抗EGFR/CD3雙特異性抗體的制備與功能的初步研究

車耀健， 趙寧寧， 胡 妍， 楊豐云， 溫振國

近年來，以PD-1/PD-L1抗體為代表的免疫治療為攻克癌癥帶來了革命性突破，2個或多個腫瘤免疫靶點藥物聯合使用是免疫治療的發(fā)展方向。雙特異性抗體(bispecific antibody, BsAb)可同時識別并結合2個不同靶點，是腫瘤免疫治療領域中的一個研發(fā)熱點[1]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)廣泛分布于各組織，與腫瘤細胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉移及細胞凋亡的抑制有關，其過表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、放療或化療敏感度以及預后密切相關[2]，抗EGFR抗體藥物西妥昔單抗(Cetuximab)和尼妥珠單抗(Nimotuzumab)均已上市，用于治療EGFR+腫瘤。而CD3主要表達于T細胞表面，T細胞與抗CD3抗體(如OKT3[3])結合后能夠活化T細胞。EGFR與CD3均為腫瘤免疫重要的分子。本研究嘗試通過BsAb的方式將這2種分子的抗體進行關聯，從而提高靶向殺傷效果。目前構建BsAb的方法有很多種，如化學偶聯、tandem diabody(tandAB)、dual affinityre-targeting(DART)、BiTE、Dock and Lock(DNL)、CrossMAb、knobs-into-holes等[1,4-10]。其中在knobs-into-holes模式中，knob鏈形成的結構能夠特異地插入到hole形成的結構中，從而能夠獲得異源二聚體的BsAb，同時CD3單鏈抗體無完整輕鏈，不會與EGFR抗體的重鏈錯配而失去活性。因此本研究通過knobs-into-holes的方式進行研究，將2個進入臨床Ⅱ期研究后中止開發(fā)的anti-EGFR抗體(Matuzumab)及anti-CD3單鏈抗體(HuM291)通過knobs-into-holes的方式組合起來制備BsAb，并通過體外實驗初步驗證anti-EGFR/CD3抗體的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞和試劑 質粒載體pXC17.4和pXC18.4(瑞士Lonza公司)，基因序列由上海生工生物工程有限公司合成。EGFR+的CHO細胞系、Jurkat細胞系(T淋巴瘤細胞系)、U87 Ⅷ(腦膠質瘤細胞系)、HCT-116細胞系(結腸癌細胞系)、Expi 293F懸浮細胞系均由本實驗室保存。ExpiFectamine 293 Transfection kit(批號：1870295，美國Thermo Scientific公司)，EcoR Ⅰ限制性內切酶(批號：AG50083A，日本Takara公司)，Hind Ⅲ限制性內切酶(批號：AG50147A，日本Takara公司)，T4 DNA連接酶(批號：1181608，美國NEB生物技術有限公司)。質粒大量提取試劑盒(批號：1502/002，德國Macherey-Nagel公司)，10×PBS(批號：13515002)和DMEM(批號：1676986)(美國Corning公司)，HiTrap mabselect SuRe 1 mL層析柱(批號：10233639)及superdex 200 increase 10/300分子篩層析柱(批號：10240183)(美國GE Health Care公司)，Acqutiy UPLC Protein BEH SEC Column 1.7 μm分子篩分析柱(批號：023370531，美國Waters公司)，PE標記的CD3抗體(批號：4285682)及APC標記的CD69抗體(批號：B200047)(美國BD公司)。

1.1.2儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱(型號：311，美國Thermo Scientific公司)，AKTA蛋白純化系統(tǒng)(型號：AKTA avant 25，美國GE Health Care公司)，凝膠成像系統(tǒng)(型號：ChemiDocTMXDR+，美國Bio-Rad公司)，超高效液相色譜儀(UPLC)(型號：Acquity H-class，美國Waters公司)，流式細胞儀(型號：FACSVerse，美國BD公司)，實時無標記細胞功能分析儀(型號：xCELLigence RTCA DP，美國艾森生物公司)。

1.2方法

1.2.1BsAb EGFR/CD3表達質粒構建 首先在生工生物工程有限公司合成表達anti-EGFR重鏈和輕鏈的基因序列，構建成正常的anti-EGFR抗體(圖1A)，同時合成與FC融合的anti-CD3的單鏈抗體anti-CD3-scFV的基因序列，構建成anti-CD3-scFV抗體(圖1B)，其中scFV是將CD3抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)用linker(4個G4S)連接起來?；蚝铣珊髮⒅劓溁蜻B入到pXC17.4載體中，輕鏈基因連入pXC18.4載體中。而構建BsAb質粒需要knob鏈和hole鏈2條鏈參與，其中knob鏈是將anti-EGFR重鏈的第354位氨基酸S突變成C(S354C)，以及第366位氨基酸T突變成W(T366W)，獲得攜帶anti-EGFR-HC-knob基因的質粒；而hole鏈則是將anti-CD3-scFV進行如下氨基酸突變：Y349C，T366S，L368A，Y407V[11-12]，從而獲得攜帶anti-CD3-scFV-HC-hole基因的質粒，二者同時與攜帶anti-EGFR-LC基因的質粒共轉染，最終構成knobs-into-holes的抗體模式(圖1C)。

1.2.2ExpiFectamine 293法轉染Expi 293F懸浮細胞 將攜帶重鏈和輕鏈基因的重組質粒按等量的比例轉染至Expi 293F懸浮細胞中，具體步驟如下：首先用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋45 μg DNA至2.25 mL、稀釋ExpiFectamine 293 Reagent至2.25 mL，室溫靜置5 min，二者混合后靜置20 min。將DNA-Reagent復合物加入密度為7.5×107mL-1的細胞中(共38.25 mL)，16～18 h后加入225 μL Enhancer 1及2.25 mL Enhancer 2，約72 h后收集細胞上清。

1.2.3抗體純化及分析 將細胞上清過濾后采用Protein A親和層析的方法進行初純：HiTrap mabselect SuRe 1 mL柱子用PBS平衡5個柱體積，20 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH=3.5)洗脫，收集第1個抗體峰，收集到的樣品再用十分之一體積的1 mol/L的Tris-Hcl緩沖液(pH=9.0)進行中和。超濾管濃縮，再用superdex 200 increase 10/300分子篩進行精細純化，流動相為PBS，流速為0.75 mL/min，收集主峰位置的樣品，得到目的抗體。將3種抗體濃度均定量至1 mg/mL左右，各取15 μL樣品分別加入非還原性loading buffer和還原性loading buffer(含巰基乙醇)，95 ℃加熱5 min，進行SDS-PAGE凝膠電泳分析。采用UPLC系統(tǒng)進行分析，分析柱為Acqutiy UPLC Protein BEH SEC Column，流動相為PBS，流速為0.4 mL/min。

A：anti-EGFR；B：anti-CD3-scFV；C：anti-EGFR/CD3.圖1 不同抗體的結構示意圖Fig 1 The schematic diagram of the different antibodies

1.2.4BsAb體外結合能力評價 將3種抗體分別與Jurkat細胞系(T淋巴瘤細胞系，CD3+)，U87Ⅷ(腦膠質瘤細胞系，EGFR+)，HCT-116細胞系(結腸癌細胞系，EGFR+)進行體外結合實驗。收集細胞至流式管中，2 000 r/min離心3 min，棄上清；向各流式管中加入2 mL含1%胎牛血清的PBS溶液重懸細胞，以2 000 r/min的速度離心3 min，棄上清；輕輕將管底細胞懸起，向各管加入需要檢查的抗體，4 ℃孵育20 min后，加入2 mL含1%胎牛血清的PBS，2 000 r/min離心3 min，棄上清；再加入標記PE的二抗，4 ℃孵育20 min后，加入2 mL含1%胎牛血清的PBS，2 000 r/min離心3 min，棄上清；向各管加入300 μL含1%胎牛血清的PBS，上流式細胞儀檢測。

1.2.5T細胞活化 分離3個正常人血液中的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，每份進行3個重復實驗，分盤后(每孔1 mL)分別加入20 μm的anti-EGFR、20 μm的anti-CD3-scFV、40 μm的anti-EGFR/CD3抗體，于37 ℃的CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，同時用PE標記的CD3抗體和APC標記的CD69抗體染色進行流式細胞檢測。

1.2.6體外殺傷實驗 采用xCELLigence RTCA DP實時無標記細胞功能分析儀進行檢測，實時監(jiān)測細胞狀態(tài)，通過細胞指數(cell index)讀值反應活細胞的數量，數值越高，活細胞數量越多。已有用此法進行抗體依賴的細胞毒活性等細胞活性方面的檢測[13]。具體步驟如下：huPBMC分別分離自3個健康人，加入Human T-Activator CD3/CD28 Dynabeads(磁珠∶細胞=1∶1)刺激活化T細胞，然后接種40 000個HCT-116細胞至儀器專用的細胞培養(yǎng)盤上(每份T細胞進行3孔重復)，在第25 小時加入磁珠活化后的T細胞(其中效應細胞∶腫瘤細胞=5∶1)以及抗體(每孔抗體用量分別是：40 μm anti-EGFR/CD3，20 μm anti-EGFR，20 μm anti-CD3-scFV，20 μm anti-EGFR+20 μm anti-CD3-scFV)，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，每15 min收集1次信號。按以下公式計算細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic lymphocyte, CTL)的殺傷率：

CTL的殺傷率(%)=(對照組讀值-實驗組讀值)/對照組讀值×100%

1.3統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism 5進行統(tǒng)計學分析，采用單因素ANOVA進行顯著性檢驗，2組間均值比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差別具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1純化與分析結果 經Protein A純化后，只收集到1個單一的洗脫峰，中和后濃縮進行分子篩純化，在上樣后12 min左右收集主峰，得到了目的抗體。SDS-PAGE結果顯示，BsAb的條帶位置(泳道1)居于正?？贵w(泳道2)和單鏈抗體(泳道3)中間(圖2A)，說明BsAb構成的是異源二聚體；anti-EGFR/CD3二聚體比anti-EGFR正?？贵w少1個輕鏈，因此還原性SDS-PAGE中輕鏈位置(25 kD左右)泳道2比泳道1條帶更粗(圖2B)，濃度更高，同時anti-CD3-scFV輕鏈位置沒有條帶，進一步說明獲得的抗體是異源二聚體。

UPLC系統(tǒng)分子篩分析鑒定結果如圖3，anti-CD3-scFV，anti-EGFR及anti-EGFR/CD3的保留時間分別為3.169，2.906及3.013 min，其中anti-EGFR/CD3的保留時間剛好居于2個抗體之間，且純度都>99%，從另一方面證明本實驗獲得高純度的異源BsAb。

A：非還原性；B：還原性. 1：anti-EGFR/CD3；2：anti-EGFR；3：anti-CD3-scFV；M：蛋白marker.圖2 3個抗體的SDS-PAGE考馬斯亮藍染色結果Fig 2 The results of the SDS-PAGE of the three antibodies

圖3 3個抗體的UPLC分子篩分析Fig 3 The SEC results of UPLC

2.2體外結合能力評價 anti-EGFR/CD3能夠與EGFR+的U87 Ⅷ細胞系和HCT-116細胞系結合，結合能力與anti-EGFR單克隆抗體相當(圖4A)。anti-EGFR/CD3也能夠與CD3陽性的Jurkat細胞結合，但相對于單獨的anti-CD3-scFV結合能力更弱一些(圖4B)。結果表明BsAb能同時識別EGFR和CD3兩種抗原。

2.3T細胞活化實驗 CD69在細胞活化的過程中起了非常重要的作用，是T細胞活化的一個重要標志物，因此可以通過觀察T細胞表面是否表達CD69來判斷T細胞是否活化。將分離得到的PBMC分別用抗體刺激，24 h后進行流式細胞檢測，結果如圖5所示。與對照比較，加入anti-EGFR/CD3后CD69+的T細胞比例(P<0.000 1)以及anti-CD3-scFV刺激后的比例(P<0.000 1)均明顯高于不加抗體對照，表明anti-CD3-scFV和anti-EGFR/CD3都能較好地刺激T細胞活化。

A：EGFR+； B：CD3+細胞.圖4 體外結合能力比較Fig 4 Comparison of the binding assay in vitro

2.4T細胞體外殺傷能力評價 實時無標記細胞功能分析儀能實時監(jiān)控活細胞的數量，在不加T細胞和抗體(Mock)或只加抗體不加T細胞的情況下，腫瘤細胞生長曲線呈上升趨勢，活細胞數量不斷增加，直到平臺期才停止(圖6A)；而在第25小時加入T細胞后，無論有沒有加抗體，曲線均往下降，出現了不同程度的細胞死亡，其中BsAb anti-EGFR/CD3下降最為明顯。以第25小時作為零點，分別取加入抗體后12和24 h的數據進行統(tǒng)計學分析(圖6B)，anti-EGFR/CD3在12 h后的殺傷率均明顯高于不加抗體的T細胞對照組和其他抗體(均為P<0.000 1)。同樣，觀察殺傷24 h后的情況，依然是anti-EGFR/CD3殺傷效果最好。

1：anti-EGFR； 2：anti-CD3-scFV； 3：anti-EGFR/CD3； 4：T cell only.圖5 抗體對T細胞的活化作用結果Fig 5 Activating effect on T cells of the antibodies

A：無標記細胞功能分析儀細胞實時監(jiān)測圖； B：T細胞殺傷率比較. 1：T cell only；2：anti-EGFR/CD3； 3：anti-CD3-scFV+anti-EGFR； 4：anti-CD3-scFV；5：anti-EGFR. ☆☆☆:P<0.000 1.圖6 對腫瘤細胞體外殺傷效果Fig 6 Killing effect on tumor cells in vitro

3 討 論

當今，免疫治療技術越發(fā)成熟，已經廣泛應用于臨床，漸漸成為繼傳統(tǒng)化療、放療之后內科治療腫瘤的又一有力武器。而針對EGFR介導的信號轉導途徑在腫瘤細胞的增殖、損傷修復、侵襲及新生血管形成等方面起重要作用，許多實體腫瘤中均存在EGFR的高表達或異常表達[14]。因此，以EGFR作為治療靶點的方案也越來越多，其中以ABX-EGF、IMC-C225(Cetuximab)、MAB528、MAB225，Matuzumab為代表的單抗類藥物為腫瘤的治療提供了新的希望[15-17]。但是，單純的抗體治療可能并不能很好地發(fā)揮治療作用，還需要免疫細胞的配合。腫瘤免疫微環(huán)境的異質性會影響腫瘤的治療反應，免疫微環(huán)境作為腫瘤微環(huán)境有機整體的重要組成部分，其所起的作用越來越受到重視[18]。腫瘤浸潤T細胞是免疫微環(huán)境的一個重要指標，腫瘤體內殺傷效果不佳，其中一個重要的原因可能就是腫瘤組織內的效應T細胞數量太低或活性太差。因此，治療過程中需提供適合免疫細胞的腫瘤微環(huán)境。本研究利用已完成臨床Ⅰ期安全性研究但止步于臨床Ⅱ期有效性研究的2個失敗的抗體藥物Matuzumab和HuM291，通過knobs-into-holes技術獲得anti-EGFR/CD3雙特異性抗體。在殺傷腫瘤的過程中，加入雙特異性抗體的殺傷效果明顯高于其他對照組，而單獨的抗體或單純將2種抗體混合到一起，殺傷效果不如BsAb，推測可能是因為BsAb能夠同時結合T細胞和腫瘤細胞，起到橋連的作用，能夠特異性地將效應細胞與腫瘤細胞的距離拉近，在抗體靶向腫瘤的過程中，能夠結合效應細胞，將其帶到腫瘤細胞周圍并累積，從而起到募集效應細胞的作用。同時CD3抗體能進一步激活效應細胞，提供一個很好的免疫微環(huán)境(腫瘤浸潤T細胞等)。另外，正常的免疫細胞需要抗原呈遞，并形成MHC-抗原復合物結合T細胞受體才能發(fā)揮殺傷作用，BsAb能使T細胞直接跳過這一過程，直接與腫瘤細胞接觸，殺傷腫瘤細胞，從而達到預期的目的。

本研究采用的是knobs-into-holes的模型，獲得的抗體比一般的化學偶聯方式更穩(wěn)定，成本更低。雖然在體外結合能力和殺傷能力方面都有一定的效果，但由于缺乏動物模型，未能評價體內治療效果。因此，筆者接下來的工作可以嘗試構建合適的動物模型，將此BsAb用于小鼠體內實驗，觀察治療效果。雖然抗EGFR抗體用于腫瘤治療已取得了一些可喜的進展，但其效果并不令人滿意，且具有各種各樣的不良反應。因此，本研究所用的EGFR抗體存在一定局限性。另外，BsAb與CD3的結合能力比anti-CD3-scFV弱，可能是由于異源BsAb中的EGFR抗體部分存在一定的空間位阻，而anti-CD3-scFV是同源二聚體，位阻更小，具有更好的結合能力，從而導致BsAb結合CD3的能力比anti-CD3-scFV更弱。綜合來看，anti-EGFR/CD3的結合能力和殺傷效果還有待進一步提高，而篩選效果更好的EGFR和CD3抗體以及嘗試不同的腫瘤細胞靶點是接下來研究的方向之一，使獲得的雙特異性抗體既可很好地將效應細胞募集到腫瘤組織，又可更好地激活效應細胞，提高效應細胞的殺傷效果，從而大大改善治療效果，為腫瘤的免疫治療奠定一定的基礎。

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