廣西獼猴中發(fā)現(xiàn)GⅡ.17型諾如病毒及其全基因組序列分析

信云云 敖元云 李利利 虞結(jié)梅 李金松 林琳 張兵

410003 長(zhǎng)沙，湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒童醫(yī)學(xué)中心(信云云、張兵)；100052 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所腹瀉室(敖元云、李利利、虞結(jié)梅、李金松)；250014 濟(jì)南，山東省疾病預(yù)防控制中心艾滋病防治所(林琳)信云云、敖元云對(duì)本文同等貢獻(xiàn)

諾如病毒(Norovirus)是一種無(wú)包膜、單股正鏈RNA病毒，屬于杯狀病毒科諾如病毒屬，在各個(gè)年齡段的人群中均可引起散發(fā)或暴發(fā)的非細(xì)菌性胃腸炎。該病毒的傳播途徑較廣，主要包括糞—口途徑，也包括水源、食源及嘔吐物的氣溶膠途徑。大多數(shù)與諾如病毒有關(guān)的胃腸炎均發(fā)生在一些相對(duì)封閉的環(huán)境中，例如學(xué)校、幼兒園、餐廳、療養(yǎng)院以及醫(yī)院等[1-2]。該病毒的基因組是由三個(gè)開放閱讀框(Open reading frames, ORFs)以及兩端的5′/3′非編碼區(qū)(UTR)組成的，ORF1和ORF3分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(Non-structural protein)和一些次要結(jié)構(gòu)蛋白(Viral protein 2, VP2)，ORF2主要編碼結(jié)構(gòu)蛋白(Viral protein 1, VP1)，即衣殼蛋白[3-5]。根據(jù)諾如病毒衣殼區(qū)核苷酸序列的不同，諾如病毒可分為7個(gè)基因組(Genogroups, G)，GⅠ～GⅦ，其中基因組GⅠ包含9種基因型(Genotype)，GⅡ包含22種基因型[6]。在這些基因組中，GⅠ、GⅡ和GⅣ以感染人類為主。自2002年以來(lái)，GⅡ.4諾如病毒一直在全球的暴發(fā)流行中占優(yōu)勢(shì)地位[7]，但從2014年底至2015年初，GⅡ.17型諾如病毒變異株明顯增加，流行范圍涉及中國(guó)多個(gè)省市及一些東南亞國(guó)家，并取代GⅡ.4型的位置而成為了這些國(guó)家和地區(qū)導(dǎo)致人類非細(xì)菌性胃腸炎暴發(fā)流行的優(yōu)勢(shì)病毒株[8-15]。有研究顯示在不同種類的動(dòng)物體內(nèi)，例如牛、豬、狗、鼠、獅子有自然感染的諾如病毒變異株或者重組株，表明諾如病毒可能有一條向人類傳播的動(dòng)物源性傳播途徑，并由此推斷被病毒感染的人類也可將其傳染給家畜，并可能引發(fā)動(dòng)物胃腸炎的暴發(fā)[16-21]。2016年Farkas等首次報(bào)道了獼猴體內(nèi)存在自然感染的GⅠ、GⅡ及GⅣ型諾如病毒[22]。隨后譚明等在獼猴糞便中發(fā)現(xiàn)自然感染的GⅡ.17型諾如病毒[23]，并認(rèn)為獼猴可能是諾如病毒的自然儲(chǔ)存宿主，人諾如病毒感染獼猴后因基因重組或突變可能出現(xiàn)新的病毒變異株。但關(guān)于人獼猴間諾如病毒感染的機(jī)制、特征及傳播等特點(diǎn)的研究還非常缺乏。本研究采用建立好的HISEQ高通量測(cè)序技術(shù)，在廣西龍虎山的獼猴糞便中發(fā)現(xiàn)了GⅡ.17型諾如病毒，命名為GX213，測(cè)定和分析了該型諾如病毒的全基因組序列，對(duì)其在獼猴群中的檢出狀況進(jìn)行了調(diào)查研究。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源和處理本研究的標(biāo)本來(lái)源于2015年3～8月收集的我國(guó)廣西省龍虎山自然保護(hù)區(qū)野生獼猴的糞便標(biāo)本。對(duì)于龍虎山四個(gè)獼猴群，每個(gè)獼猴群每次采集5份糞便標(biāo)本，采集20次，每個(gè)猴群100份，共采集400份標(biāo)本。收集的全部標(biāo)本需低溫送至中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，立即保存于﹣70 ℃冰箱待用。陽(yáng)性標(biāo)本是利用建立好的HISEQ高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)的。在二級(jí)生物安全柜中取黃豆大小(約1 g)的糞便至1.5 ml EP管中，加入1 ml PBS處理液，制成10%的糞便懸液，6 868×g，4 ℃離心5 min，取140 μl上清液，存于-20 ℃冰箱待用。

1.2所用試劑核酸提取試劑盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit)和一步法RT-PCR試劑盒(Qiagen OneStep RT-PCR Kit)購(gòu)于德國(guó)Qiagen公司；SuperscriptⅢ反轉(zhuǎn)錄酶，RNA酶抑制劑，dNTP購(gòu)自于美國(guó)Invitrogen公司；Ex-Taq DNA聚合酶購(gòu)自日本TaKaRa公司；1-5TM 2×High-Fidelity Master Mix購(gòu)自于北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司，引物合成及DNA序列測(cè)定由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成；3′-5′ exo-Klenow試劑盒購(gòu)于美國(guó)New England Biolabs公司。

1.3高通量測(cè)序方法首先對(duì)上述糞便標(biāo)本進(jìn)行過(guò)濾和核酸酶消化處理，并使用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取病毒總核酸；其次使用隨機(jī)引物將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用exo-Klenow DNA聚合酶合成雙鏈DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，對(duì)300～500和500～800 bp區(qū)間的彌散帶進(jìn)行純化回收；然后將回收的DNA片段用超聲波打斷，分別使用Klenow酶和dATP將片段兩端修復(fù)，并在末端加“A”后，將其與接頭Solexa連接，根據(jù)接頭上的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增進(jìn)而構(gòu)建DNA文庫(kù)。最后將DNA文庫(kù)與病毒寡核苷酸探針庫(kù)結(jié)合，進(jìn)入Illumina測(cè)序。測(cè)序獲得的讀長(zhǎng)(Reads)經(jīng)BOWTIE 2和PRINSEQ等軟件除去低質(zhì)量和重復(fù)的序列，使用SOAPdenovo2軟件將序列拼接成重疊序列(Contigs)。進(jìn)一步通過(guò)Blastn和Blastx在GenBank中進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)，同時(shí)將E值≤10e-5的序列定為有意義的序列，之后去掉人、細(xì)菌、真菌等相關(guān)序列，利用MEGAN軟件對(duì)病毒序列進(jìn)行屬種分類。

1.4所用軟件利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，利用Clustalx進(jìn)行多序列比對(duì)，利用DNAStra中的SeqMan軟件進(jìn)行序列拼接，利用MEGA 6.0軟件中Clustal W軟件進(jìn)行序列的多重比對(duì)分析，采用鄰接法(Neighbor-Joining method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并進(jìn)行Bootstrap 500檢驗(yàn)，以及利用GeneDoc比對(duì)分析VP1區(qū)氨基酸序列的變異情況。用于序列進(jìn)化分析的參考株來(lái)自于GenBank中不同年代、不同國(guó)家和地區(qū)的諾如病毒株，其中包括14株人GⅡ.17型諾如病毒株和1株猴GⅡ.17型諾如病毒株，外群為GI.1型諾如病毒。

1.5特定病毒核酸提取及cDNA的合成使用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取上述糞便懸液上清中的病毒RNA，以RNA為模板，用特異性引物VN3T20進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。反應(yīng)體系及條件如下：RNA 9.5 μl，dNTP(10 mmol/L) 1 μl，VN3T20(20 μmol/L)2.5 μl，條件：65 ℃ 5 min， 冰浴5 min；然后再加以下體系：5 × First Stand Buffer 4 μl，DTT 1 μl，SuperscriptⅢ反轉(zhuǎn)錄酶2 μl，RNase Inhibitor 1 μl。反應(yīng)條件: 42 ℃ 90 min延伸，99 ℃ 5 min滅活。

1.6陽(yáng)性標(biāo)本的驗(yàn)證前期處理的糞便標(biāo)本，經(jīng)HISEQ高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)序，產(chǎn)生的10條序列被注釋到人GⅡ.17型諾如病毒。本研究利用文獻(xiàn)中提及的篩查GⅡ型諾如病毒的特異性引物G2SKR和MON431[24]，用一步法反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(OneStep RT-PCR)進(jìn)行陽(yáng)性標(biāo)本的確認(rèn)及篩查，共檢測(cè)出2份陽(yáng)性標(biāo)本。反應(yīng)體系：5 × Qiagen RT-PCR buffer 5 μl，dNTP(10 mmol/L) 1 μl，Enzyme Mix (RT and Taq) 1 μl，MON431(50 μmol/L) 0.5 μl，G2SKR(50 μmol/L) 0.5 μl，RNase Inhibitor 1 μl，Rnase free water 11 μl，RNA 5 μl；反應(yīng)條件：42 ℃ 30 min，95 ℃ 15 min，(95 ℃ 1 min, 50 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min)×40，72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

1.7病毒基因組的擴(kuò)增利用文獻(xiàn)[25,26]中已知的引物Ⅱ.17-2F、Ⅱ.17-2R、Ⅱ.17-4F、Ⅱ.17-4R，VN3T20、COG2F、G2SKF及根據(jù)諾如病毒參考株(GenBank ID:KU757050)設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增病毒的3個(gè)ORFs和2個(gè)末端區(qū)。擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將檢測(cè)到的與預(yù)期片段大小相符的PCR產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。實(shí)驗(yàn)中所用的引物序列見表1。

2 結(jié)果

2.1GX213的發(fā)現(xiàn)及檢測(cè)本研究通過(guò)HISEQ高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)廣西獼猴糞便中存在有GⅡ.17型諾如病毒基因序列。利用特異性引物G2SKR和MON431對(duì)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行確認(rèn)，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。PCR擴(kuò)增出約570 bp左右的ORF1和ORF2重疊區(qū)，即RdRp區(qū)與VP1區(qū)的交接區(qū)。擴(kuò)增出的PCR片段經(jīng)Blastn比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)病毒株屬于GⅡ.17型諾如病毒。本研究共400份糞便標(biāo)本，經(jīng)篩查后發(fā)現(xiàn)2份陽(yáng)性標(biāo)本，陽(yáng)性率為0.5%。

2.2GX213的全基因序列擴(kuò)增和拼接本研究選擇其中1份陽(yáng)性糞便標(biāo)本進(jìn)行該病毒全基因序列的擴(kuò)增，命名為GX213。經(jīng)相應(yīng)的特異性引物擴(kuò)增后分別獲得了5個(gè)特異性PCR片段，長(zhǎng)度分別為1 684 nt、1 511 nt、1 323 nt、1 483 nt和2 500 nt，利用DNAStar中的SeqMan軟件將分段獲得的基因片段進(jìn)行序列拼接后得到病毒基因組的全長(zhǎng)序列(7 565 nt)。經(jīng)和其他GⅡ.17型諾如病毒序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，GX213可分為3個(gè)ORFs、5′和3′非編碼區(qū)(UTR)和PloyA尾：ORF1(10～5 112 nt)、ORF2(5 093～6 715 nt)和ORF3(6 715～7 494 nt)，其中ORF1與ORF2之間重疊20 bp，ORF2和ORF3之間重疊1 bp。此序列已被NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)所收錄(GenBank ID:MF918359)。

表1 GⅡ.17諾如病毒基因序列驗(yàn)證和全基因組擴(kuò)增所用的引物

注：A,擴(kuò)增GⅡ.17型諾如病毒PCR片段所用引物；B,驗(yàn)證陽(yáng)性標(biāo)本所用引物

Note： A, The primers used for amplification of sequence of GⅡ.17 norovirus gene; B, The primers used for confirmation the positive samples for GⅡ.17 norovirus

2.3GX213的序列分析將獲得的GX213病毒株的全基因組序列進(jìn)行核苷酸序列的Blast比對(duì)分析，結(jié)果顯示，其與引起2014年至2015年亞洲部分地區(qū)暴發(fā)的新型人GⅡ.17型諾如病毒變異株CUHK-NS-613病毒株(GenBank ID：KU561248)同源性最高，為99.5%；分別將ORF1、ORF2、ORF3區(qū)核苷酸和氨基酸序列與GenBank中其他諾如病毒參考株進(jìn)行多比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)ORF1和ORF3都與CUHK-NS-613同源性最高(分別為99.5%，99.4%；99.5%，99.2%)，而在ORF2區(qū)，其與人GⅡ.17型諾如病毒變異株CUHK-NS-491毒株(GenBank ID：KP698928)具有最高的核苷酸同源性(99.4%)，氨基酸序列同源性高達(dá)99.8%；其中，完整的P區(qū)與CUHK-NS-491毒株同樣具有99.8%的核苷酸與氨基酸同源性，而對(duì)P2亞區(qū)的氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其與CUHK-NS-491株同源性為100%。

2.4GX213的遺傳進(jìn)化樹分析使用MEGA 6.0軟件中鄰接(Neibor-joining)法將GX213株與已報(bào)道的其他人GⅡ.17型諾如病毒和猴GⅡ.17型諾如病毒參考株在RdRp區(qū)核苷酸序列和完整的VP1區(qū)氨基酸序列區(qū)繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖1所示。從RdRp進(jìn)化樹中可以看出，GX213株和CUHK-NS-613病毒株在同一個(gè)亞枝，親緣關(guān)系最近；在VP1區(qū)進(jìn)化樹中，GX213株與CUHK-NS-491株的親緣關(guān)系最近，與首次報(bào)道的獼猴GⅡ.17型諾如病毒KM1509毒株(GenBank ID:KX356908)次之。從兩個(gè)進(jìn)化樹均可以看出，GⅡ.17諾如病毒進(jìn)一步被分為3個(gè)亞群(Ⅰ～ Ⅲ)，而根據(jù)VP1區(qū)序列的不同，Ⅲ亞群又分為Earlier GⅡ.17 2013-2014和Novel GⅡ.17 Kawasaki 2014群。GX213與之前報(bào)道的猴GⅡ.17型諾如病毒均屬于Ⅲ亞群中Novel GⅡ.17 Kawasaki 2014群，與2014年至2015年暴發(fā)的人GⅡ.17型諾如病毒變異株進(jìn)化關(guān)系最相近。

A GX213 RdRp區(qū)核苷酸進(jìn)化樹；B GX213 VP1區(qū)氨基酸進(jìn)化樹注：圖1中，■標(biāo)注的是已報(bào)道的獼猴GⅡ.17型諾如病毒[23]；▲標(biāo)注的是本研究中的諾如病毒GX213圖1 諾如病毒GX213系統(tǒng)進(jìn)化樹A, Phylogenetic tree for RdRp nt of GX213；B, Phylogenetic tree for VP1 aa of GX213Note: In figure 1, black square indicates the monkey GⅡ.17 NoV reported[23]; black triangle indicates norovirus GX213 from this studyFig.1 Phylogenetic tree of norovirus GX213

2.5GX213的VP1區(qū)氨基酸序列分析將GX213株與2014年至2015年在亞洲地區(qū)引起暴發(fā)的人GⅡ.17型諾如病毒和首次在獼猴體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的猴GⅡ.17型諾如病毒參考株衣殼蛋白區(qū)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，與之前預(yù)測(cè)的人GⅡ.17型諾如病毒變異株的抗原位點(diǎn)(Epitope A、D和E)和人組織血型抗原(HBGAs)結(jié)合位點(diǎn)(Site I、Ⅱ和Ⅲ)相比[15]，GX213病毒株在相應(yīng)位點(diǎn)沒(méi)有氨基酸的突變，僅在245的位置(P1.1區(qū))由脯氨酸(P)變成了絲氨酸(S)；與KM1509病毒株的幾個(gè)突變位點(diǎn)相比，GX213也沒(méi)有氨基酸變化。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，與GX213進(jìn)化關(guān)系親近的Novel GⅡ.17 Kawasaki 2014群病毒株比Ⅲ亞群中Earlier GⅡ.17 2013-2014群病毒株VP1區(qū)多2個(gè)氨基酸，比Ⅱ亞群病毒少1個(gè)氨基酸，而與Ⅰ亞群病毒VP1區(qū)氨基酸長(zhǎng)度相同，這與之前文獻(xiàn)中的結(jié)果相符合[27]。

3 討論

1972年，美國(guó)科學(xué)家Kapikian等首次利用免疫電子顯微鏡(Immunoelectron Microscope，IEM)技術(shù)在一位暴發(fā)性急性胃腸炎患者的糞便標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了一種小型病毒，將其命名為諾瓦克病毒[28]。隨著分子診斷技術(shù)水平的發(fā)展和應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)諾如病毒目前已成為引起各個(gè)年齡段人群非細(xì)菌性胃腸炎暴發(fā)的主要病原體。諾如病毒自然宿主包括人及牛、豬、狗、鼠等動(dòng)物。2014年至2015年期間，GⅡ.17型諾如病毒取代GⅡ.4型諾如病毒成為亞洲部分地區(qū)諾如病毒暴發(fā)的主要流行病毒株[8-14]，故有必要對(duì)該型諾如病毒進(jìn)行監(jiān)測(cè)和溯源。譚明等在獼猴體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)有GⅡ.17型諾如病毒的存在，并將其感染實(shí)驗(yàn)猴，證實(shí)了自然條件下獼猴可感染諾如病毒，并推斷獼猴可能作為諾如病毒的儲(chǔ)存宿主[23]，但其致病機(jī)制、宿主特異性及跨物種傳播等特點(diǎn)仍并不清楚。因此，不同種群獼猴體內(nèi)的GⅡ.17型諾如病毒的發(fā)現(xiàn)具有重要的意義。本研究利用HISEQ高通測(cè)序技術(shù)在廣西龍虎山獼猴糞便標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了GⅡ.17型諾如病毒基因序列，對(duì)其中一份陽(yáng)性標(biāo)本中該型病毒的全基因組序列進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序和遺傳進(jìn)化分析，其結(jié)果豐富了野生動(dòng)物中諾如病毒基因庫(kù)。

人諾如病毒VP1區(qū)的P2亞區(qū)為高突變區(qū)，其可以與人組織血型抗原(HBGAs)結(jié)合，這種相互結(jié)合可能增加宿主對(duì)諾如病毒的易感性。研究表明，由于GⅡ.17型諾如病毒變異株的出現(xiàn)，人群可能對(duì)其變得更加易感，進(jìn)而導(dǎo)致了該型變異株的暴發(fā)流行，其原因可能是該型病毒抗原位點(diǎn)、HBGAs結(jié)合位點(diǎn)及其附近氨基酸突變所致。由此可見，VP1區(qū)的氨基酸序列分析對(duì)發(fā)現(xiàn)新型變異株極其重要[15, 27, 29-30]。譚明等對(duì)發(fā)現(xiàn)的猴GⅡ.17型諾如病毒進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)P2高突變區(qū)有3個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)，同時(shí)功能性試驗(yàn)顯示該型諾如病毒與HBGAs弱結(jié)合，推測(cè)猴GⅡ.17型諾如病毒可能來(lái)源于人GⅡ.17型諾如病毒，而此突變可能是因?yàn)楹颎Ⅱ.17型諾如病毒對(duì)新宿主(獼猴)的適應(yīng)而導(dǎo)致的[23]。本研究中諾如病毒GX213與2014年至2015年引起亞洲部分地區(qū)暴發(fā)的人GⅡ.17型諾如病毒的同源性最高，而且GX213毒株的VP1區(qū)與其具有99.8%的氨基酸序列同源性，在預(yù)測(cè)的抗原位點(diǎn)和HBGAs結(jié)合位點(diǎn)及其附近均沒(méi)有氨基酸突變，僅P1.1區(qū)存在一個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變，推測(cè)本研究中猴GⅡ.17型諾如病毒來(lái)源于2014年至2015年引起人群暴發(fā)的人GⅡ.17型諾如病毒變異株，提示GⅡ.17型諾如病毒為人獼猴共患病毒。

本研究的GX213在獼猴中陽(yáng)性檢出率為0.5%(2/400)，顯示出較低的陽(yáng)性率，可能與低病毒載量或者標(biāo)本代表性不足有關(guān)，需要繼續(xù)擴(kuò)大標(biāo)本量或者選擇對(duì)不同地方以及不同猴類標(biāo)本進(jìn)行篩查。但考慮到GX213病毒株VP1區(qū)抗原位點(diǎn)和HBGAs結(jié)合位點(diǎn)沒(méi)有突變，推測(cè)陽(yáng)性率低的一個(gè)重要原因可能是人GⅡ.17型諾如病毒在獼猴體內(nèi)尚不能很好適應(yīng)，亦或僅為一過(guò)性感染。

本研究結(jié)果支持Farkas及譚明等[22-23]的研究結(jié)果，獼猴可能為諾如病毒的自然儲(chǔ)存宿主，但有待于更多的研究積累；本研究結(jié)果也提示若對(duì)獼猴群乃至整個(gè)猴群諾如病毒的流行變異情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，有可能發(fā)現(xiàn)引起暴發(fā)和流行的新型諾如病毒變異株。

[1] Robilotti E, Deresinski S,Pinsky BA. Norovirus[J]. Clin Microbiol Rev, 2015. 28(1):134-164.doi:10.1128/CMR00075-14.

[2] Zheng DP, Ando T, Fankhauser RL, et al. Norovirus classification and proposed strain nomenclature[J]. Virology, 2006. 346(2):312-323.doi:10.1016/j.virol.2005.11.015.

[3] Clarke IN,PR L. Organization and Expression of Calicivirus Genes[J]. J Infect Dis, 2000. 181:S309-316.doi:10.1086/315575.

[4] Jiang X, Wang M, Graham DY, et al. Expression, self-assembly, and antigenicity of the Norwalk virus capsid protein. [J]. J Virol, 1992. 66:6527-6532.

[5] Glass PJ, White LJ, Ball JM, et al. Norwalk virus open reading frame 3 encodes a minor structural protein.[J]. J Virol, 2000. 74:6581-6591.

[6] Vinje J. Advances in laboratory methods for detection and typing of norovirus[J]. J Clin Microbiol, 2015, 53(2):373-381.doi:10.1128/JCM.01535-14.

[7] Bok K, Abente EJ, Realpe-Quintero M, et al. Evolutionary dynamics of GⅡ.4 noroviruses over a 34-year period[J]. J Virol, 2009. 83(22):11890-11901.doi:10.1128/JUI.11864-09.

[8] Gao Z, Liu B, Huo D, et al. Increased norovirus activity was associated with a novel norovirus GⅡ.17 variant in Beijing, China during winter 2014-2015[J]. BMC Infect Dis, 2015,15:574.doi:10.1186/s12879-015-1315-z.

[9] de Graaf M, van Beek J, Vennema H, et al. Emergence of a novel GⅡ.17 norovirus - End of the GⅡ.4 era?[J]. Euro Surveill, 2015,20(26):21178.

[10] Fu J, Ai J, Jin M, et al. Emergence of a new GⅡ.17 norovirus variant in patients with acute gastroenteritis in Jiangsu, China, September 2014 to March 2015[J]. Eur Surveill, 2015,20(24):21157.

[11] Parra GI,Green KY. Genome of Emerging Norovirus GⅡ.17, United States, 2014[J]. Emerg Infect Dis, 2015,21(8):1477-1479.doi:10.3201/edi2108.150652.

[12] Matsushima Y, Ishikawa M, Shimizu T, et al. Genetic analyses of GⅡ.17 norovirus strains in diarrheal disease outbreaks from December 2014 to March 2015 in Japan reveal a novel polymerase sequence and amino acid substitutions in the capsid region[J]. Eur Surveill, 2015,20(26):21173.

[13] Lu J, Sun L, Fang L, et al. Gastroenteritis Outbreaks Caused by Norovirus GⅡ.17, Guangdong Province, China, 2014-2015[J]. Emerg Infect Dis, 2015,21(7):1240-1242.doi:10.3201/eid2017.150226.

[14] Lee C C, Feng Y, Chen S Y, et al. Emerging norovirus GⅡ.17 in Taiwan[J]. Clin Infect Dis, 2015,61(11):1762-1764.doi:10.1093/cid/civ674.

[15] Jin M, Zhou YK, Xie HP, et al. Characterization of the new GⅡ.17 norovirus variant that emerged recently as the predominant strain in China[J]. J Gen Virol, 2016,97(10):2620-2632.doi:10.1099/jgv.0.000582.

[16] Mattison K, Shukla A, Cook A, et al. Human noroviruses in swine and cattle[J]. Emerg Infect Dis, 2007,13(8):1184-1188.doi:10.3201/eid1308.070005.

[17] Martella V, Lorusso E, Decaro N, et al. Detection and molecular characterization of a canine norovirus[J]. Emerg Infect Dis, 2008,14(8):1306-1308.doi:10.3201/eid1408.080062.

[18] Martella V, Campolo M, Lorusso E, et al. Norovirus in captive lion cub (Panthera leo)[J]. Emerg Infect Dis, 2007,13(7):1071-1073.doi:10.3201/eid1307.070268.

[19] Mesquita JR, Barclay L, Nascimento MS, et al. Novel norovirus in dogs with diarrhea[J]. Emerg Infect Dis, 2010,16(6):980-982.doi:10.3201/eid1606.091861.

[20] Silva PF, Alfieri AF, Barry AF, et al. High frequency of porcine norovirus infection in finisher units of Brazilian pig-production systems[J]. Trop Anim Health Prod, 2015,47(1):237-241.doi:10.1007/s11250-014-0685-3.

[21] Karst SM, Wobus CE, Lay M, et al. STAT1-dependent innate immunity to a Norwalk-like virus[J]. Science, 2003,299(5612):1575-1578.doi:10.1126/science.1077905.

[22] Farkas T. Natural Norovirus Infections in Rhesus Macaques[J]. Emerg Infect Dis, 2016,22(7):1272-1274.doi:10.3201/eid2207.151740.

[23] He Z, Liu B, Tao Y, et al. Norovirus GⅡ.17 Natural Infections in Rhesus Monkeys, China[J]. Emerg Infect Dis, 2017,23(2):316-319.doi:10.3201/eid2302.161077.

[24] Vicentini F, Denadai W, Gomes Y M, et al. Molecular characterization of noroviruses and HBGA from infected Quilombola children in Espirito Santo State, Brazil[J]. PLoS One, 2013,8(7):e69348.doi:10.1371/journal.pone.0069348.

[25] Xue L, Cai W, Wu Q, et al. Direct sequencing and analysis of the genomes of newly emerging GⅡ.17 norovirus strains in South China[J]. J Appl Microbiol, 2016,120(4):1130-1135.doi:10.1111/jam.13052.

[26] Katayama K, Shirato-Horikoshi H, Kojima S, et al. Phylogenetic Analysis of the Complete Genome of 18 Norwalk-like Viruses[J]. Virology, 2002,299(2):225-239.doi:10.1006/viro.2002.1568.

[27] Singh BK, Koromyslova A, Hefele L, et al. Structural Evolution of the Emerging 2014-2015 GⅡ.17 Noroviruses[J]. J Virol, 2015,90(5):2710-2715.doi:10.1128/JVI.03119-15.

[28] Kapikian A Z, Wyatt R G, Dolin R, et al. Visualization by Immune Electron Microscopy of a 27-nm Particle Associated with Acute Infectious Nonbacterial Gastroenteritis[J]. J Virol, 1972,10(5):1075-1081.

[29] Chan M C, Lee N, Hung TN, et al. Rapid emergence and predominance of a broadly recognizing and fast-evolving norovirus GⅡ.17 variant in late 2014[J]. Nat Commun, 2015,6:10061.doi:10.1038/ncomms10061.

[30] Zhang X F, Huang Q, Long Y, et al. An outbreak caused by GⅡ.17 norovirus with a wide spectrum of HBGA-associated susceptibility[J]. Sci Rep, 2015,5:17687.doi:10.1038/srep17687.