2015年—2016年度南寧部分地區(qū)豬戊型肝炎病毒基因型分析

賀 微，姚 靜，覃一峰，林思遠(yuǎn)，鄒 柳，黃加濱，韋 瑩，歐陽康，陳 櫻，黃偉堅，韋祖樟

(廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物傳染病研究室，廣西南寧 530005)

2015年—2016年度南寧部分地區(qū)豬戊型肝炎病毒基因型分析

賀 微，姚 靜，覃一峰，林思遠(yuǎn)，鄒 柳，黃加濱，韋 瑩，歐陽康，陳 櫻，黃偉堅，韋祖樟*

(廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物傳染病研究室，廣西南寧 530005)

為了解廣西豬群中戊型肝炎病毒(HEV)基因型，利用套式RT-PCR用對南寧周邊豬場采集到的104份新鮮豬糞便進(jìn)行HEV檢測、分離并成功擴(kuò)增和克隆了11株陽性毒株的ORF2基因部分保守片段。序列測定結(jié)果表明，11株HEV ORF2序列自身核苷酸同源性為97.7%～100%，推導(dǎo)編碼的氨基酸同源性為97.9%～100%；與4型HEV代表毒株Ch-S-1、Ch-T11、swGX40等的核苷酸同源性為84.6%～90.6%，而與其他各型之間的同源性較低。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹結(jié)果表明，11株HEV廣西株為基因4型，其中，10株HEV為4a亞型，1株毒株為4e亞型。結(jié)果表明，廣西豬群中流行的HEV均為基因4型，且以4a亞型為優(yōu)勢流行毒株。

戊型肝炎病毒；基因型；豬

戊型肝炎(Hepatitis E，HE)是戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的經(jīng)消化道傳播的人畜共患病[1]。目前戊型肝炎主要分為4類，分別為A類肝炎(人、豬、野豬、鹿、兔子、駱駝等)、B類肝炎(禽類)、C類肝炎(鼠、大袋貍、亞洲麝香鼩、雪貂)和D類肝炎(蝙蝠)[2]。其中A類戊型肝炎又可以分為7個型：基因1型和2型主要通過糞-口傳播給人類，具有一定的地域性，主要存在于發(fā)展中國家如亞洲、非洲，以及美國中部地區(qū)[3]；基因3型和4型(中國和日本)是一種動物源性的傳染病，可以感染豬、兔子等多種動物，發(fā)達(dá)國家已在人類的食物鏈中檢測到3型HEV，使得HEV進(jìn)一步感染人[4-6]；基因5型和6型主要感染野豬，基因7型感染駱駝。

HEV是一種單股正鏈無囊膜的RNA病毒，基因組全長約7.2 kb，含3個非連續(xù)及部分重疊的開放閱讀框(ORFs)，5′端有帽子結(jié)構(gòu)，3′端還有polyA尾巴[7]。ORF1長約為5 kb，主要編碼一些與病毒復(fù)制相關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白，包括RNA依賴的RNA聚合酶、RNA解鏈酶、半胱氨酸蛋白酶、甲基轉(zhuǎn)移酶等和X結(jié)構(gòu)域、Y結(jié)構(gòu)域等[8]。ORF2長約2 kb，為病毒的衣殼蛋白，組成了病毒的抗原決定簇，同時也是HEV抗體檢測的靶抗原[9]。ORF2編碼的蛋白C端2/3區(qū)域含有豐富的B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原表位，Meng J等[10]研究發(fā)現(xiàn)其C端452-617 aa存在抗原表位。最新研究表明，ORF2編碼蛋白的483-533 aa存在高度豐富的抗原表位，關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)為488、489、512、533、483、530[11]。ORF3基因組結(jié)構(gòu)最小，在3型HEV中ORF3和ORF1重疊3 bp，在4型HEV中其二者無重疊；4型HEV中ORF3完全包含在ORF2中，重疊部分被認(rèn)為是ORF2的基因序列最保守的區(qū)域，但該區(qū)所編碼的蛋白質(zhì)片段變異性最大，推測與該序列折疊的次級結(jié)構(gòu)有關(guān)[12]。

世界范圍內(nèi)目前有1%～4%的人感染戊型肝炎病毒，一些地方的孕婦感染率高達(dá)20%以上[13]。研究表明，在歐洲，人群中HE患病率為1.9%～52.5%[14]。我國南方地區(qū)也是人HE的高發(fā)區(qū)，發(fā)病主要集中在冬季和春季，40歲～60歲的人較易感染，男女感染率比例約為2.39∶1[4]。HEV已嚴(yán)重威脅到公共衛(wèi)生健康。因此，為有效預(yù)防和控制HEV，本研究通過對廣西南寧豬群中豬戊型肝炎病毒進(jìn)行監(jiān)測，并對其部分ORF2片段進(jìn)行克隆和序列分析，從而了解當(dāng)前廣西南寧豬群中HEV流行特點(diǎn)和趨勢，為HEV分子生物學(xué)特性研究和防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料、菌株 從南寧周邊4個規(guī)?；i場采集104份新鮮豬糞便，用套式RT-PCR進(jìn)行HEV RNA檢測，選取11份陽性材料(表1)進(jìn)行ORF2部分序列測定與序列分析。大腸埃希菌DH5α，購自北京康為世紀(jì)公司。

表1 本研究中毒株來源

1.1.2 主要試劑 Trizol RNA 提取液，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；TaqMix、dNTP、RNase Inhibitor、M-MLV、pMD18-T vector克隆載體、Q.CutBamHⅠ和Q.CutHind Ⅲ等，購自TaKaRa公司；DNA純化回收試劑、質(zhì)粒小提試劑盒，購自O(shè)mega公司。

1.1.3 引物 按照表2設(shè)計引物，用于擴(kuò)增HEV ORF2部分保守序列。

表2 本研究HEV ORF2擴(kuò)增引物

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 挑取新鮮糞便0.5 g于10 mL高壓滅菌的離心管中，再加入5 mL滅菌PBS，制成100 g/L的懸液，8 000 r/min 離心10 min。直接抽提上清RNA或保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒RNA提取和RT-PCR 采用Trizol法抽提病毒總RNA。反轉(zhuǎn)錄體系：取RNA模板16.0 μL，反向引物HEV-P2 (25 pmol/μL)1.0 μL，條件：70℃ 5 min，90℃ 5 min，冰浴5 min；再向以上體系中依次加入5×M-MLV buffer 5.0 μL、dNTP Mixture 2.0 μL 、RNasin Inhibitor 0.5 μL、M-MLV Reverse Transcriptase 0.5 μL，42℃ 反轉(zhuǎn)錄1 h，即得到cDNA。套式PCR反應(yīng)體系如下：TaqMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上下游引物(25 pmol/μL)分別0.5 μL，cDNA 3.0 μL 。第一輪PCR(HEV-P1/HEV-P2)反應(yīng)條件：95℃ 3 min；95℃ 1 min，53℃ 1 min，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。第二輪PCR(HEV-P3/HEV-P4)反應(yīng)條件：95℃ 3 min；95℃ 45 s，53℃ 45 s，72℃ 50 s，35個循環(huán)；72℃ 7 min。反應(yīng)結(jié)束后在12 g/L凝膠中電泳檢測分析擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.3 PCR產(chǎn)物回收和克隆 將目的條帶進(jìn)行純化并將純化產(chǎn)物與pMD18-T載體4℃連接過夜，次日轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。

1.2.4 重組質(zhì)粒的鑒定和序列分析 挑取單個菌落，37℃搖床培養(yǎng)過夜，小提質(zhì)粒，用Q.CutBamHⅠ和Q.CutHind Ⅲ 37℃酶切2 h。將鑒定為陽性的質(zhì)粒送上海杰李生物公司測序,并將測序所得序列用Lasergene、MEGA6.0等生物軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 HEV ORF2基因的克隆

以表2中的兩對引物對HEV分離株進(jìn)行部分ORF2的擴(kuò)增，本研究共成功擴(kuò)增到11條ORF2序列，目的片段為436 bp，與目的片段一致(圖1)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～2.ORF2基因；3.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000;1-2.ORF2 gene;3.Negative control

圖1 豬戊型肝炎病毒ORF2基因部分片段擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1 RT-PCR amplification of partial ORF2 gene from swine hepatitis E virus

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

將目的片段克隆到T載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后，抽提質(zhì)粒。用Q.CutBamHⅠ和Q.CutHind Ⅲ對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，得到了約3 000 bp和436 bp的條帶，與預(yù)期片段相符(圖2)，說明成功克隆了目的片段。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1～2.雙酶切產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 5 000;1-2.Recombinant plasmids by double enzyme digestion

圖2 重組質(zhì)粒pMD18-T-HEV-ORF2雙酶切鑒定結(jié)果

Fig.2 Identification of recombinant plasmid pMD18-T-HEV-ORF2 by double enzyme digestion

2.3 序列同源性比較

將陽性克隆進(jìn)行測序，獲得11株HEV ORF2序列。與NCBI上HEV各型代表株對應(yīng)序列進(jìn)行核苷酸和氨基酸同源性比較(圖3)。結(jié)果表明,11株HEV ORF2序列自身核苷酸同源性為97.7%～100%，推導(dǎo)編碼的氨基酸同源性為97.9%～100%。與1型HEV037、Xinjiang1986株核苷酸同源性為78.7%～83.0%，氨基酸同源性為94.5%～96.6%；與2型M1株核苷酸和氨基酸同源性分別為77.8%～79.2%和93.8%～95.1%；與3型Meng、HEV-US1株核苷酸同源性為78.0%～79.8%，氨基酸同源性為95.9%～97.2%；與4型參考株核苷酸和氨基酸的同源性分別為84.6%～90.6%和96.6%～100%，其中與4a亞型Ch-S-1、Ch-T11等核苷酸同源性88.1%～90.6%，氨基酸同源性98.6～100%；與5型參考株JBOAR135-Shiz09核苷酸和氨基酸同源性分別為78.4%～80.0%和94.5%～95.9%；與6型參考株wbJOY-06和wbJNN-13核苷酸同源性為78.2%～81.0%，氨基酸同源性為93.8%～95.2%；與7型參考株178C和180C核苷酸同源性為78.0%～78.7%，氨基酸同源性為93.8%～95.9%。

2.4 遺傳進(jìn)化分析

將本研究中11株廣西HEV ORF2推導(dǎo)編碼的氨基酸序列與NCBI發(fā)表的HEV毒株對應(yīng)氨基酸序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，11株廣西HEV屬于4型，除GXNN1507處于4e亞型外，外其余10株HEV都處于4a亞型(圖4)。

3 討論

我國是HEV流行區(qū)，1986年—1988年新疆人群中大暴發(fā)HEV時約有11 920人發(fā)病，該報道是我國人群感染HEV最多的一次流行[14]。廣西作為我國HEV的高感染區(qū)，各縣(市、區(qū))報告人HE年發(fā)病率為0/10萬～12.91/10萬且有逐年升高趨勢，非國家級貧困地區(qū)發(fā)病率為70.59%，高于國家級貧困地區(qū)(42.86%)[15]。豬是公認(rèn)的HEV重要儲存宿主和傳染源，劉艷玲等[16]用雙抗原夾心ELISA檢測廣西14個市豬群HEV抗體陽性率高達(dá)77.3%。自Meng X J等[17]1997年首次從豬體內(nèi)鑒定出到戊型肝炎病毒，我國作為生豬養(yǎng)殖大國，且以豬肉消費(fèi)為主的國家，為了控制HE的傳播和流行，同時也為了減少戊型肝炎對人類的危害，必須從源頭上控制該病原。

文獻(xiàn)報道，廣西地區(qū)豬源HEV主要為4a和4b亞型，人源HEV為1b、4a和4b亞型，且 4a、 4b、 4d、4g、 4h和4i和兔源HEV為本土基因型，基因3型和4e亞型為外來基因型[18]。本研究通過對廣西周邊豬場采集到的104份新鮮豬糞進(jìn)行病毒檢測，并成功擴(kuò)增到11份陽性毒株部分ORF2序列，對其序列進(jìn)行測定并與GenBank上HEV各型參考株進(jìn)行同源性和遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，11株HEV均處于4型分支上，且與4型參考株核苷酸同源性為84.6%～90.6%，氨基酸同源性為96.6%～100%，其中與4a亞型Ch-S-1、Ch-T11等核苷酸同源性高達(dá)88.1%～90.6%，但與4b亞型swGX40的同源性為87.8%～89.0%，說明4a亞型為廣西HEV的優(yōu)勢基因亞型，與先前研究報道相一致。我國華東地區(qū)曾報道人感染4e亞型HEV[19]，但是，截止目前4e亞型在我國仍然流行較少。本研究中系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹是基于436bp構(gòu)建，所以分離到的GXNN1507毒株是否真正處于HEV 4e亞型仍需進(jìn)一步研究。

HEV ORF2是病毒的衣殼蛋白，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的主要抗原。國內(nèi)外學(xué)者通過對HEV ORF2基因的不同抗原活性區(qū)進(jìn)行原核表達(dá)，確定了各型HEV ORF2的中和抗原表位，為研制新型基因工程疫苗提供了重要依據(jù)。但是，到目前為止，HEV仍不能在細(xì)胞上大量培養(yǎng)，從而阻斷了豬HEV相關(guān)疫苗的研究。因此，開展HEV的分離培養(yǎng)、HEV ORF2靶基因的研究，為HEV的診斷、防控奠定良好的基礎(chǔ)，同時也為公共衛(wèi)生健康起到推進(jìn)作用。

圖4 HEV ORF2基因推導(dǎo)編碼的氨基酸序列遺傳進(jìn)化分析

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Analysis of Swine Hepatitis E Virus Genotype in Nanning City of Guangxi from 2015 to 2016

HE Wei,YAO Jing,QIN Yi-feng,LIN Si-yuan,ZOU Liu,HUANG Jia-bin,WEI Ying, OUYANG Kang,CHEN Ying,HUANG Wei-jian,WEI Zu-zhang

(AnimalInfectiousDiseaseLaboratory,CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning，Guangxi，530005,China)

In oder to investigate genotype of swine hepatitis E virus (HEV) in Guangxi,in this study,104 fresh fecal samples were collected from swine farms around Nanning and screened by nested RT-PCR for HEV virus.The PCR results showed that 11 out of 104 samples were HEV virus positive.The amplified partial ORF2 gene fragments were cloned,sequenced and analyzed.The results showed that nucleotide homology of 11 strains was 97.7% -100% and amino acids homology was 97.9%-100%.It shared a higher nucleotide homology 84.6%-90.6% with HEV genotype 4 Ch-S-1,Ch-T11,swGX40 than that with other HEV genotypes.The phylogenetic tree indicated that 11 HEV strains belonged to HEV genotype 4, most of the HEV strains were clustered in 4a subtype,while a strain classified into subtype 4e.These data presented in this study indicated that the prevalence of HEV strains were genotype 4,subtype 4a was the dominant prevalent subtype in swine in Guangxi.

HEV;genotype；swine

2016-07-07

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372444)；廣西大學(xué)科研基金項(xiàng)目(XGZ130959)

賀 微(1991-)，女，陜西渭南人，碩士研究生，主要從事動物傳染病與分子免疫學(xué)研究。*通訊作者

S852.659.6

A

1007-5038(2017)03-0005-06