物分別對(duì)CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、PPV進(jìn)行單項(xiàng)及多重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖1，可觀察到843 bp(PRV)、627 bp(CSFV)、506 bp(PCV2)、404 bp(PRRSV)和254 bp(PPV)的條帶，大小與預(yù)期相符，陰性對(duì)照沒有擴(kuò)增出條帶。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000;1.陰性對(duì)照；2.PPV；3.PRRSV；4.PCV2；5.CSFV；6.PRV；7.CSFV+PRRSV；8.PRV+PCV2+PPV；9.CSFV+PRRSV+PRV+PCV2+PPV

M.DNA Marker DL 1 000;1.Negative control;2.PPV;3.PRRSV;4.PCV2;5.CSFV;6.PRV;7.CSFV+PRRSV;8.PRV+PCV2+PPV;9.CSFV+PRRSV+PRV+PCV2+PPV

圖1 PCR對(duì)5種病毒的擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1 PCR results of five viruses

2.2 多重PCR退火溫度的優(yōu)化

對(duì)多重PCR退火溫度進(jìn)行優(yōu)化(圖2)，結(jié)果顯示，不同退火溫度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響不大，最終選擇56℃作為多重PCR最佳退火溫度。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000;1～6.退火溫度分別為52、54、56、58、60、62℃的擴(kuò)增產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 1 000;1-6.Temperature 52,54,56,58,60 and 62℃ respectively

圖2 多重PCR最佳退火溫度的確定

Fig.2 Optimizing results of annealing temperature

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

采用優(yōu)化后的條件進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示(圖3)，在多重PCR中，PRV、CSFV、PCV2、PPV敏感性達(dá)到10-4倍稀釋度，最低檢出量分別為9.2、3.9、1.2、2.1 pg/μL，PRRSV敏感性達(dá)到10-3倍稀釋度，最低檢出量為10 pg/μL。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000;1～6.PRV、CSFV、PCV2、PRRSV、PPV分別按100至10-5倍稀釋

M.DNA Marker DL 1 000;1-6.Dilutions respectively 100-10-5of PRV,CSFV,PCV2,PRRSV,PPV

圖3 多重PCR敏感性試驗(yàn)

Fig.3 Sensitivity test of the multiplex PCR

2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果

按照已優(yōu)化的多重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行特異性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬鏈球菌(S.streptococcus)、副豬嗜血桿菌(H.parasuis)、大腸埃希菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)及陰性對(duì)照均未擴(kuò)增出條帶，而CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、PPV及該5種病毒混合模板可見清晰目的條帶(圖4)。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

重復(fù)檢測(cè)5種病毒陽性樣品3次，結(jié)果均一致，說明建立的多重PCR具有較好的穩(wěn)定性。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000;1.CSFV+PRRSV+PRV+PCV2+PPV；2.PRV；3.CSFV；4.PCV2；5.PRRSV；6.PPV；7.TGEV；8.PEDV；9.S.streptococcus；10.H.parasuis；11.E.coli；12.S.aureus；13.ddH2O

M.DNA Marker DL 1 000;1.CSFV+PRRSV+PRV+PCV2+PPV;2.PRV;3.CSFV;4.PCV2;5.PRRSV;6.PPV;7.TGEV;8.PEDV;9.S.streptococcus;10.H.parasuis;11.E.coli;12.S.aureus;13.ddH2O

圖4 多重PCR特異性試驗(yàn)

Fig.4 Specificity test of the multiplex PCR

2.6 多重PCR對(duì)臨床樣品的檢測(cè)

應(yīng)用多重PCR對(duì)127份疑似病豬活體扁桃體組織進(jìn)行檢測(cè)，并與單項(xiàng)PCR檢測(cè)結(jié)果相比較，結(jié)果見表2、表3和圖5。從表2中可看出，PCV2、PRRSV的陽性率較高，分別為44.9%和40.2%，PPV、PRV、CSFV次之，陽性率分別為9.5%、5.5%、2.4%。表3中可看出，感染2種及以上病毒的陽性比例為38.6%，其中PCV2和PRRSV混合感染陽性率最高，達(dá)23.6%，另外出現(xiàn)三重感染PRRSV+PCV2+PRV 2份、PRRSV+PCV2+CSFV 1份。

2.7 測(cè)序結(jié)果

將測(cè)序結(jié)果與GenBank中收錄的PRV、CSFV、PCV2、PRRSV、PPV 5種病毒參考序列進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，該5種病毒比對(duì)后的基因序列核苷酸同源性均在98%～99%范圍內(nèi)，說明多重PCR檢測(cè)的陽性結(jié)果為上述5種病毒。

表2 檢測(cè)結(jié)果

表3 混合感染統(tǒng)計(jì)結(jié)果

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.陽性對(duì)照；2.陰性對(duì)照照；3～20.部分臨床樣品

M.DNA Marker DL 2 000;1.Positive control;2.Negative control;3-20.Clinical samples

圖5 多重PCR對(duì)部分臨床樣品的檢測(cè)

Fig.5 Detection of clinical samples by multiplex PCR

3 討論

本試驗(yàn)成功建立了能夠同時(shí)檢測(cè)PRV、CSFV、PCV2、PRRSV、PPV 5種病毒的多重PCR，并通過采集上海及其周邊地區(qū)部分豬場(chǎng)疑似病豬的扁桃體活體組織，實(shí)現(xiàn)了對(duì)被檢豬場(chǎng)患病情況的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。通過對(duì)127份樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢出PCV2、PRRSV陽性率最高，均達(dá)到40%以上，以此可推測(cè)被檢豬群所屬地區(qū)主要感染病原為PCV2和PRRSV，可為豬場(chǎng)凈化豬群提供借鑒。

在多重PCR反應(yīng)中，引物的設(shè)計(jì)至關(guān)重要，它決定著多重PCR反應(yīng)的成功與否[10-12]。本試驗(yàn)在自行設(shè)計(jì)引物時(shí)，選取了5種病毒各自相對(duì)保守的基因序列，同時(shí)考慮到5種病毒擴(kuò)增片段大小的差異，結(jié)果表明，所設(shè)計(jì)引物均得到了良好的擴(kuò)增效果。另外，試驗(yàn)通過優(yōu)化反應(yīng)條件，使建立的多重PCR具有較高的敏感性和良好的特異性及穩(wěn)定性。陳光達(dá)等[8]建立了檢測(cè)PCV2、PPV、PRV、CSFV、PRRSV和JEV的多重PCR，其最低檢測(cè)限為450 pg。本試驗(yàn)所建立的多重PCR，5種病毒的最低檢出限均在1.2 pg～10 pg范圍內(nèi)，具有更高的敏感性，顯示出更高的檢出效率。

建立5種豬繁殖障礙性疫病病原體的多重PCR檢測(cè)方法，并用于種豬場(chǎng)的實(shí)時(shí)監(jiān)控，對(duì)于凈化種豬群和推廣優(yōu)良種豬具有重要意義。同時(shí)該方法可用于臨床診斷，為豬場(chǎng)采取必要防疫措施提供有力依據(jù)。

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Establishment and Application of a Multiplex PCR for Detecting Five Swine Viruses

WANG Miao-miao,ZHANG Fan-qing,WANG Man,ZHU Jian-guo

(ShanghaiKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology,SchoolofAgricultureandBiology,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai,200240,China)

To establish the multiple PCR for detecting classical swine fever virus(CSFV),porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV),porcine pseudorabies virus(PRV), porcine circovirus type 2(PCV2) and porcine parvovirus(PPV),five pairs of primers were designed to amplify CSFV E2,PRRSV Nsp2,PRV gB,PCV2 ORF2 and PPV VP2 according to the gene sequences in GenBank of these five viruses.Reaction conditions were optimized to establish the multiplex PCR on the basis of the single PCR.The multiplex PCR had good sensitivity and specificity.To evaluate the multiplex PCR,127 clinical samples were detected for detecting the five viruses,among which 38.6%(49/127) samples were detected for two or more viruses,which means the multiplex PCR can be used as rapid diagnosis for single or mixed clinical samples infected with CSFV,PRRSV,PRV,PCV2,PPV.

CSFV;PRRSV;PRV;PCV2; PPV;multiplex PCR

2016-07-27

上海市生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目[滬農(nóng)科產(chǎn)字(2016)第6號(hào)]

王苗苗(1991-)，女，河南沈丘人，碩士研究生，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。*通訊作者

SS854.44;S858.28

A

1007-5038(2017)03-0027-05