RP—HPLC法測定不同煎煮時間下藏藥三果湯中槲皮素、鞣花酸、柯里拉京的含量變化

左曉霜+陳平+馬定乾

摘要：目的 測定并分析在不同煎煮時間條件下藏藥三果湯中槲皮素、鞣花酸、柯里拉京的含量變化。方法 分別稱取10 g配置好的藏藥三果湯散于4個燒杯中，各加入純凈水30 mL，料液比為1：3。將燒杯置于墊有石棉網(wǎng)的電磁爐上，用180℃將其煮沸，待藥品沸騰后，將4個燒杯轉(zhuǎn)移到溫度為80℃的恒溫水浴鍋中，進行10、20、30、40 min的煎煮。待煎煮時間均完畢后，靜置冷卻至室溫，過濾，微孔濾膜抽濾，用反相高效液相色譜測定槲皮素、鞣花酸、柯里拉京的含量變化。結(jié)果 藏藥三果湯中的槲皮素、鞣花酸、柯里拉京均在煎煮時間為40 min時含量最高。 結(jié)論 日常中藥的煎煮一般均煎煮超過30 min，因此本實驗以煎煮時間對藏藥三果湯的某些有效成分含量的影響做出研究，為藏藥三果湯的最佳煎煮時間以及某些有效成分的提取、制備及資源開發(fā)利用提供一定的參考。

關(guān)鍵詞：三果湯；槲皮素；鞣花酸；柯里拉京

中圖分類號：R284 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2017）02-0076-04

【Abstract】Objective： To determine and analyze the content changes of quercetin， ellagic acid and corilagin in Sanguotang of Tibetan medicine in different boiling time. Methods： 10 g of Sanguotang powder was weighed in four beakers and 30 mL of pure water was added in each beaker. The ratio of solid to liquid was 1： 3. The beakers were placed on the induction cookers matted with asbestos net to be boiled at 180℃ until the drugs were boiling. The four beakers were transferred to a temperature of 80℃ constant temperature water bath and decocted for 10 min， 20 min， 30 min and 40 min. After decocting， the drug was statically cooled down to room temperature， filtrated， and filtrated with microporous membrane， and the content of quercetin， ellagic acid and corilagine were determined by RP-HPLC. Results： The contents of quercetin， ellagic acid and corilagin were the highest at the time of 40 min. Conclusion： The decoction of traditional Chinese medicine is generally decocted for more than 30 minutes. The study provides the best decocting time and certain reference for the extraction， preparation and utilization of some effective components of Sanguotang.

【Key words】Sanguotang， quercetin， ellagic acid， corilagin

藏藥三果湯又名哲布松湯，初載于我國藏藥藥典《四部醫(yī)典》中，是由3味藥材即訶子（Terminalia chebula Retz.）又名訶黎勒，毛訶子（Terminalia bellirica Roxb.），又名毗黎勒和余甘子（Phyllanthus emblica L.），又名庵摩勒組成，《四部醫(yī)典》記載其：“主治瘟疫、紊亂熱癥、促使熱癥成型”[1]。后又收載于95年的藏藥《部頒標準》[2]、2008年的《四川省阿壩藏族羌族自治州藏藥制劑標準》[3]，具有清熱生津、調(diào)和氣血、化解壞血的功效?，F(xiàn)代藥理學研究表明，三果湯具有抗氧化[4][5][6]、抗癌[7][8][9]、抗輻射[10]、抗炎[11]、抗菌[12]等作用。

現(xiàn)代研究表明三果湯的化學成分含有酚酸類、鞣質(zhì)類、三萜類、黃酮類等。鞣花酸、柯里拉京屬于酚酸類，槲皮素屬于黃酮類。鞣花酸（Ellagic acid，EA）是廣泛存 在于各種植物軟果、堅果等組織[HJ2.5mm]中的一種多酚二內(nèi)酯，是沒食子酸的二聚衍生物。現(xiàn)代研究表明鞣花酸具有多種生物活性功能，如抗氧化、抗癌、抗突變等，并對人體免疫缺陷病毒也有抑制作用[13]黃酮類化合物槲皮素（quercetin，3，3，45，7-pentahydroxyflavone）是一個典型的多酚化合物，廣泛存在于水果蔬菜中，具有抗炎、抗氧化、誘導(dǎo)凋亡活性等[14]。 柯里拉京（Corilagin）又稱鞣云實素，屬天然植物多酚單寧酸類化合物，常見于老鸛草中，國內(nèi)外研究均表明柯里拉京具有抗腫瘤作用，能夠明顯抑制肺癌細胞生長[15]。見圖1。

本實驗根據(jù)藏藥三果湯中黃酮類物質(zhì)和多酚類物質(zhì)的性質(zhì)以及槲皮素、鞣花酸、柯里拉京的理化性質(zhì)，測定在不同煎煮時間的條件下，以上物質(zhì)的含量的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 余甘子干果、訶子干果、毛訶子干果（河北省安國市旭芳中藥材經(jīng)營有限公司），經(jīng)本校藥用植物教研室李海寧教師鑒定是大戟科葉下珠屬余甘子果實、使君子科植物毗黎勒的干燥成熟果實。乙腈（色譜純），甲醇（色譜純），甲醇（分析醇），磷酸（所有試劑均購自云南丹赤貿(mào)易有限公司），純化水?？吕锢藴势罚ǔ啥计杖鸱萍奸_發(fā)有限公司，批號：14021908）、槲皮素標準品（上海源葉生物科技有限公司，CAS號：117-39-5）、鞣花酸標準品（同力生物，批號：BBP03169）。

1.2 儀器 DFY-600高速萬能粉碎機、Agilent1200型高效液相色譜儀（VWD檢測器）、分析天平、水浴鍋（HH-6）。

1.3 方法

1.3.1 三果湯散的制備 將余甘子、訶子、毛訶子三味藥材干果均去核后分別經(jīng)高速萬能粉碎機打粉，再過5號篩，備用。按《藏藥標準》稱取余甘子粉末12 g，訶子粉15 g，毛訶子粉10 g各4份，分別混合均勻即得三果湯散，并置于4個燒杯中，備用。

1.3.2 三果湯供試品的制備 將4個燒杯中分別加入純化水各約100 mL，使料液比為1：3。將燒杯均置于墊有石棉網(wǎng)的電磁爐上加熱（溫度為140℃），待藥液沸騰后，取下燒杯置于溫度為80℃的恒溫水浴鍋中，進行煎煮，并按10、20、30、40 min的時間計時，煎煮時間完畢后，置于室溫冷卻并過濾，將濾液用0.45的微孔濾膜過濾即得HPLC的供試品。

1.3.3 槲皮素、鞣花酸、柯里拉京的標準品溶液制備 精密稱取槲皮素標準品2.2 mg，置于10 mL的容量瓶中，加60%乙醇（分析醇）定容成0.22 mg/mL的溶液，用0.45的微孔濾膜過濾即得HPLC的對照品，備用。精密稱取鞣花酸標準品0.80 mg，置于10 mL的容量瓶中，加80%甲醇（分析醇）定容成0.08 mg/mL的溶液，用0.45的微孔濾膜過濾即得HPLC的對照品，備用。精密稱取柯里拉京標準品0.10 mg，置于10 mL的容量瓶中，加100%的甲醇（分析醇）定容成0.01 mg/mL的溶液，用0.45的微孔濾膜過濾即得HPLC的對照品，備用。

1.3.4 槲皮素測定方法

1.3.4.1 槲皮素色譜條件 色譜柱為Agilent C18ZORBAX SB-C18柱（4.6×250 mm，5 um）；流動相：甲醇-0.5%磷酸溶液（50：50），檢測波長為370 nm，柱溫30℃。進樣量10 uL，流速為1.0 mL/min。

1.3.4.2 槲皮素線性關(guān)系考察 精密稱取對照品2.2 mg，用60 %的乙醇定容至10 mL容量瓶中，搖勻作為儲備液。按上述槲皮素的色譜條件分別取1、3、5、7、9、11 uL不同體積進樣，以槲皮素的峰面積（Y）對標準品的質(zhì)量（X）進行線性回歸，可得出線性方程Y=47491X+1.301，r=0.9992。結(jié)果表明：槲皮素峰面積值與質(zhì)量有良好的線性關(guān)系，線性范圍為0.22-2.42μg。（HPLC色譜圖見圖2）

1.3.5 鞣花酸、柯里拉京含量測定方法

1.3.5.1 鞣花酸、柯里拉京色譜條件 色譜柱為Agilent C18ZORBAX SB-C18柱（4.6×250 mm，5 um）；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液梯度洗脫：0-10 min，5：95；10-15 min，10：90；15-30 min，15：85；30-50 min，30：70；50-60 min，40：60。檢測波長為259 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進樣量為10 μL。

1.3.5.2 鞣花酸、柯里拉京線性關(guān)系考察 精密稱取鞣花酸對照品0.80 mg，用80 %的甲醇定容至10 mL容量瓶中，搖勻作為儲備液。精密稱取柯里拉京對照品0.10 mg，用100 %的甲醇定容至10 mL容量瓶中，搖勻作為儲備液，按上述鞣花酸、柯里拉京的色譜條件分別取1、3、5、7、9、11 uL不同體積進樣，以鞣花酸、柯里拉京的峰面積（Y）對標準品的質(zhì)量（X）進行線性回歸，可得出二者的線性方程，分別為：Y=19853X-8.9757，r=0.9999。：Y=53331X+710.37，r=0.997。結(jié)果表明：鞣花酸、柯里拉京峰面積值與質(zhì)量有良好的線性關(guān)系，線性范圍分別為0.08-0.88μg和0.01-0.11μg。（HPLC色譜圖見圖3、圖4）

1.4 精密度實驗

1.4.1 槲皮素的精密度實驗 取同一槲皮素對照品溶液按“1.3.4.1”項下的色譜條件，連續(xù)測定6針，按峰面積積分值計算，槲皮素的RSD=0.70%，表明儀器精密度良好。

1.4.2 鞣花酸的精密度實驗 取同一鞣花酸對照品溶液按“1.3.5.1”項下的色譜條件，連續(xù)測定6針，按峰面積積分值計算，鞣花酸的RSD=0.47%，表明儀器精密度良好。

1.4.3 柯里拉京的精密度實驗 取同一柯里拉京對照品溶液按“1.3.5.1”項下的色譜條件，連續(xù)測定6針，按峰面積積分值計算，柯里拉京的RSD=1.6%，表明儀器精密度良好。

1.5 穩(wěn)定性實驗

1.5.1 槲皮素穩(wěn)定性實驗 取備用槲皮素對照品溶液按“1.3.4.1”項下的色譜條件，在0、1、2、4、6h這些時間點上測定6針，按峰面積積分值計算，槲皮素的RSD=0.43%，表明穩(wěn)定性良好。

1.5.2 鞣花酸穩(wěn)定性實驗 取備用鞣花酸對照品溶液按“1.3.5.1”項下的色譜條件，在0、1、2、4、6h這些時間點上測定6針，按峰面積積分值計算，鞣花酸的RSD=0.45%，表明穩(wěn)定性良好。

1.5.3 柯里拉京穩(wěn)定性實驗 取備用柯里拉京對照品溶液按“1.3.5.1”項下的色譜條件，在0、1、2、4、6h這些時間點上測定6針，按峰面積積分值計算，柯里拉京的RSD=2.5%，表明穩(wěn)定性良好。

2 實驗結(jié)果與分析 見表1-2。

在不同的煎煮時間下，藏藥三果湯中的部分有效成分槲皮素、鞣花酸、柯里拉京的含量均隨煎煮時間的延長而增加。槲皮素的含量在10-30 min內(nèi)變化緩慢，而在30-40 min時含量變化顯著（見圖4）；鞣花酸的含量在10-30 min內(nèi)緩慢增加，在30-40 min時含量顯著增加（見圖5）；柯里拉京的含量在10-20 min內(nèi)增加，在20-30 min內(nèi)變化較為緩慢，在30-40min內(nèi)，含量明顯增加（見圖6）。而且槲皮素含量較少，鞣花酸含量最多，柯里拉京次之。經(jīng)課題組前期預(yù)實驗結(jié)果顯示，這三種有效成分在煎煮時間超過60 min后，含量呈減少的趨勢，且煎煮40、50、60 min的實驗結(jié)果近似，因此本實驗選取煎煮較短時間來測定藏藥三果湯中有效成分的含量變化。

3 結(jié)論

本實驗運用RP-HPLC法測得藏藥三果湯在不同煎煮時間的條件下，其有效成分槲皮素、鞣花酸、柯里拉京均在煎煮40min時含量最高，得出以上結(jié)果提示因為中藥材在煎煮過程中要受熱充分，且有些化學成分對溫度的敏感程度不同，所釋出的含量不同。本實驗結(jié)合前期預(yù)試驗選定了煎煮藏藥三果湯的最適時間為40min，不宜超過60min。為藏藥三果湯的湯劑制備、質(zhì)量控制及資源開發(fā)利用提供一定的參考。

參考文獻：

[1]羅達尚.新修晶珠本草[M].成都：四川科學技術(shù)出版社，2004：441，470，471.

[2]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準藏藥[M]，第一冊1995：264.

[3]四川省阿壩食品藥品監(jiān)督管理局 四川省阿壩藏族憲族自治州藏藥制劑標準[M]，2008：290.

[4]項朋志，余洪，劉瓊，等.藏藥大三果抗氧化活性研究[J].化學與生物工程，2013，30（11）：27-30.

[5]GunjalA H，Harimohan C，Harisha C R，etal.Pharmacognostical andPreliminaryphysicochemical evaluation of Triphaladi granules-A polyherbal Ayurvedic formulation.[J].Ayu，2013，34（3）：288-293.

[6]Deepa B，Gurumurthy P，Borra S K，et al.In vitro and in vivo protective action of ethanolic extract of Triphala on LDL against glycation-oxidation[J].African Journal of Pharmacy & Pharmacology，2014.

[7]Vadde R，Radhakrishnan S，Reddivari L，et al.Triphala ExtractSuppressesProliferation and Induces Apoptosis in Human Colon Cancer Stem Cells via Suppressing c-Myc/Cyclin D1 and Elevation of Bax/Bcl-2 Ratio.[J].Biomed Research International，2015，.

[8]Russell L H，Elizabeth M，Badisa R B，etal.Differential cytotoxicity of triphala and its phenolic constituent gallic acid on human prostate cancer LNCap and normal cells.[J].Anticancer Research，2011，31（11）：3739-3745.

[9]Lu K，Chakroborty D，Sarkar C，etal.Triphala and Its Active Constituent Chebulinic Acid Are Natural Inhibitors of VascularEndothelial Growth Factor-A MediatedAngiogenesis[J].Plos One，2012，7（8）：906-907.

[10]Singh D P，Mani D.Protective effect of Triphala Rasayana against paracetamol-induced hepatorenal toxicity in mice[J].Journal of Ayurveda & Integrative Medicine，2014.

[11]Rayudu V，Raju A B.Effect of Triphala on dextran sulphate sodiuminduced colitis in rats[J].Ayu，2014，35（3）：333-338.

[12]Mahajan D H，Bhoyar M S，Chaudhari S S.EFFICACY OF TRIPHALA KWATH YONI DHAWAN WITH TRIPHALA SIDDHA GHRITA PRATISARANIN EPISIOTOMY WOUND[J].International Journal of Research inAyurveda & Pharmacy，2013，4（2）：249-252.

[13]丁運生，孫小虎，李有桂等.鞣花酸及其衍生物研究進展[J].合肥工業(yè)大學學報（自然科學版）.2008，31（11）：1809-1812.

[14]Kawabata K，Kawai Y，Terao J.Suppressive effect of quercetin on acute stress-induced hypothalamic-pituitary-adrenal axis response in WistarRats[J].J Nutr Biochem，2010，21（5）：374.

[15]朝陽，王德昌，陳玉武等.柯里拉京抗腫瘤和致突變作用實驗研究[J].腫瘤防治雜志，2003，10（5）：469.

（收稿日期：2016-11-26）