抗菌鈦合金Ti6Al4V-6Cu生物安全性初步研究

李抒縵， 許雄程， 鐘 泉， 陳 超， 駱 凱

引導(dǎo)骨組織再生術(shù)(guided bone regeneration，GBR)是指以膜材料作為屏障，阻止骨缺損周?chē)浗M織長(zhǎng)入，為骨組織再生提供空間[1-3]。鈦網(wǎng)具有一定的機(jī)械性能，可持續(xù)為嚴(yán)重骨缺損部位提供穩(wěn)定的骨生長(zhǎng)空間，因而廣泛應(yīng)用于臨床[4-7]。研究發(fā)現(xiàn)，由于鈦網(wǎng)等植入物表面吸附蛋白的存在，容易導(dǎo)致口腔致病菌黏附到植入物表面，引發(fā)局部感染，影響骨再生[8-9]。因此，在GBR治療時(shí)使用本身具有抑菌活性的材料具有重要的臨床意義。近年來(lái)，銅離子因其獨(dú)特的抗菌性能，常被用于制備具有抗菌活性的植入物材料[10]。研究表明，利用3D打印技術(shù)中的選擇性激光熔化技術(shù)(selective laser melting,SLM)制備含銅鈦合金材料Ti6Al4V-6Cu具有較強(qiáng)的抗菌性能[11]。本研究擬在其前期研究工作基礎(chǔ)上，通過(guò)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)初步探討Ti6Al4V-6Cu的生物安全性，為將來(lái)利用3D打印制備具有抗菌性能的個(gè)性化鈦網(wǎng)應(yīng)用于GBR提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1. 材料

1.1.1樣品 Ti6Al4V-6Cu由中科院海西研究院先進(jìn)制造技術(shù)集成研究所利用SLM技術(shù)制備，規(guī)格為10 mm×10 mm×3 mm，主要成分:鋁:5.5～6.5 wt.%；釩:3.5～4.5 wt.%；銅:5.5～6.0 wt.%；碳:0～0.08 wt.%；鐵:0～0.25 wt.%；氧:0～0.31 wt.%；氮:0～0.05 wt.%；氫:0～0.12 wt.%；鈦:依據(jù)合金配平。

A：7～8為T(mén)i6Al4V-6Cu；9～10為T(mén)i6Al4V；B：體式顯微鏡下觀察結(jié)果.圖1 Ti6Al4V-6Cu肉眼及鏡下觀察Fig 1 The characterization of Ti6Al4V-6Cu

1.1.2細(xì)胞和動(dòng)物 MC3T3-E1細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院)；健康Wistar大鼠(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科)；健康成年新西蘭大耳兔(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科)。

1.1.3試劑 DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，美國(guó)Hyclone公司)；青霉素、鏈霉素(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)；二甲基亞砜(美國(guó)Invitrogen公司)；MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，美國(guó)Sigma公司]；蘇木精(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；伊紅[中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司]；其他如丙酮、多聚甲醛、乙醇、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、二甲苯、氯仿、異丙醇、甲醛、冰醋酸、NaCl、KCl等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?分析純AR，汕頭市西隴化工有限公司)。

1.1.4儀器 HEAL FORCE超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；生物安全柜(力申科學(xué)儀器有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus公司)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)iMARK公司)；電熱恒溫水槽(DK-8D，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；倒置相差顯微鏡(廣州光學(xué)儀器廠)；倒置相差熒光顯微鏡(帶攝影系統(tǒng))(日本Olympus公司)；電子天平(德國(guó)Sartorius公司公司)；臺(tái)式離心機(jī)(Labofuge 400R，德國(guó)Heraeus)；生物組織包埋機(jī)(宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司)；石蠟組織切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)。

1.2方法

1.2.1材料浸提液的制備 參照文獻(xiàn)[12]方法，Ti6Al4V-6Cu材料經(jīng)丙酮、無(wú)水乙醇、75%乙醇、三級(jí)水逐級(jí)超聲清洗、烘干、高溫高壓消毒。按材料表面積和浸提液介質(zhì)3 cm2/mL的比例加入DMEM低糖培養(yǎng)液，取等體積DMEM低糖培養(yǎng)液作空白對(duì)照，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2)中浸提72 h備用。

1.2.2體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[13]方法，將MC3T3-E1細(xì)胞懸液以每孔5×103個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板(n=6)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2)中培養(yǎng)。將材料浸提液按照100%，50%，25%，1%的濃度與DMEM低糖培養(yǎng)液進(jìn)行配比，并使各濃度均含10%胎牛血清。陽(yáng)性對(duì)照組為苯酚濃度6.4 g/mL的含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液；陰性對(duì)照組為含10%胎牛血清的空白對(duì)照浸提液。24 h后細(xì)胞生長(zhǎng)至近匯合。棄原培養(yǎng)液，各組加入96孔培養(yǎng)板中(200 μL/孔)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后第1,3,5天采用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，即取各組細(xì)胞各6孔，每孔加入200 μL新鮮配制5 g/L的MTT，37 ℃孵育4 h后小心吸棄各孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入200 μL二甲基亞砜，低速震蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔492 nm處光密度值(optical density，OD)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率(relative growth rate，RGR)：

RGR=(ODsample-ODblank)/(ODnegative-ODblank)×100%

其中，ODsample為實(shí)驗(yàn)組；ODnegative為陽(yáng)性對(duì)照組；ODblank為陰性對(duì)照組即空白對(duì)照浸提液組。細(xì)胞增殖百分率與毒性分級(jí)的對(duì)應(yīng)關(guān)系為：增殖率≥100%為0級(jí)，75%～99%為1級(jí)，50%～74%為2級(jí)，25%～49%為3級(jí)，1%～24%為4級(jí)，0%為5級(jí)。0，1級(jí)反應(yīng)為無(wú)毒性反應(yīng)。

1.2.3短期全身毒性實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[14]方法，選取130～150 g的健康Wistar大鼠20只，雌雄各半，隨機(jī)分為2組：實(shí)驗(yàn)組以濃度為100%材料浸提液按5 mL/kg體質(zhì)量的劑量對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃；用相同劑量的空白對(duì)照浸提液對(duì)對(duì)照組大鼠進(jìn)行灌胃。每天灌胃1次，連續(xù)1周。灌胃結(jié)束后，相同環(huán)境下繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)1周，每天觀察大鼠體征并稱(chēng)體質(zhì)量。同時(shí)計(jì)算各動(dòng)物每周體質(zhì)量相對(duì)增長(zhǎng)率[體質(zhì)量相對(duì)增長(zhǎng)率(%)=體質(zhì)量增長(zhǎng)量/原始體質(zhì)量×100%]。2周后，處死大鼠，解剖觀察大鼠心、肝、脾、肺、腎等重要臟器有無(wú)充血、出血、水腫或其他變化，并取肝、腎進(jìn)行常規(guī)組織病理切片觀察。

1.2.4急性溶血實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[16]，選取體質(zhì)量 2.5～3 kg 健康成年新西蘭大耳兔耳緣靜脈采血8 mL，加入肝素鈉抗凝，用10 mL生理鹽水稀釋備用。實(shí)驗(yàn)組按表面積與浸提液體積比為1.25 cm2/10 mL的標(biāo)準(zhǔn)，將待測(cè)樣品與適量生理鹽水混合，每組各3管。陰性對(duì)照組每管加10 mL生理鹽水，共3管；陽(yáng)性對(duì)照組每管加10 mL超純水，共3管。37 ℃水浴30 min。每管加稀釋血0.2 mL，輕輕混勻后置于37 ℃水浴60 min。取各試管內(nèi)液體3 000 r/min 離心 5 min，吸取上清200 μL于酶標(biāo)儀檢測(cè)各組于492 nm 處OD。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按下列公式計(jì)算溶血率：

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，檢測(cè)結(jié)果采用單因素方差分析，以P<0.05為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)

2.1.1MC3T3-E1細(xì)胞生長(zhǎng)情況觀察 MC3T3-E1細(xì)胞體外培養(yǎng)1 d時(shí)，鏡下可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組中細(xì)胞的狀態(tài)已有明顯區(qū)別。不同浸提液濃度實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組中細(xì)胞幾乎全部貼壁，而陽(yáng)性對(duì)照組中細(xì)胞大部分未貼壁。培養(yǎng)5 d時(shí)，鏡下觀察不同浸提液濃度實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組中的細(xì)胞，未發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別。浸提液各組和陰性對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量均明顯增加，細(xì)胞伸展良好，呈橢圓形或梭形，細(xì)胞質(zhì)飽滿，具有良好的折光性，還可見(jiàn)圓形的正在分裂的細(xì)胞；陽(yáng)性對(duì)照組中大部分細(xì)胞未貼壁，細(xì)胞正常形態(tài)消失，可見(jiàn)部分細(xì)胞崩解，核固縮，細(xì)胞縮成小圓形漂浮在培養(yǎng)液中(圖2)。

2.1.2MTT檢測(cè)結(jié)果 細(xì)胞在培養(yǎng)1,3,5 d時(shí)，各不同浸提液濃度實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組比較，差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同浸提液濃度實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組OD值均明顯高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05,圖3)。細(xì)胞毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)定結(jié)果見(jiàn)表2。根據(jù)公式計(jì)算出各組的RGR值，對(duì)照表1評(píng)定出各組的細(xì)胞毒性等級(jí)結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組評(píng)定結(jié)果為合格(表2)。

A：100%材料浸提液組；B：陰性對(duì)照組；C：陽(yáng)性對(duì)照組.圖2 培養(yǎng)5 d各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察( ×40)Fig 2 The morphological observation of each group of cells cultured( ×40)

表1 細(xì)胞毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)定結(jié)果

2.2短期全身毒性試驗(yàn)

2.2.1大鼠生長(zhǎng)狀況觀察 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，2組大鼠飲食均正常，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，行動(dòng)反應(yīng)敏捷，皮毛光亮，體質(zhì)量增量正常，無(wú)暈厥、死亡等中毒反應(yīng)。2組大鼠體質(zhì)量相對(duì)增長(zhǎng)率比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表3)。

表2 體外培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞相對(duì)增值率及細(xì)胞毒性等級(jí)比較

RGR：細(xì)胞相對(duì)增殖率.

圖3 體外培養(yǎng)1,3,5 d各組細(xì)胞MTT檢測(cè)結(jié)果Fig 3 The parameters of MTT test of each group of cells cultured in vitro

Tab3The relative growth rate of weight of two groups of rats

分 組體質(zhì)量相對(duì)增長(zhǎng)率/%第1周第2周實(shí)驗(yàn)組25.24±1.6816.87±2.50對(duì)照組18.04±6.5816.50±3.83

2.2.2大鼠肝、腎組織病理學(xué)觀察 2組大鼠處死后立即取出肝臟和腎臟進(jìn)行肉眼觀察，可見(jiàn)2組大鼠的肝臟、腎臟顏色、大小無(wú)明星差異，無(wú)水腫和出血等異常病變；H-E染色后鏡下觀察肝臟和腎臟的組織切片，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組無(wú)顯著差異，未發(fā)現(xiàn)肝、腎細(xì)胞出現(xiàn)溶解、萎縮、變性、壞死等病理性變化(圖4,5)。

A:實(shí)驗(yàn)組； B:對(duì)照組.圖4 大鼠肝臟組織學(xué)觀察 (H-E染色 ×40)Fig 4 The histological observation of livers of rats(H-E staining ×40)

A:實(shí)驗(yàn)組；B:對(duì)照組.圖5 大鼠腎臟組織學(xué)觀察(H-E染色 ×40)Fig 5 The histological observation of kidneys of rats (H-E staining ×40)

2.3溶血試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組即抗菌鈦合金Ti6Al4V-6Cu的體外溶血率為2.50%，符合YY/T 0127.1-1993規(guī)定的溶血率<5%的標(biāo)準(zhǔn)，證明該材料無(wú)溶血反應(yīng)(表4)。

3 討 論

近年來(lái)，生物醫(yī)用材料的研發(fā)日益成為材料學(xué)研究的熱點(diǎn)。由于生物醫(yī)用材料最終將植入人體內(nèi)，因此對(duì)生物材料的生物安全性檢測(cè)顯得尤為重要。

表4 各組試管吸光度值檢測(cè)結(jié)果

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)是醫(yī)療器械生物安全性評(píng)價(jià)中一項(xiàng)重要的評(píng)價(jià)項(xiàng)目，是國(guó)內(nèi)外醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)系列測(cè)試項(xiàng)目中的首選項(xiàng)目[16-17]。體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法有多種，包括：瓊脂覆蓋法、濾過(guò)法、同位素標(biāo)記法、流式細(xì)胞術(shù)和色度法如四偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT法)等[18]。其中MTT法由于檢測(cè)時(shí)間較短，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)成本低，無(wú)需復(fù)雜、昂貴的檢測(cè)設(shè)備等特點(diǎn)，成為近年來(lái)應(yīng)用較為廣泛的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)方法。

將Ti6Al4V-6Cu樣品置于浸提介質(zhì)(培養(yǎng)液)中一定時(shí)間后，材料中的元素會(huì)釋放到浸提介質(zhì)中，利用該浸提液與受試細(xì)胞相互作用檢測(cè)細(xì)胞毒性。材料浸提液對(duì)細(xì)胞增殖的影響，可反映出金屬材料是否對(duì)細(xì)胞具有毒性[12,19]。本研究鏡下觀察結(jié)果顯示：不同濃度材料浸提液組中MC3T3-E1細(xì)胞在1 d時(shí)就已貼壁生長(zhǎng)，但尚未完全伸展。培養(yǎng)3～5 d時(shí)細(xì)胞完全伸展，胞體呈圓形或橢圓形，細(xì)胞質(zhì)飽滿，有良好的折光性，生長(zhǎng)旺盛，可見(jiàn)圓形的分裂細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量與陰性對(duì)照組試驗(yàn)結(jié)果相同。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：MC3T3-E1細(xì)胞在1%,25%,50%及100%四個(gè)不同濃度的抗菌鈦合金Ti6Al4V-6Cu浸提液中培養(yǎng)1～5 d后，細(xì)胞相對(duì)增殖率與陰性對(duì)照組比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果表明，利用SLM技術(shù)制備的抗菌鈦合金Ti6Al4V-6Cu無(wú)細(xì)胞毒性。

GBR中所使用的屏障膜需要在口腔內(nèi)存留一定的時(shí)期，因此需要對(duì)植入材料進(jìn)行全身毒性實(shí)驗(yàn)以評(píng)價(jià)材料的生物安全性。本研究選擇將制備的材料浸提液通過(guò)灌胃方法對(duì)鈦合金Ti6Al4V-6Cu的短期全身毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，采用Ti6Al4V-6Cu浸提液對(duì)大鼠灌胃，大鼠生長(zhǎng)狀態(tài)良好，體質(zhì)量增量正常，飲食正常，活動(dòng)靈敏反應(yīng)迅速，無(wú)中毒癥狀出現(xiàn)。2組大鼠的肝臟和腎臟組織學(xué)染色后未見(jiàn)明顯的病理性變化。該結(jié)果提示，Ti6Al4V-6Cu無(wú)短期細(xì)胞毒性。

GBR中使用的屏障膜材料在植入后包繞在血液中，并在植入期內(nèi)持續(xù)與血液相互作用。因此，植入材料的組成成分、結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)對(duì)血液的影響至關(guān)重要[20-21]。血液相容性試驗(yàn)是針對(duì)與循環(huán)血液接觸的醫(yī)療器械而進(jìn)行的一系列生物學(xué)評(píng)價(jià)，用于評(píng)價(jià)醫(yī)療器械和血液的相互作用[22]。正常情況下紅細(xì)胞與血漿等滲，出入紅細(xì)胞內(nèi)的水分維持平衡；當(dāng)血漿滲透壓低于紅細(xì)胞內(nèi)滲透壓時(shí)，過(guò)量的水分進(jìn)入紅細(xì)胞，造成紅細(xì)胞膨脹甚至破裂，血紅蛋白逸出進(jìn)入血漿即表現(xiàn)為溶血。造成溶血的原因有機(jī)械力如壓力、流變、生物毒素以及各種生化方面的因素[23]。溶血可導(dǎo)致重要臟器血栓形成，進(jìn)而對(duì)這些臟器造成繼發(fā)損害。作為血液相容性試驗(yàn)中的一個(gè)重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，凡是與循環(huán)血液接觸的醫(yī)療器械都有必要進(jìn)行溶血實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)采用體外間接法檢測(cè)抗菌鈦合金Ti6Al4V-6Cu材料浸提液的溶血作用。結(jié)果顯示，新型抗菌鈦合金Ti6Al4V-6Cu溶血率為2.50%，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(溶血率<5%)，提示Ti6Al4V-6Cu具有較佳的血液相容性。

本研究通過(guò)體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)、短期全身毒性實(shí)驗(yàn)和溶血實(shí)驗(yàn)對(duì)抗菌鈦合金Ti6Al4V-6Cu的生物安全性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，結(jié)果初步證實(shí)SLM技術(shù)制備的抗菌鈦合金Ti6Al4V-6Cu具有良好的生物安全性，后續(xù)還將對(duì)該材料的生物相容性做進(jìn)一步的研究，以利于材料最終應(yīng)用于臨床。

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