14歲以下兒童抗耶氏肺孢子菌合成抗原IgG和IgM抗體的調(diào)查

烏姍娜 郭爽 靳慶娥 田小軍 李威 栗紹剛 任翊 王剛

100050 北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院檢驗(yàn)科(烏姍娜、靳慶娥、王剛)；100050 北京， 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院 北京熱帶醫(yī)學(xué)研究所 熱帶病防治研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(郭爽、田小軍、李威、栗紹剛、任翊)烏珊娜、郭爽為對(duì)本文同等貢獻(xiàn)

耶氏肺孢子菌(Pneumocystisjirovecii，Pj)是肺孢子菌肺炎(Pneumocystis pneumonia，PCP)的病原體，是免疫缺陷患者重要的致死原因[1-2]。Pj的主要表面糖蛋白(Major surface glycoprotein，Msg)是Pj表達(dá)量最大的分泌蛋白，是Pj與宿主免疫相互作用的重要抗原，其誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生的特異性抗體，不僅是人群感染Pj的血清學(xué)證據(jù)，也是宿主清除Pj的重要手段[3]。Pj僅感染人類在人群中普遍存在，出生后人群感染Pj的流行病學(xué)情況認(rèn)識(shí)很少。

本研究利用重組主要表面抗原(Recombinant Msg，rMsg)，建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，對(duì)北京地區(qū)14歲以下隨機(jī)人群201例血清標(biāo)本，進(jìn)行抗Pj rMsg IgG和IgM抗體檢出情況的調(diào)查，從而確定其是否感染過(guò)及正在感染肺孢子菌。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 主要試劑：谷胱甘肽Sepharose(Novagen)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG抗體(北京中杉金橋)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgM抗體(上海生工生物)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 標(biāo)本來(lái)源：(1)Pj rMsg表達(dá)載體由北京市熱帶醫(yī)學(xué)研究所制備[4]。

(2)14歲以下人群血清隨機(jī)收集自2015年5月5日至2015年10月14日期間，血清來(lái)自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院檢驗(yàn)科病毒室進(jìn)行巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型、弓形體、風(fēng)疹病毒IgM抗體檢測(cè)項(xiàng)目樣本。共201份血清入組，每份樣本其病例臨床信息資料完整，本研究得到首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

1.2方法

1.2.1 人群陰性對(duì)照血清的制備：將純化后的可溶Pj rMsg原核表達(dá)抗原按100 μg/cm2的量滴在硝酸纖維(Nitrocellulose，NC)膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后用PBS清洗膜，將抗原標(biāo)記的NC膜分別放入20例隨機(jī)血清中，室溫孵育1 h后，取出NC膜丟棄，按上述方法4 ℃過(guò)夜第二次吸附，使血清中可能存在的抗Pj rMsg抗體完全吸附掉，制備成陰性對(duì)照血清。將陰性標(biāo)準(zhǔn)血清按1∶100稀釋，稀釋液為0.05%PBST含有5%脫脂奶粉和5%(v/v)pGEX-3X 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Rosetta在同樣條件下誘導(dǎo)后獲得的可溶蛋白。Pj rMsg抗原酶標(biāo)板包被量為0.2 μg/孔，4 ℃過(guò)夜。設(shè)空白對(duì)照，TMB顯色15 min，2 mol/L H2SO4終止后用酶標(biāo)儀(Synergy H1)檢測(cè)，用450 nm/630 nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)。樣本OD值=樣本(OD450-OD630)-[空白(OD450-OD630)]。計(jì)算20例陰性標(biāo)準(zhǔn)血清OD值的分布情況。20份陰性標(biāo)準(zhǔn)血清混合后分裝保存，作為陰性對(duì)照。預(yù)實(shí)驗(yàn)中選取OD值最高的血清2份分裝保存，作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.2 人群血清ELISA試驗(yàn): 用1.2.1中稀釋液按照1∶100稀釋樣本血清，抗體稀釋濃度分別為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG抗體1∶2 000，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgM抗體1∶10 000。用1.2.1中建立的陰性和陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行樣本血清抗體篩選，每次ELISA試驗(yàn)均設(shè)空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，當(dāng)陰性對(duì)照OD值小于通過(guò)陰性標(biāo)準(zhǔn)血清判定的閾值(Cutoff值)，陽(yáng)性對(duì)照OD值大于閾值時(shí)認(rèn)為本次試驗(yàn)有效。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，正態(tài)分布采用K-S檢驗(yàn)(Kolmogorov-Smirnov)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.01認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1調(diào)查人群的人口學(xué)特征在201名14歲以下的人群中，女性106例(52.7%)。按出生年齡分成3組，其中出生日齡1～30 d組78例(38.8%)，4.45 d±5.70 d(1～26 d)；出生1～12月齡組33例(16.4%)，4.09 m±3.19 m(1～10 m)；出生年齡1歲～14歲組90例(44.8%)，4.16歲±3.05歲(1～14歲)。按臨床診斷分為肺炎組76例(37.8%)，非肺炎組125例(62.2%)。

2.2ELISA調(diào)查人群抗PjrMsgIgG抗體20例陰性標(biāo)準(zhǔn)血清測(cè)得IgG抗體OD值0.010±0.007，正態(tài)分布K-S檢驗(yàn)(Ζ=1.000，P=0.270)，呈正態(tài)分布。IgG抗體數(shù)值的閾值按均值+2×標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算，以O(shè)D值>0.024定義為陽(yáng)性。 按照上述標(biāo)準(zhǔn)，201例入組人群血清抗Pj rMsg IgG抗體陽(yáng)性率為25.9%(52/201)，其中男性陽(yáng)性率為25.3%(24/95)，女性陽(yáng)性率為26.4%(28/106)，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.035，P=0.852)。不同年齡組的陽(yáng)性率分別為：1 d～30 d年齡組10.3%(8/78)，1～12月齡年齡組21.2%(7/33)，1歲～14歲組41.1%(37/90)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.190，P=0.000)，見(jiàn)圖1。

注：*每個(gè)年齡組的anti-Pj rMsg IgM的陽(yáng)性率(%)圖1 抗Pj rMsg IgM陽(yáng)性人群年齡分布Note: * Anti-Pj rMsg IgM positivity in each age groupFig.1 Age distribution of anti-Pj rMsg IgM antibody positive cases

2.3ELISA調(diào)查人群抗PjrMsgIgM抗體20例陰性標(biāo)準(zhǔn)血清測(cè)得IgM抗體的OD值為0.007±0.006，正態(tài)分布K-S檢驗(yàn)(Ζ=1.190，P=0.118)顯示其OD值呈正態(tài)分布。IgM抗體數(shù)值的閾值按均值+2×標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算，以O(shè)D值>0.019定義為陽(yáng)性。 201例人群血清抗Pj rMsg IgM抗體陽(yáng)性率為43.3%(87/201)，其中男性陽(yáng)性率為42.1%(40/95)，女性陽(yáng)性率為44.3%(47/106)，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.102，P=0.750)。不同年齡組中IgM抗體陽(yáng)性率分別為：1 d～30 d年齡組6.4%(5/78)，1～12月齡年齡組39.4%(13/33)，1歲～14歲組76.7%(69/90)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=84.260，P=0.000)。肺炎組陽(yáng)性率59.2%(45/76)，非肺炎組陽(yáng)性率33.6%(42/125)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.628，P=0.000)。

2.4ELISA調(diào)查人群抗PjrMsgIgG和IgM抗體同時(shí)檢出情況入組人群血清抗Pj rMsg IgG和IgM抗體同時(shí)檢出情況見(jiàn)表1，該人群暴露Pj后的抗Pj rMsg IgG或IgM抗體總體檢出陽(yáng)性率高達(dá)46.8%。肺炎組抗Pj rMsg IgG或IgM抗體陽(yáng)性率65.8%(50/76)，非肺炎組陽(yáng)性率35.2%(44/125)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.764，P=0.000)。

表1 抗PjMsg IgG和IgM抗體篩查結(jié)果Tab.1 Results of screening for anti-Pj Msg IgG and IgM antibodies

3 討論

Pj廣泛存在于人群中[5]，免疫功能健全的個(gè)體暴露后可通過(guò)先天免疫和適應(yīng)性免疫及時(shí)清除吸入的Pj[6]，但免疫功能低下個(gè)體可以出現(xiàn)PCP，隨著免疫治療的廣泛應(yīng)用，有報(bào)道在使用環(huán)磷酰胺[7]、利妥昔單抗[8]和依那西普[9]后出現(xiàn)PCP，所以PCP是臨床各個(gè)科室都可能見(jiàn)到的臨床問(wèn)題，而對(duì)于它的自然感染過(guò)程相關(guān)流行病學(xué)資料有限。本研究用rMsg為抗原蛋白建立ELISA方法，進(jìn)而分析Pj抗體。既往研究中Daly KR等[10]用原核細(xì)胞表達(dá)了三段Msg合成抗原，Msg A、Msg B和Msg C，均為利用6個(gè)組氨酸純化的包涵體抗原。其中MsgA(氨基酸8-123)與本研究使用的Pj rMsg(氨基酸2-114)部分重疊，連續(xù)8個(gè)氨基酸一致的部分有2段，一致率60%(70/116)。國(guó)外流行病學(xué)調(diào)查表明，健康兒童在12月齡時(shí)抗MsgA IgG抗體出現(xiàn)峰值，在10月齡時(shí)抗MsgC IgG抗體出現(xiàn)峰值[11]，成人時(shí)抗Pj IgG抗體陽(yáng)性率85%[12]。本研究中抗Pj rMsg IgG和IgM抗體陽(yáng)性率均隨著年齡增加而增加。研究顯示Pj IgM抗體一般在感染后2～4周出現(xiàn)，1 d～30 d年齡組抗Pj rMsg IgM檢出率為2.6%(2/78)，到1～12月齡年齡組增加至39.4%，說(shuō)明個(gè)體出生后呼吸系統(tǒng)暴露Pj并產(chǎn)生免疫應(yīng)答，IgM抗體陽(yáng)性率隨即不斷增高，到1歲～14歲時(shí)增至76.7%，到成人后陽(yáng)性率開(kāi)始下降：20～29歲年齡組 32.9%(28/85)、30歲～ 39歲年齡組27.6%(24/87)，到40歲～50歲年齡組陽(yáng)性率再次上升到62.8%(59/94)[13]，呈現(xiàn)1歲～14歲和40歲～50歲兩個(gè)年齡組檢出率高的雙峰現(xiàn)象，推測(cè)年幼與年長(zhǎng)人群需要啟動(dòng)體液免疫清除Pj，而健康成人隨時(shí)暴露隨時(shí)清除，不需要啟動(dòng)特異性體液免疫有關(guān)。

關(guān)于Pj對(duì)于兒童呼吸系統(tǒng)致病性的觀察結(jié)論有爭(zhēng)議，Rivero L[14]報(bào)道了1例6月齡嬰兒感染PCP家庭成員調(diào)查情況，采用Pj線粒體大亞基rRNA(Mitochondrial large subunit rRNA，mtLSUrRNA)做為靶基因進(jìn)行巢氏PCR，結(jié)果父母及嬰兒兄長(zhǎng)均為陰性，祖父母為陽(yáng)性而且祖父的Pj mtLSUrRNA基因型與嬰兒一致，作者推測(cè)患兒PCP由祖父?jìng)魅緦?dǎo)致。但是Vargas等[15]調(diào)查了圣地亞哥1999—2004年128例猝死嬰兒(平均年齡101 d)，利用Pj mtLSUrRNA作為靶基因進(jìn)行巢氏PCR，并進(jìn)行免疫熒光顯微鏡檢查(immunofluorescence microscopy，IF)，結(jié)果82.0%(105/128)Pj 巢氏PCR陽(yáng)性，3-4月齡組病例中陽(yáng)性率最高(97.6%，40/41)，113例死亡原因不明組和15例死亡病因明確組比較，Pj檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(84.0% vs. 66.7%，P=0.28)，作者認(rèn)為Pj與嬰兒猝死無(wú)關(guān)。雖然本研究中抗Pj rMsg IgM陽(yáng)性率肺炎組(59.2%)高于非肺炎組(33.6%)，但研究為回顧性研究、肺炎診斷為臨床診斷，沒(méi)有前瞻性研究中嚴(yán)格的肺炎定義和影像學(xué)證據(jù)，所以結(jié)果不能明確支持Pj在14歲以下人群肺炎中的致病意義。

結(jié)論：北京地區(qū)14歲以下人群抗Pj rMsg IgG或IgM抗體總體檢出陽(yáng)性率為46.8%，陽(yáng)性率隨著出生后年齡的增加而逐漸增加。

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