從氧化應(yīng)激角度探討清腎顆粒對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠的干預(yù)作用

王億平 陳芳 王東 任克軍 金華 王立媛

安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 合肥 230031

從氧化應(yīng)激角度探討清腎顆粒對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠的干預(yù)作用

王億平 陳芳 王東 任克軍 金華 王立媛

安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 合肥 230031

[目的]觀察腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis,RIF）大鼠腎組織中活性氧（reactive oxygen species,ROS）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）的表達(dá)，探討清腎顆粒對(duì)RIF大鼠氧化應(yīng)激的影響。[方法]采用單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction,UUO）建立RIF模型，將60只SD大鼠隨機(jī)分為清腎顆粒組（n=12）、坎地沙坦組（n=12）、模型組（n=13）、假手術(shù)組（n=12）和正常組（n= 11）。因感染、麻醉藥過量、手術(shù)損傷等原因死亡12只大鼠，最后進(jìn)入數(shù)據(jù)分析有48只大鼠，即清腎顆粒組（n=10）、坎地沙坦組（n=10）、模型組（n= 8）、假手術(shù)組（n=9）和正常組（n=11）。清腎顆粒組予清腎顆粒水溶液0.4g/(100g·d)灌胃，坎地沙坦組予坎地沙坦水溶液0.05g/(100g·d)灌胃，模型組、假手術(shù)組及正常組每日給予等量生理鹽水灌胃，療程均為4周。檢測各組大鼠血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）、肌酐（serum creatinine,Scr）和24h尿蛋白定量（24h urinary protein,U-Pro/24h），采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法檢測大鼠腎組織中ROS、MDA、SOD含量。[結(jié)果]清腎顆粒組、坎地沙坦組、模型組BUN、Scr、U-Pro/24h、ROS、MDA水平均高于正常組和假手術(shù)組（P<0.01），SOD水平均低于正常組和假手術(shù)組（P<0.01）；與模型組比較，清腎顆粒組和坎地沙坦組BUN、Scr、U-Pro/24h、ROS、MDA水平明顯降低（P<0.01），SOD水平明顯升高（P<0.01），清腎顆粒組優(yōu)于坎地沙坦組（P<0.05）。[結(jié)論]清腎顆?？梢越档蚒UO大鼠腎組織中ROS、MDA，升高SOD水平，減輕腎組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高抗氧化能力，進(jìn)而發(fā)揮抗RIF作用。

RIF；清腎顆粒；ROS；MDA；SOD；單側(cè)輸尿管梗阻；氧化應(yīng)激

終末期腎臟?。╡nd stage renal disease,ESRD）發(fā)病率逐年升高，雖然腎臟替代治療已取得較大的進(jìn)展，但是患者龐大的醫(yī)療費(fèi)用仍不容樂觀。慢性腎臟病（chronic kidney disease,CKD）終將導(dǎo)致ESRD的

發(fā)生，其病理基礎(chǔ)是腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）。研究證實(shí)氧化應(yīng)激在RIF過程中發(fā)揮重要的作用[1-2]。清腎顆粒作為我院院內(nèi)制劑，前期研究[3-7]顯示其有較好的治療效果。本研究采用單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction, UUO）方法制作RIF大鼠模型，觀察大鼠腎組織中活性氧（reactive oxygen species,ROS）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）的表達(dá)及中藥清腎顆粒對(duì)其干預(yù)作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用清潔級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量（200±20）g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK（皖）2011-002。動(dòng)物房溫度維持在20℃～23℃，濕度維持在45%～60%。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 清腎顆粒由生大黃8g、豬苓10g、丹參30g、白花蛇舌草30g、益母草20g、茵陳20g、茯苓10g、車前草10g、白豆蔻10g、薏苡仁15g、扁豆10g、白術(shù)10g、澤瀉10g、黃連10g組成，安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心加工而成，每袋顆粒劑10g，配制成1mL含0.4g清腎顆粒水溶液（生產(chǎn)批號(hào)：BZ20140816）；坎地沙坦：規(guī)格4mg/片，重慶圣華曦藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，配制成1mL含0.05g坎地沙坦水溶液（國藥準(zhǔn)字H20030771）。ROS、MDA及SOD的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法試劑盒均來源于上海源葉生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)分別為10321R、10417R、10256R。

2 方法

2.1 模型制作及分組 60只SD大鼠隨機(jī)選擇11只大鼠作為正常組，其余49只大鼠制作模型。采用UUO法制作RIF大鼠模型[8]，操作步驟如下：SD大鼠麻醉后選擇左側(cè)背部肋下約0.5cm為切口，局部剃毛、消毒，依次切開皮膚、肌層至腹腔，游離左側(cè)腎臟和輸尿管，結(jié)扎輸尿管兩端后，剪斷輸尿管，逐層縫合皮膚。假手術(shù)組僅分離左側(cè)輸尿管，不結(jié)扎，逐層縫合皮膚。49只大鼠隨機(jī)分為清腎顆粒組12只、坎地沙坦組12只、模型組13只、假手術(shù)組12只。

2.2 給藥方法 各組大鼠均在造模后次日開始灌胃，1次/d。按照文獻(xiàn)[9]劑量給藥，清腎顆粒組每日按0.4g/100g予清腎顆粒水溶液灌胃；坎地沙坦組每日按0.05g/100g予坎地沙坦水溶液灌胃；模型組、假手術(shù)組及正常組每日予等量溫水灌胃。療程均為4周。

2.3 觀察指標(biāo) 各組大鼠造模后4周處死，處死前1d用代謝籠收集24h尿液，檢測24h尿蛋白定量（24-hour urinary protein,U-Pro/24h）；腹主動(dòng)脈取血，采用常規(guī)生化法檢測血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）、肌酐（serum creatinine,Scr）；處死后留取術(shù)側(cè)腎臟，一半置于液氮瓶中保存，ELISA法檢測ROS、MDA、SOD含量，另一半置于4%的多聚甲醛中固定，用于蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin,HE）染色和馬松（Masson）染色。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析。若資料不符合正態(tài)分布或方差齊性，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況比較 由于感染、麻醉藥過量、手術(shù)損傷等導(dǎo)致12只大鼠死亡，最后進(jìn)入數(shù)據(jù)分析有48只大鼠，即清腎顆粒組10只、坎地沙坦組10只、模型組8只、假手術(shù)組9只、正常組11只。隨著灌胃天數(shù)增加，模型組大鼠精神差，動(dòng)作遲緩，活動(dòng)和進(jìn)食少，體毛干枯，體重減輕。而清腎顆粒組大鼠精神稍差，活動(dòng)量、攝食量增加，體毛較模型組光澤，體重較穩(wěn)定?？驳厣程菇M表現(xiàn)介于清腎顆粒組與模型組之間。假手術(shù)組大鼠，術(shù)后前2d精神稍差，后如正常組大鼠一樣，精神良好，反應(yīng)靈敏。

3.2 各組大鼠HE和Masson染色比較

3.2.1 HE染色結(jié)果 正常組、假手術(shù)組腎小管和腎小球大小、結(jié)構(gòu)正常。模型組腎小管、集合管擴(kuò)張呈囊狀，管腔塌陷，上皮細(xì)胞壞死，腎間質(zhì)有巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤和成纖維細(xì)胞增生。與模型組比較，清腎顆粒組腎小管輕度擴(kuò)張，腎小囊擴(kuò)張，仍保留部分正常的腎小管和腎小球結(jié)構(gòu)?？驳厣程菇M介于模型組與清腎顆粒組之間。見圖1。

3.2.2 Masson染色結(jié)果 正常組、假手術(shù)組膠原染色主要位于小管基底膜及其周圍，小管間質(zhì)染色較少。模型組腎間質(zhì)藍(lán)染膠原纖維沉積明顯、炎性細(xì)胞浸潤增多。清腎顆粒組腎間質(zhì)藍(lán)染膠原纖維沉積及炎性細(xì)胞浸潤較模型組明顯減少，而坎地沙坦組介于清腎顆粒組及模型組之間。見圖2。

圖1 各組大鼠腎臟HE染色(200×)Fig.1 The HE staining of renal tissue in each group(200×)

圖2 各組大鼠腎臟Masson染色（200×）Fig.2 The Masson staining of renal tissue in each group(200×)

3.3 各組大鼠BUN、Scr和U-Pro/24h水平比較 模型組、清腎顆粒組、坎地沙坦組大鼠BUN、Scr、U-Pro/ 24h水平均高于正常組及假手術(shù)組（P＜0.01）；與模型組比較，清腎顆粒組和坎地沙坦組BUN、Scr、U-Pro/ 24h水平明顯降低（P＜0.01），清腎顆粒組下降幅度優(yōu)于坎地沙坦組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠BUN、Scr和U-Pro/24h水平比較（±s）Tab.1 The comparison of BUN,Scr and U-Pro/24h among all groups（±s）

表1 各組大鼠BUN、Scr和U-Pro/24h水平比較（±s）Tab.1 The comparison of BUN,Scr and U-Pro/24h among all groups（±s）

注：與正常組比較，▲▲P<0.01；與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與坎地沙坦組比較，△P<0.05。Note:compared with the normal group,▲▲P<0.01;compared with the sham operation group,**P<0.01;compared with the model group,##P<0.01;compared with candesartan cilexetil group,△P<0.05.

組別 N BUN（mmol·L-1） Scr（umol·L-1） U-Pro/24h(mg/24h）正常組假手術(shù)組模型組坎地沙坦組清腎顆粒組11 9 8 1 0 10 4.20±0.57 4.15±0.58 9.38±1.37▲▲**7.25±1.32▲▲**##6.08±1.01▲▲**##△48.60±4.71 50.37±6.66 94.27±16.47▲▲**71.94±9.76▲▲**##62.92±5.83▲▲**##△306.24±68.38 315.65±26.42 629.99±104.80▲▲**508.53±53.14▲▲**##442.80±68.34▲▲**##△

3.4 各組大鼠腎組織中ROS、MDA及SOD水平比較模型組、坎地沙坦組和清腎顆粒組ROS、MDA水平均高于正常組和假手術(shù)組（P＜0.01），SOD水平均低于正常組和假手術(shù)組（P＜0.01）；與模型組比較，清腎顆粒組和坎地沙坦組ROS、MDA水平明顯降低（P＜0.01），SOD水平明顯升高（P＜0.01），清腎顆粒組優(yōu)于坎地沙坦組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠腎組織中ROS、MDA及SOD水平比較（±s）Tab.2 The comparison in kidney tissue between each group of ROS,MDA,SOD levels（±s）

表2 各組大鼠腎組織中ROS、MDA及SOD水平比較（±s）Tab.2 The comparison in kidney tissue between each group of ROS,MDA,SOD levels（±s）

注：與正常組比較，▲▲P<0.01；與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與坎地沙坦組比較，△P<0.05。Note:compared with the normal group,▲▲P<0.01;compared with the sham operation group,**P<0.01;compared with model group,##P<0.01;compared with candesartan cilexetil group,△P<0.05.

組別 N ROS（IU·mL-1） MDA（nmol·mL-1） SOD（ng·mL-1）正常組假手術(shù)組模型組坎地沙坦組清腎顆粒組11 9 8 1 0 10 194.56±81.37 197.27±102.09 497.53±75.56▲▲**377.89±64.32▲▲**##285.81±82.00▲▲**##△2.33±0.43 2.21±0.66 3.64±0.32▲▲**3.03±0.55▲▲**##2.82±0.47▲▲**##△202.91±23.39 204.91±31.48 132.36±10.54▲▲**163.87±22.81▲▲**##178.33±15.46▲▲**##△

4 討論

RIF以腎小管萎縮、細(xì)胞外基質(zhì)積聚和腎間質(zhì)的慢性炎細(xì)胞浸潤為特征，與腎功能的減退密不可分[10-13]。自從2002年Iwano等[14]學(xué)者首次建立UUO小鼠模型，現(xiàn)此模型已成為公認(rèn)的RIF模型，可以較為準(zhǔn)確反映人類梗阻性腎病和腎臟纖維化發(fā)展過程。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致細(xì)胞損傷、衰老和死亡的重要原因之一。正常情況下，體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)維持動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)機(jī)體發(fā)生病變時(shí)，此平衡狀態(tài)被打破。體內(nèi)氧化系統(tǒng)主要是機(jī)體產(chǎn)生的ROS，抗氧化系統(tǒng)包括SOD、過氧化氫酶等。在腎臟，ROS可以直接對(duì)各類腎細(xì)胞產(chǎn)生直接損傷作用；亦可誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡或壞死，破壞腎小球?yàn)V過膜，是產(chǎn)生蛋白尿的主要危險(xiǎn)因素[15-16]。另外，ROS還可以通過刺激系膜細(xì)胞中纖溶酶原激活劑抑制物I的表達(dá)，使系膜細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力降低，促進(jìn)腎內(nèi)基質(zhì)重構(gòu)、纖維化和腎小球硬化[17]。SOD活力的高低能間接反應(yīng)機(jī)體清除氧自由基的能力，而MDA的高低又能間接反應(yīng)機(jī)體細(xì)胞受到自由基攻擊損傷的嚴(yán)重程度，因此常用MDA與SOD來評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化應(yīng)激的水平。

研究發(fā)現(xiàn)[8]UUO模型腎小管間質(zhì)病變中氧化應(yīng)激增加，氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)物的增加可能在UUO模型腎小管間質(zhì)病變中有重要的作用。張曉喧等[18]將大鼠行UUO造模10d后，發(fā)現(xiàn)梗阻側(cè)腎臟腫大、腎實(shí)質(zhì)變薄，腎間質(zhì)水腫，彌漫炎細(xì)胞浸潤，腎小管擴(kuò)張或萎縮，部分腎小管腔內(nèi)有蛋白或細(xì)胞管型，間質(zhì)趨于纖維化；與假手術(shù)組相比，UUO組梗阻側(cè)腎臟病理改變明顯，且腎組織中羥脯氨酸和MDA含量增加，SOD活性下降，說明氧化應(yīng)激參與UUO模型腎臟纖維化的形成。鄧堯等[19]將60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為UUO組、人參皂苷組、模型組和科素亞組，并進(jìn)行單側(cè)輸尿管結(jié)扎，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UUO模型組ROS、MDA含量分別在3d、7d、14d均較假手術(shù)組升高，SOD含量較假手術(shù)組降低，說明UUO模型中存在氧化應(yīng)激。

清腎顆粒主要由生大黃、薏苡仁、白術(shù)、丹參等藥物組成，具有清熱化濕祛瘀之功效。方中生大黃為君藥，具有清熱泄?jié)嶂?；黃連、白花蛇舌草、茵陳為臣藥，助君藥加強(qiáng)清熱利濕之力；佐以扁豆、白豆蔻、薏苡仁、茯苓、豬苓、澤瀉、白術(shù)、車前草益氣健脾、滲水利濕，丹參、益母草活血化瘀亦為佐藥。大黃酸是中藥大黃提取的蒽醌類衍生物，研究發(fā)現(xiàn)大黃酸具有廣泛的藥理作用，有改善及部分抗氧化、抗炎、調(diào)脂等作用，且不良反應(yīng)輕微，此外，它還具有抑制成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成，改善腎臟纖維化的作用[20]。中藥黃連亦具有抗氧化作用，可能與清除氧自由基、減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、增強(qiáng)抗氧化酶活性等途徑有關(guān)[21]。研究發(fā)現(xiàn)[22]丹參有效成分丹參酮ⅡA可以影響人腎小球系膜細(xì)胞晚期糖化終產(chǎn)物受體的表達(dá)及改善氧化應(yīng)激的水平。

本研究結(jié)果顯示，模型組、坎地沙坦組和清腎顆粒組大鼠ROS、MDA水平均高于正常組和假手術(shù)組，SOD水平均低于正常組和假手術(shù)組（P＜0.01），說明UUO模型大鼠體內(nèi)存在氧化應(yīng)激反應(yīng)。與模型組比較，清腎顆粒組和坎地沙坦組ROS、MDA水平明顯降低（P＜0.01），SOD水平明顯升高（P＜0.01）；亦可降低BUN、Scr、U-Pro/24h水平及減輕UUO模型大鼠腎組織的病理改變程度（P＜0.01），且清腎顆粒組優(yōu)于坎地沙坦組（P＜0.05）。表明清腎顆粒可以改善UUO大鼠腎功能和腎臟病理損害的程度，減少24h尿蛋白定量，減輕腎臟組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高抗氧化能力，進(jìn)而發(fā)揮抗RIF作用。

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Based on Oxidative Stress Mediated Mechanism to Explore the Intervention of Qingshen Granule Ageinst Renal Fibrosis

WANG Yiping,CHEN FangWANG Dong,et al First Affiliated Hospital of Anhui University of TCM,Hefei(230031)

[Objective]Through the detection of unilateral ureteral obstruction(UUO)induced renal interstitial fibrosis(RIF)in the renal tissue of rats reactive oxygen species(ROS),malondialdehyde(MDA)and superoxide dismutase(SOD)expression level to explore the intervention of Qingshen granule with oxidative stress.[Method]Used unilateral ureteral obstruction method(UUO)to model rats,60 SD rats randomly divided into Qingshen granule group(n=12), candecartan cilexetil group(n=12),model group(n=13),sham operation group(n=12)and normal group(n=11).Due to infection,injury,surgical anesthetic overdose deaths in 12 rats,and finally into the data analysis of 48 rats,Qingshen granule group(n=10),candecartan cilexetil group(n=10),model group(n=8), sham operation group(n=9)and normal group(n=11)Qingshen granule group were given Qingshen granule 0.4g(100g·d)gavage,candecartan cilexetil group were given candecartan cilexetil capsule 0.05g/(100g·d)gavage,model group,sham operation group and the normal group were given the same amount of normal saline per day orally,for 4 weeks.The rats serum creatinine(Scr),blood urea nitrogen(BUN)and 24h urinary protein(U-Pro/24h)level were detected. Using enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)to detect the renal tissue of rats ROS,MDA and SOD.[Results]Qingshen granule group,candecartan cilexetil group,model group BUN,Scr,U-Pro/24h,ROS and MDA were higher compared with normal group and sham operation group(P<0.01),the level of SOD was lower(P<0.01).Compared with model group,Qingshen granule group and candecartan cilexetil group,the levels BUN,Scr,U-Pro/24h,ROS and MDA were significantly lower(P<0.01),the level of SOD was higher(P<0.01),Qingshen granule group was better than the candecartan cilexetil group(P<0.05). [Conclusion]Qingshen granule can reduce the renal tissue of ROS and MDA,rise the renal tissue of SOD,relieve oxidative stress of kidney and prevent or mitigate the occurrence and development of renal fibrosis.

renal interstitial fibrosis;Qingshen granule;reactive oxygen;malondialdehyde;superoxide dismutase;unilateral ureteral obstruction;oxidative stress

R331

A

1005-5509（2017）02-0156-06

10.16466/j.issn1005-5509.2017.02.017

2016-09-30）

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81473673、81403372）；安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（1508085MH198）

Fund projects:National Natural Science Foundation of China(81473673,81403372);Natural Science Foundation of Anhui Province(1508085MH198)