環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)中的應(yīng)用

李 森，王源升，余紅偉，李 瑜

(1．海軍工程大學(xué)艦船工程系，湖北 武漢 430033；2．海軍工程大學(xué)理學(xué)院，湖北 武漢 430033)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)中的應(yīng)用

李 森1，王源升2*，余紅偉2，李 瑜2

(1．海軍工程大學(xué)艦船工程系，湖北 武漢 430033；2．海軍工程大學(xué)理學(xué)院，湖北 武漢 430033)

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)是一種最常見的基因序列差異，在人類基因組序列中大約每一千個(gè)堿基就會(huì)出現(xiàn)一次。SNP基因分型檢測(cè)方法在遺傳疾病、疾病易感性和藥理學(xué)指示物的相關(guān)基因識(shí)別的研究中有著重要的應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)是一種新型的核酸放大擴(kuò)增技術(shù)，LAMP-SNP技術(shù)就是在同一反應(yīng)體系中通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)不同SNP基因的特異性引物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)SNP基因分型的檢測(cè)。結(jié)合LAMP技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，對(duì)其在SNP檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；快速檢測(cè)；單核苷酸多態(tài)性

1 單核苷酸多態(tài)性的定義及其研究意義

人類基因組DNA序列的差異導(dǎo)致了個(gè)體之間的性狀差異，包括發(fā)生疾病可能性的差異[1-2]。單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms，SNP)是一種最常見的基因序列差異，在人類基因組序列中大約每一千個(gè)堿基就會(huì)出現(xiàn)一次[3]。SNP分型檢測(cè)方法在遺傳疾病和藥物代謝相關(guān)基因識(shí)別的大規(guī)模研究和POCT(point-of-caretesting)中有重要應(yīng)用[4]。

根據(jù)SNP發(fā)生基因位點(diǎn)的不同，在表型水平上也會(huì)產(chǎn)生不同的后果，SNP的這些特征常被用于常規(guī)分析診斷。在編碼區(qū)域發(fā)生的SNP會(huì)引起控制蛋白結(jié)構(gòu)和功能正常表達(dá)的基因的改變，這也是大部分隱性和顯性遺傳病發(fā)生的一個(gè)最重要的誘因[5]。然而大多數(shù)的SNP發(fā)生在非編碼區(qū)基因組，對(duì)個(gè)體的基因表型并沒(méi)有直接的影響。

SNP的另一個(gè)重要作用是改變涉及藥物代謝的蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，因此，SNP不僅可以作為致病基因定位的標(biāo)記物，還可以用于藥物基因組學(xué)的研究[6-8]。對(duì)于一些臨床研究中的藥物，相同劑量的藥物針對(duì)不同基因型的患者常常會(huì)產(chǎn)生藥物反應(yīng)的個(gè)體差異。如果一個(gè)人的基因信息在用藥之前就進(jìn)行了識(shí)別診斷，接下來(lái)的治療就可以進(jìn)行安全有效的個(gè)性化用藥，從而降低毒副作用發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[7]。此外，對(duì)于一些常見疾病，個(gè)體之間存在明顯差異，而位于基因調(diào)控區(qū)域的SNP可能會(huì)影響到人體常見疾病的易感性[9-10]。

SNP在基因缺陷疾病診斷和大量SNP識(shí)別方面的進(jìn)展可以推動(dòng)大規(guī)模SNP檢測(cè)新技術(shù)的建立。通過(guò)了解基因組級(jí)別的遺傳變異和生物功能之間的關(guān)系，可以為人類及其它物種的生物學(xué)、進(jìn)化理論和病理生理學(xué)提供新的認(rèn)識(shí)[11]。因此，發(fā)展一種高通量、精準(zhǔn)廉價(jià)的SNP基因分型檢測(cè)新方法對(duì)于充分了解基因序列差異的機(jī)理是十分迫切的。

2 單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法

由于SNP數(shù)量龐大，常常來(lái)自于一個(gè)堿基位點(diǎn)的突變，在6×109個(gè)人體二倍體染色體基因組中去識(shí)別一個(gè)錯(cuò)配堿基是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)，因此需要發(fā)展一種高特異性、高精度的高通量自動(dòng)化檢測(cè)手段。傳統(tǒng)的SNP檢測(cè)方法通常借助于三代測(cè)序技術(shù)、凝膠電泳或MALDI-TOF質(zhì)譜(matrix-associated laser desorption time-of-flight mass spectrometry)，分析周期長(zhǎng)、耗費(fèi)較高、操作程序復(fù)雜[12-17]。

現(xiàn)行的SNP檢測(cè)方法分為以雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的分型方法和以酶應(yīng)用為基礎(chǔ)的分型方法。PCR技術(shù)的出現(xiàn)使得對(duì)SNP基因分型進(jìn)行大規(guī)模有效的分析成為可能[18-19]。之后，PCR技術(shù)被發(fā)展用于SNP的等位基因特異性放大和基因分型檢測(cè)。早期SNP基因分型的PCR產(chǎn)物分析多是基于斑點(diǎn)印跡法的等位基因特異性探針雜交(allele specific oligonucleotide hybridization，ASO)技術(shù)[15，20]。利用雜交探針或者PCR引物的ASO方法是PCR基因分型檢測(cè)的基礎(chǔ)，在本質(zhì)上也是相同的，因?yàn)槎疾恍枰獑为?dú)的分離步驟，而且可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[21]。ASO方法雖然可以實(shí)現(xiàn)SNP的檢測(cè)，但是ASO探針和含有SNP位點(diǎn)的目標(biāo)序列的雜交不僅需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，還需要考慮反應(yīng)所產(chǎn)生的二級(jí)結(jié)構(gòu)等影響因素。由于這些實(shí)驗(yàn)參數(shù)必須分別適應(yīng)不同的SNP分型實(shí)驗(yàn)，因此對(duì)于所有種類的SNP基因分型不可能建立一整套全部適用的反應(yīng)條件，這使得基于ASO的多重目標(biāo)SNP檢測(cè)幾乎不可能實(shí)現(xiàn)。因此，對(duì)于ASO來(lái)說(shuō)，反應(yīng)條件或者探針的雜交程度都會(huì)影響到同一SNP等位基因的區(qū)分。

為了提高SNP檢測(cè)的效率和精度，DNA連接酶和聚合酶被引入了基因分型的固相分析檢測(cè)[22-25]。與ASO方法相比，酶輔助的方法可以與多種分析檢測(cè)策略相結(jié)合，提供更加精準(zhǔn)的SNP基因檢測(cè)平臺(tái)。常見的酶輔助方法包括連接酶反應(yīng)、單核苷酸引物延伸、酶切反應(yīng)等。

在進(jìn)行SNP基因分型實(shí)驗(yàn)之前，二倍體基因組的SNP基因分型方法都需要對(duì)基因組區(qū)域進(jìn)行PCR放大擴(kuò)增。PCR可以為區(qū)分大量復(fù)雜的純合子和雜合子基因分型提供所需的靈敏度和特異性。當(dāng)需要對(duì)多個(gè)SNP進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，多重PCR體系需對(duì)超過(guò)10個(gè)目標(biāo)DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，由于大量非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的生成，SNP檢測(cè)往往難以進(jìn)行。因此，進(jìn)行多重PCR反應(yīng)的引物設(shè)計(jì)是制約當(dāng)前SNP基因分型高通量檢測(cè)的重要因素[26]。DNA芯片就是將大量的探針固定在玻璃或硅體材料表面的裝置，DNA芯片技術(shù)已經(jīng)成為多重SNP基因分型檢測(cè)的常用方法。但是當(dāng)前的DNA芯片技術(shù)往往需要大量復(fù)雜的熒光標(biāo)記，因此只是用于實(shí)驗(yàn)室的研究分析階段。

近年迅速發(fā)展起來(lái)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)根據(jù)目標(biāo)基因序列的特異性識(shí)別區(qū)域設(shè)計(jì)了2～3對(duì)引物，只有當(dāng)引物與靶基因序列完全一一互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，雜交雙鏈在核酸聚合酶的作用下進(jìn)行堿基序列的延伸與配對(duì)，擴(kuò)增循環(huán)才得以繼續(xù)進(jìn)行，這種反應(yīng)的高特異性足以識(shí)別單個(gè)堿基位點(diǎn)的突變。由于LAMP技術(shù)在自動(dòng)化操作和檢測(cè)速度等方面要優(yōu)于傳統(tǒng)方法，使用LAMP技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)快速簡(jiǎn)便、廉價(jià)高效的SNP檢測(cè)。

3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的原理

LAMP是一種新型的核酸信號(hào)放大擴(kuò)增技術(shù)，是由日本榮研公司研究人員發(fā)明的[27]。和傳統(tǒng)的PCR方法相比，LAMP引物可以識(shí)別靶基因序列上的6個(gè)特異性區(qū)域。內(nèi)引物FIP由F1c和F2區(qū)域構(gòu)成，F(xiàn)2區(qū)域和靶基因序列的F2c區(qū)域完美互補(bǔ)；BIP由B1c和B2組成，B2區(qū)域與靶基因的B2c區(qū)域完美互補(bǔ)。內(nèi)引物與靶基因的響應(yīng)區(qū)域雜交結(jié)合后，在Bst聚合酶的作用下開始鏈的合成，由此觸發(fā)LAMP反應(yīng)。接下來(lái)，外引物F3/B3分別與F3c和B3c結(jié)合，各自合成出一條單鏈進(jìn)而置換出內(nèi)引物合成的兩條單鏈。由于這兩條鏈的5′端各自有互補(bǔ)的區(qū)域，因此各自會(huì)形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)。隨后在另一條外引物的作用下，另一端也形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，由此形成了LAMP反應(yīng)的初始啞鈴結(jié)構(gòu)[28]。

通過(guò)利用自身結(jié)構(gòu)作為模板，以3′端的F1區(qū)域作為起點(diǎn)，內(nèi)引物的F1c區(qū)域與啞鈴結(jié)構(gòu)的F1區(qū)域結(jié)合，F(xiàn)2區(qū)域和F2c區(qū)域結(jié)合，由此觸發(fā)循環(huán)鏈置換放大擴(kuò)增反應(yīng)；同樣BIP與啞鈴結(jié)構(gòu)的另一端莖環(huán)結(jié)構(gòu)的B2c區(qū)域互補(bǔ)，啟動(dòng)下一輪放大擴(kuò)增。由此周而復(fù)始，至LAMP反應(yīng)結(jié)束，擴(kuò)增體系里產(chǎn)生了大量由相同特異性序列的反向重復(fù)片段組成的DNA片段混合物。 除了4條內(nèi)引物外，環(huán)引物的加入可以加快反應(yīng)的擴(kuò)增速率，但并不是LAMP反應(yīng)所必需的[29]。LAMP的擴(kuò)增效率使得擴(kuò)增產(chǎn)物在15～60 min就可以達(dá)到初始模板量的1×109～1×1010倍[30]。

LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物是大小長(zhǎng)短不一的重復(fù)序列，因此利用瓊脂糖凝膠電泳分析成像可以觀察到大小不同的階梯條帶。而產(chǎn)物的終點(diǎn)檢測(cè)還可以通過(guò)加入Sybr Green Ⅰ、HNB等核酸染料來(lái)進(jìn)行觀察。由于目標(biāo)序列的擴(kuò)增過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的焦磷酸根，與LAMP反應(yīng)體系中的鎂離子結(jié)合，形成了擴(kuò)增反應(yīng)的副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀[31]，通過(guò)觀察是否有白色沉淀產(chǎn)生就可以判斷擴(kuò)增反應(yīng)發(fā)生與否。榮研公司基于此原理發(fā)明了濁度儀，從而實(shí)現(xiàn)了LAMP反應(yīng)的實(shí)時(shí)檢測(cè)。除此之外，基于生物發(fā)光技術(shù)、雙鏈嵌入式熒光染料和熒光修飾探針等技術(shù)都可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)LAMP檢測(cè)[32]。

4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在SNP基因分型檢測(cè)中的應(yīng)用

LAMP技術(shù)對(duì)于SNP基因分型的檢測(cè)常常借助于特異性識(shí)別引物。在進(jìn)行LAMP的引物設(shè)計(jì)時(shí)，就需要在上下游內(nèi)引物的序列中插入SNP識(shí)別位點(diǎn)，待檢測(cè)目標(biāo)序列是野生型時(shí)，引物與目標(biāo)DNA的靶序列互補(bǔ)結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下開始了鏈的合成，由此觸發(fā)了靶基因序列的循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)；相反，當(dāng)靶基因是突變型 (MUT)等位基因時(shí)，由于引物與靶基因序列不能完全互補(bǔ)，循環(huán)擴(kuò)增的起始啞鈴結(jié)構(gòu)不能形成，LAMP循環(huán)擴(kuò)增無(wú)法進(jìn)行下去。擴(kuò)增反應(yīng)的高特異性使得只需將基因組DNA、DNA聚合酶和熒光染料等加入同一擴(kuò)增反應(yīng)體系，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)或者可視化檢測(cè)，就能實(shí)現(xiàn)SNP基因分型檢測(cè)。

4.1 LAMP-SNP法在植物育種中的應(yīng)用

分子標(biāo)記技術(shù)在植物育種中的一個(gè)長(zhǎng)期應(yīng)用就是直接在DNA水平選出具有最優(yōu)性狀的個(gè)體。分子標(biāo)記輔助選種技術(shù)的高效率可以減少選育所需植物的數(shù)量規(guī)模，因此分子標(biāo)記輔助育種顯示出了優(yōu)于傳統(tǒng)表型篩選的明顯優(yōu)勢(shì)。

甜瓜是一種相對(duì)容易腐爛的肉質(zhì)果實(shí)，在甜瓜的選種中，保質(zhì)期是重要的參考因素，它與運(yùn)輸能力、貯藏特性和果實(shí)品質(zhì)密切相關(guān)。Touyama等[33]從與甜瓜保質(zhì)期相關(guān)的SNP基因分型中發(fā)展了一種酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(cleaved amplified polymorphic sequences，CAPS)標(biāo)記物C2。無(wú)論是長(zhǎng)保質(zhì)期系品種(O-3)和短保質(zhì)期系品種(Nat-2)，C2引物都產(chǎn)生了一段單一的838 bp的片段(命名為C2片段)。長(zhǎng)保質(zhì)期系O-3在255堿基和384堿基處有一個(gè)AluⅠ識(shí)別位點(diǎn)，包含了C2片段，在酶切后產(chǎn)生了長(zhǎng)度為255 bp、129 bp和454 bp的片段。短保質(zhì)期系Nat-2在255堿基、299堿基和384堿基處各有一個(gè)AluⅠ酶切識(shí)別位點(diǎn)，在酶切后產(chǎn)生了長(zhǎng)度為255 bp、129 bp和454 bp的片段。

雖然CAPS標(biāo)記方法的檢測(cè)結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的，但是在PCR擴(kuò)增之后CAPS需要再進(jìn)行大量的額外工作，有時(shí)還需要較為困難的處理步驟[34]。另外，CAPS并不便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，不僅需要進(jìn)行限制性內(nèi)切酶處理，而且標(biāo)記物的檢測(cè)還需要進(jìn)行凝膠電泳分析。而LAMP反應(yīng)對(duì)于DNA模板的擴(kuò)增是一種非常高效和特異性的方法。與傳統(tǒng)的等位特異性PCR檢測(cè)相比，LAMP可以在恒溫條件下完成對(duì)核酸的擴(kuò)增，而且這種方法使用了4條引物用于識(shí)別模板DNA上的6個(gè)區(qū)域。此外，擴(kuò)增產(chǎn)生的焦磷酸鎂白色沉淀還可以實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)。

Fukuta等[35]利用LAMP技術(shù)對(duì)影響甜瓜保質(zhì)期的SNP基因進(jìn)行了篩選。通過(guò)插入一段CAPS標(biāo)記物C2來(lái)對(duì)甜瓜的保質(zhì)期進(jìn)行研究。來(lái)自長(zhǎng)保質(zhì)期系O-3和短保質(zhì)期系Nat-2的CAPS-PCR片段被克隆進(jìn)入LAMP的引物之中。根據(jù)C2片段的序列設(shè)計(jì)了LAMP反應(yīng)所需的引物，長(zhǎng)保質(zhì)期和短保質(zhì)期引物的差異在于SNP位點(diǎn)的不同。在對(duì)長(zhǎng)保質(zhì)期的SNP基因檢測(cè)中，長(zhǎng)保質(zhì)期系O-3及其第一代F1、純合和雜合F2代作為模板，在反應(yīng)40 min后發(fā)現(xiàn)反應(yīng)體系的濁度明顯增加。而在對(duì)短保質(zhì)期品種的檢測(cè)中，短保質(zhì)期系Nat-2及其F1代、純合和雜合F2代作為模板，在40 min后發(fā)現(xiàn)濁度明顯增加，而長(zhǎng)保質(zhì)期系O-3及其第一代F1、純合和雜合F2代的DNA模板在反應(yīng)90 min后也沒(méi)有出現(xiàn)渾濁。同時(shí)本研究通過(guò)對(duì)CAPS標(biāo)記物和LAMP標(biāo)記物檢測(cè)數(shù)據(jù)的擬合，發(fā)現(xiàn)所有的基因分型數(shù)據(jù)都是一致的。因此，證明LAMP方法可以用于SNP的輔助標(biāo)記選擇。

4.2 LAMP-SNP法在疾病易感性和藥物基因組學(xué)方面的應(yīng)用

在所有的基因序列差異中，SNP是基因組序列差異中最重要和常見的形式。SNP常常影響到人體的疾病易感性和藥物反應(yīng)的個(gè)體差異。通過(guò)使用電化學(xué)活性物質(zhì)，6種與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的SNP基因缺陷可以通過(guò)電化學(xué)DNA芯片和LAMP技術(shù)得到檢測(cè)[36]。人體的基因組DNA從血液中提取出來(lái)，含有這6種SNP基因缺陷的目標(biāo)物通過(guò)LAMP反應(yīng)得到放大擴(kuò)增。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需要2 h，操作方便簡(jiǎn)單，因此，有望用于SNP基因分型的個(gè)性化藥物研究。

SNP不僅可以作為致病基因研究的標(biāo)記物，還可以用于藥物基因組學(xué)的研究。對(duì)藥物敏感的CYP2C19基因是細(xì)胞色素P450基因家族的一個(gè)成員，參與藥物代謝和顯示多態(tài)性。經(jīng)證實(shí)，等位基因CYP2C19m2 和CYP2C19m3 與日本人代謝缺乏癥患者群體分布密切相關(guān)[37]。奧美拉唑是CYP2C19基因產(chǎn)物代謝的抑制劑，用于治療幽門螺旋桿菌感染。研究表明，感染幽門螺旋桿菌的代謝缺乏癥患者服用奧美拉唑的治療效果往往比強(qiáng)代謝者的效果更好[38]。因此，對(duì)于個(gè)性醫(yī)療護(hù)理來(lái)說(shuō)，一種簡(jiǎn)便有效的藥物代謝SNP分型技術(shù)是十分必要的，研究者針對(duì)CYP2C19基因發(fā)展了一種基于LAMP的SNP分型方法[39]。在進(jìn)行LAMP引物設(shè)計(jì)時(shí)，錯(cuò)配的位點(diǎn)位于F1c和B1的共有堿基上，在內(nèi)引物FIP和BIP的相應(yīng)位置也設(shè)置了突變位點(diǎn)。當(dāng)DNA模板中存在錯(cuò)配時(shí)，野生型引物和突變型引物就無(wú)法形成雙啞鈴結(jié)構(gòu)，由此無(wú)法觸發(fā)循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)。當(dāng)DNA模板中不存在錯(cuò)配時(shí)，野生型引物與模板結(jié)合之后，觸發(fā)了鏈置換循環(huán)放大擴(kuò)增反應(yīng)，同樣BIP與啞鈴結(jié)構(gòu)的另一端莖環(huán)結(jié)構(gòu)的B2C區(qū)域互補(bǔ)，啟動(dòng)了下一輪的放大擴(kuò)增。而當(dāng)突變型引物與模板結(jié)合后，由于3′端無(wú)法互補(bǔ)形成雙啞鈴結(jié)構(gòu)，由此終止了下一輪擴(kuò)增反應(yīng)。

基于LAMP的SNP基因分型檢測(cè)全程在恒溫下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果還可以進(jìn)行可視化檢測(cè)，不需要進(jìn)行大量的熒光標(biāo)記和復(fù)雜的熱循環(huán)儀器，因此，在SNP基因分型檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。

SNP分型技術(shù)依然是藥物研發(fā)和醫(yī)療應(yīng)用中的一個(gè)瓶頸，而目前使用的SNP基因分型技術(shù)幾乎毫無(wú)例外都是分兩步進(jìn)行：第一步，目標(biāo)序列的放大擴(kuò)增；第二步，SNP的檢測(cè)。雖然現(xiàn)行的技術(shù)比較成熟，但是為了縮短反應(yīng)時(shí)間和精簡(jiǎn)檢測(cè)步驟，亟須發(fā)展一種新型的一步法檢測(cè)手段，也就是說(shuō)擴(kuò)增產(chǎn)物本身就可以產(chǎn)生SNP的檢測(cè)信號(hào)。研發(fā)這樣一種技術(shù)的關(guān)鍵是要抑制擴(kuò)增反應(yīng)的背景信號(hào)，比如對(duì)于等位基因特異性PCR來(lái)說(shuō)，引物是針對(duì)SNP錯(cuò)配位點(diǎn)設(shè)計(jì)的，但是非目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物也得到了成倍的放大擴(kuò)增，產(chǎn)生了較強(qiáng)的背景信號(hào)。

Mitani等[40]在LAMP技術(shù)優(yōu)化改進(jìn)的基礎(chǔ)上建立了一種新型快捷的SNP基因分型檢測(cè)方法SMAP 2 (smart amplification process version 2)。雖然野生型引物和野生型基因位點(diǎn)的雜交促進(jìn)了擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，但是野生型LAMP引物設(shè)計(jì)時(shí)在靠近3′端常常會(huì)產(chǎn)生包含SNP位點(diǎn)的錯(cuò)配。事實(shí)上，非目標(biāo)擴(kuò)增常常發(fā)生在使用野生型識(shí)別引物的錯(cuò)配位點(diǎn)上，這種錯(cuò)配擴(kuò)增往往產(chǎn)生了含有SNP錯(cuò)配堿基對(duì)的雙鏈DNA。因此，在SMAP 2技術(shù)中，事先往LAMP反應(yīng)體系中加入了TaqMutS(ThermusaquaticusMutS)蛋白。當(dāng)目標(biāo)序列存在錯(cuò)配時(shí)，TaqMutS蛋白的加入會(huì)抑制核酸擴(kuò)增延伸的進(jìn)程，除此之外，構(gòu)建引物時(shí)采用的不對(duì)稱莖環(huán)結(jié)構(gòu)避免了非特異性擴(kuò)增的發(fā)生，抑制了擴(kuò)增反應(yīng)的背景信號(hào)，保證了LAMP擴(kuò)增檢測(cè)體系的特異性和靈敏度。

5 結(jié)語(yǔ)

LAMP技術(shù)以其方便快捷、簡(jiǎn)便高效、特異性強(qiáng)以及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方便的特點(diǎn)，近年來(lái)得到了廣泛應(yīng)用。LAMP-SNP技術(shù)在傳統(tǒng)LAMP技術(shù)的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)了在同一體系中對(duì)SNP基因缺陷的篩選檢測(cè)。

隨著與微流控技術(shù)、芯片實(shí)驗(yàn)室和毛細(xì)管實(shí)驗(yàn)室等微型實(shí)驗(yàn)室技術(shù)的結(jié)合，LAMP的反應(yīng)體系也越來(lái)越微型化和自動(dòng)化[24-25]。由于微型實(shí)驗(yàn)室技術(shù)在加樣、樣本提取、反應(yīng)體系構(gòu)建等方面的優(yōu)良特性，為L(zhǎng)AMP技術(shù)提供了優(yōu)良的技術(shù)支撐，未來(lái)LAMP-SNP技術(shù)也將朝著更少的試劑消耗、更多的樣本加載和更低的檢測(cè)限的方向發(fā)展，在一定程度上也將大大降低非特異性擴(kuò)增和核酸污染的幾率。以LAMP技術(shù)為基礎(chǔ)的SNP基因分型檢測(cè)方法將有著更高的可靠性及更廣闊的應(yīng)用前景。

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版權(quán)聲明

《化學(xué)與生物工程》編輯部

Application of Loop-Mediated Isothermal Amplification in Detection of Single Nucleotide Polymorphisms

LI Sen1，WANG Yuan-sheng2*，YU Hong-wei2，LI Yu2

(1.DepartmentofNavalArchitectureEngineering,NavalUniversityofEngineering，Wuhan430033，China；2.CollegeofScience，NavalUniversityofEngineering，Wuhan430033，China)

Singlenucleotidepolymorphisms(SNP)，themostcommonformofsequencevariationinthegene，occuraboutat1outofevery1 000basesinthehumangenomesequence.ThereareimportantapplicationsforSNPgenetypingmethodintherelatedgeneidentificationresearchesofgeneticdiseases，diseasesusceptibilityandpharmacogeneticindicator.Loop-mediatedisothermalamplification(LAMP)isanewtypeofnucleicacidamplificationtechnology.LAMP-SNPtechnologyistodesignthespecificprimersaccordingtodifferentSNPgenesinthesamereactionsystemtorealizethedetectionofSNPgenetyping.CombiningwiththeadvantagesofLAMPtechnology，theapplicationofLAMPtechnologyintheSNPdetectionfieldisreviewed.

loop-mediatedisothermalamplification(LAMP);rapiddetection;singlenucleotidepolymorphisms(SNP)

總裝備部武器裝備預(yù)研項(xiàng)目(9140A26030214JB11418)

2016-11-15

李森(1989-)，男，河南南陽(yáng)人，博士研究生，研究方向：生物傳感器，E-mail：qianxun8965@163.com；通訊作者：王源升，教授，博士生導(dǎo)師。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.03.001

Q81

A

1672-5425(2017)03-0001-06

國(guó)信息化建設(shè)，擴(kuò)大本刊及作者知識(shí)信息交流渠道，本刊已被《中國(guó)學(xué)術(shù)期刊

總庫(kù)》及CNKI系列數(shù)據(jù)庫(kù)、《萬(wàn)方數(shù)據(jù)——數(shù)字化期刊群》、《中文科技期刊數(shù)據(jù)庫(kù)(全文版)》、《臺(tái)灣華藝數(shù)據(jù)庫(kù)》等收錄。如作者不同意論文被收錄，請(qǐng)?jiān)趤?lái)稿時(shí)向本刊聲明，本刊將作適當(dāng)處理。

李森，王源升，余紅偉，等.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)中的應(yīng)用[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(3)：1-6.