青鵬膏劑穴位貼敷對肥大細(xì)胞數(shù)量及 脫顆粒的影響*

安 娜 屈敬陽 劉丁丁 楊志新(承德 067000)

河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所

青鵬膏劑穴位貼敷對肥大細(xì)胞數(shù)量及 脫顆粒的影響*

安 娜 屈敬陽 劉丁丁△楊志新△△(承德 067000)

河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所

目的：觀察體表穴區(qū)貼敷青鵬膏劑后，大鼠穴區(qū)內(nèi)肥大細(xì)胞(MCs)的分布以及數(shù)量和脫顆粒的變化，了解穴位貼敷對皮膚組織的影響，研究其發(fā)揮作用的可能性機(jī)理。方法:健康Wistar大鼠30只,隨機(jī)分為空白對照組(A組)、電針組(B組)和青鵬膏劑貼敷組(C組)，每組10只。干預(yù)組動(dòng)物給予青鵬膏劑貼敷或電針刺激7d后, 分別取3組動(dòng)物的“大椎”穴區(qū)皮膚組織塊做冰凍切片，經(jīng)亞鐵氯化銅法示乙酰膽堿酯酶并甲苯胺蘭復(fù)染，比較3組“大椎”穴區(qū)組織MCs分布、數(shù)量及脫顆粒的差異，研究穴區(qū)內(nèi)MCs的形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果: 各組“大椎”穴區(qū)真皮、皮下組織和肌肉組織中都分布著大小、數(shù)量不等的MCs，以皮下組織層分布最為廣泛，多沿神經(jīng)或血管分布。與A組比較，青鵬膏劑貼敷組穴區(qū)組織局部MCs數(shù)量及脫顆粒率顯著升高，差異有顯著性(P<0.05)。結(jié)論:青鵬膏劑穴位貼敷能夠明顯引起皮膚組織內(nèi)MCs數(shù)量增多及脫顆粒，有促聚集作用，是穴位貼敷與經(jīng)絡(luò)、藥物協(xié)同增效的可能性因素之一。

青鵬膏劑；穴位貼敷；肥大細(xì)胞；脫顆粒；電針；大椎穴

穴位貼敷療法，[1]最早見于《五十二病方》，是以中醫(yī)整體觀念理論為指導(dǎo)，依據(jù)經(jīng)絡(luò)學(xué)說，應(yīng)用中藥作用于腧穴，繼而通過經(jīng)絡(luò)作用于肌體，從而達(dá)到疏通氣血、調(diào)整陰陽的作用。其特點(diǎn)是操作作簡便、用藥安全、經(jīng)濟(jì)廉價(jià)。青鵬膏劑為藏藥經(jīng)典方劑，是由選自于青藏高原的傳統(tǒng)藏藥亞大黃、鐵棒錘、棘豆、訶子、毛訶子、人工麝香、安息香等9味組成，經(jīng)特殊工藝加工而成的外用膏劑，[2]具有活血祛瘀、瀉火解毒、除風(fēng)濕止痹痛等功效。[3]本實(shí)驗(yàn)擬以青鵬膏劑穴位貼敷對皮膚組織內(nèi)肥大細(xì)胞(MCs)的影響為切入點(diǎn)，研究穴位貼敷療法發(fā)揮療效是否與皮膚組織結(jié)構(gòu)的變化相關(guān)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康Wsitar大鼠30只，體質(zhì)量230～240g，雌雄不拘，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司〔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):scxk(京)2012-0001〕。實(shí)驗(yàn)中，對動(dòng)物處置完全遵循《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 藥物、儀器與試劑 青鵬膏劑(由亞大黃、鐵棒錘、棘豆等9味藏藥運(yùn)用藏藥理論配伍，經(jīng)過煮沸、提取、濃縮等步驟制成的軟膏，購自西藏林芝奇正藏藥廠, 國藥準(zhǔn)字Z54020140)；電針治療儀G6805-Ⅱ型(青島鑫升實(shí)業(yè)有限公司)，恒冷箱切片機(jī)(英國ThermoFisherScientific公司)；硫代乙酰膽堿(日本TCI公司)，甲苯胺藍(lán)(TolurdineBlueO)(美國Amresco公司)。

2 方法

2.1 分組及處理方法 30只大鼠隨機(jī)分為空白對照組(A組)、電針組(B組)和青鵬膏劑貼敷組(C組)，每組10只。 空白對照組：于實(shí)驗(yàn)中不做干預(yù)，不給予其它任何刺激；電針組：將大鼠固定后，根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》(郭義主編，中國中醫(yī)藥出版社，2008)大鼠常用針灸穴位，選大椎穴，采用電針法，用毫針針刺，得氣后針柄接電針治療儀G6805-Ⅱ型，刺激參數(shù)為：2/15Hz，1mA，每次電針時(shí)間20min，1次/d；青鵬膏劑組：將青鵬膏劑均勻涂敷于以大椎穴為中心, 直徑為1.5cm的區(qū)域內(nèi)，25mg/次，2次/d(上午8點(diǎn)及下午4點(diǎn))。干預(yù)結(jié)束后，給予大鼠標(biāo)準(zhǔn)育成飼養(yǎng)過夜。在開始后的7d內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)，完成干預(yù)后取材。

2.2 取材與染色 取大鼠“大椎”穴區(qū)皮下組織塊(包括皮膚、皮下結(jié)締組織和少量肌肉組織, 大小約(1×1×0.5cm)，用錫箔紙包好后放入凍存管中，編號(hào)，放入-80℃冰箱中保存。用恒冷箱切片機(jī)切片，厚度約15μm。后經(jīng)乙酰膽堿酯酶組化染色加甲苯胺藍(lán)復(fù)染組織切片，[4]常規(guī)酒精脫水(脫水時(shí)間不宜過長，每級(jí)10～30s,依據(jù)顯微鏡下MCs顏色深淺調(diào)整脫水時(shí)限)，二甲苯透明4min左右，中性樹膠封片。

2.3 觀察MCs分布，對MCs計(jì)數(shù)及計(jì)算脫顆粒率 在光學(xué)顯微鏡下觀察穴區(qū)皮膚組織內(nèi)MCs的分布和形態(tài)特征。每只大鼠觀察“大椎”穴區(qū)深層皮下組織4張切片, 每張切片觀察3個(gè)視野(100倍), 分別計(jì)數(shù)MCs數(shù)量及脫顆粒數(shù), 用脫顆粒率計(jì)算公式(脫顆粒率=脫顆粒細(xì)胞數(shù)/MCs數(shù)量)，求得每張切片MCs的脫顆粒率。取平均值作為該穴區(qū)組織的脫顆粒率。

3 結(jié)果

3.1 各組穴區(qū)內(nèi)MCs分布規(guī)律及計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)的組織切片形態(tài)學(xué)觀察顯示：各組“大椎”穴區(qū)真皮、皮下組織和肌肉組織中都分布著大小、數(shù)量不等的MCs，多成條帶狀分布，以皮下組織層分布最為廣泛。如圖1所示：MCs多呈圓形、卵圓形,胞質(zhì)內(nèi)充滿異染性藍(lán)色顆粒，多沿神經(jīng)或血管等分布，且青鵬膏劑貼敷組與電針組MCs數(shù)量明顯多于空白組。如圖2所示；數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表明：與A組相比，其他2組穴區(qū)組織局部MCs數(shù)量顯著升高，差異顯著(P<0.01)。B、C組做組間比較，差異無顯著性(P> 0.05)如表1所示。

圖1 大鼠“大椎”穴區(qū)MCs在真皮、皮下、 肌肉分布情況(×100)

注：青鵬膏劑貼敷組:1 真皮層，2 皮下組織層，3 肌肉組織層。黑色箭頭所指為MCs

3.2 各組“大椎”穴區(qū)MCs脫顆粒率的比較 表1顯示，各組穴區(qū)MCs脫顆粒率分析比較為青鵬膏劑組> 電針組> 空白對照組。其中，青鵬膏劑組與空白對照組差異具有非常顯著性(P< 0.01)；電針組與空白對照組組間差異具有非常顯著性(P< 0. 01)，電針組與青鵬膏劑組差異無顯著性(P> 0.05)。

圖2 各組大鼠“大椎”穴區(qū)皮下組織 MCs分布情況(×100)

注：A.空白組，B.電針組，C.青鵬膏劑貼敷組;黑色箭頭所指為MCs；紅色箭頭所指為血管；綠色箭頭指為神經(jīng)。

組別例數(shù)MCs計(jì)數(shù)(個(gè))MCs脫顆粒率(%)A組1026.87±0.41 29.91±1.42 B組1036.04±1.53*57.48±1.63*C組1038.17±1.46*62.49±0.05*

注：與A組比較，*P<0.01

4 討論

依據(jù)經(jīng)絡(luò)學(xué)說：經(jīng)絡(luò)是人體內(nèi)運(yùn)載氣血的通道，能夠溝通表里內(nèi)外，聯(lián)系五臟六腑。穴位貼敷療法，是將中藥涂敷于體表腧穴，透過皮膚、腧穴，經(jīng)絡(luò)，達(dá)到治愈疾病的目的，實(shí)質(zhì)在于經(jīng)絡(luò)、穴位與藥物的有機(jī)融合。[5]現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，藥物作用于腧穴后，該穴區(qū)的組織結(jié)構(gòu)、皮膚、神經(jīng)、血管等均發(fā)生變化，進(jìn)而在相應(yīng)組織器官產(chǎn)生藥理效應(yīng)，起到治療作用” 。[6]這可能是藥物顯效的可能性機(jī)理之一。目前關(guān)于中藥穴位貼敷經(jīng)皮給藥的機(jī)制研究報(bào)道尚少。

經(jīng)穴組織內(nèi)MCs的分布、數(shù)量、脫顆粒及在循經(jīng)感傳現(xiàn)象中的作用機(jī)制是目前國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注研究的熱點(diǎn)之一。近20年來的研究證明,人體經(jīng)絡(luò)穴位的物質(zhì)基礎(chǔ)是以結(jié)締組織為基礎(chǔ),尤與MCs關(guān)系密切。[7]羅氏等[4，8-10]研究發(fā)現(xiàn)電針針刺穴位能引起MCs數(shù)量的變化及其脫顆粒的發(fā)生以及通過電針刺激，MCs與神經(jīng)、血管構(gòu)成接觸聯(lián)系,且青鵬膏劑貼敷裸鼠穴區(qū)也能引起MCs數(shù)量增多及血管擴(kuò)張。本實(shí)驗(yàn)比較電針與穴位貼敷兩種中醫(yī)傳統(tǒng)治療方法在引起MCs形態(tài)學(xué)方面的變化。二者沒有顯著差異，有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)觀察到青鵬膏劑組貼敷“大椎”穴區(qū)后，皮膚組織MCs數(shù)量及脫顆粒數(shù)量, 均明顯多于對照組, 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果顯示二者間差異有顯著性,說明穴位貼敷可使MCs向穴位遷移,以及引起MCs的脫顆粒變化。這提示青鵬膏劑穴位貼敷的藥效作用與MCs參與密切相關(guān)。可能是通過脫顆粒釋放活性物質(zhì)發(fā)揮調(diào)節(jié)肌體、治愈疾病的作用，這將是筆者下一步深入研究的方向和課題。

[1]吳桂華，孫通華，崔艷霞，等.穴位貼敷的臨床實(shí)驗(yàn)研究概況[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2010，8(12)：265-266

[2]鄭福榮.奇正青鵬膏劑外敷配合按摩治療網(wǎng)球肘56例報(bào)告[J].臨床醫(yī)藥實(shí)踐,2010,19(6B): 699-700

[3]王春萍,石義華.奇正青鵬軟膏外用治療七葉皂苷鈉所致靜脈炎療效觀察[J].護(hù)理學(xué)雜志,2015,30(3):37-38

[4]羅明富,宋曉晶.報(bào)告一種同時(shí)顯示肥大細(xì)胞、血管、神經(jīng)等組織成分的新染色方法[J].中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2012,21(5):499-500

[5]謝洋，余學(xué)慶.試述穴位貼敷的作用機(jī)理及其臨床運(yùn)用[J] .中國醫(yī)藥指南，2008,6(24) :320-322

[6]劉強(qiáng),周莉玲,李銳.中藥透皮吸收制劑的研究思路[J] .中藥新藥與臨床藥理,1997,8(2)：116-118

[7]張迪,丁光宏,沈雪勇,等.經(jīng)絡(luò)穴位與肥大細(xì)胞相關(guān)性研究進(jìn)展[J].針刺研究,2005,30(2):115-116

[8]羅明富,何俊娜,郭瑩,等. 電針和懸灸對“大椎”穴區(qū)肥大細(xì)胞脫顆粒不同影響的研究[J] .針刺研究,2009,32(5):327-329

[9]張金鈴,羅明富,崔山佳.肥大細(xì)胞在經(jīng)穴組織內(nèi)的分布與脫顆粒觀察[J].解剖科學(xué)進(jìn)展,2010,16(1):36-38

[10]羅明富,崔山佳,張金鈴.新鮮組織肥大細(xì)胞快速染色方法的探討與應(yīng)用[J] .中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2010,19(1):108-109

[11]羅明富,李翠紅,張棟,等.青鵬膏劑穴位貼敷裸鼠穴區(qū)對皮膚內(nèi)血管和肥大細(xì)胞的影響[J].中國中藥雜志,2008,33(7):816-818

(2016-08-06 收稿)

Effect of Acupoint Application withQingpengPasteon Mast Cells Numbers and Degranulation Hebei Key Lab of TCM Research and Development, Institute of Chinese Materia Medica of Chengde Medical College

ANNaQUJing-yangLIUDing-dingYANGZhi-xin

(Chengde 067000)

Objective: to observe the distribution and number of mast cells and the degranulation after the acupoint application withQingpengPaste,tounderstandtheeffectoftheapplicationtherapyandtoexploreitspossibilitymechanism.Methods: 30healthyWistarratswererandomlydividedintocontrolgroup(GroupA),electroacupuncturegroup(GroupB)andapplicationgroup(GroupC).GroupBandCweregivenapplicationorelectroacupuncturefor7daysbeforetheskinpiecesaroundDazhui(GV14)ofthethreegroupsweretakenforcryosections,thenferrouscopperchloridemethodwasusedtoshowAcCHE(acetylcholineesterase)andaftertoluidinebluecounterstaining,compareMCsdistributions,numbersanddegranulationsbetweeneachgroup,andresearchthemorphologicalchangesofMCsinacupointareas.Results:MCsofdifferentsizesandnumbersweredistributedindermis,hypodermisandmuscletissuesofDazhuiarea,mostextensivelyinhypodermisalongnervesorvessels.ComparedwithGroupA,localMCsnumberanddegranulationrateofGroupCwereincreasedwithsignificantdifference(P<0.05).Conclusion:acupointapplicationwithQingpengPastecanincreaseMCsnumberanddegranulation,promotetheaggregationofMCs,whichisoneofthepossibilityfactorsofapplication,meridiananddrugssynergy.

QingpengPaste;acupointapplication;MCs(mastcells);degranulation;electroacupuncture;Dazhui(GV14)

*河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目：No.H2014406047；河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目：No.ZD20131001

楊志新，女，教授，醫(yī)學(xué)博士，博士研究生導(dǎo)師。

R

A

1007-5615(2017)01-0006-03

△ 華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院(唐山063000)

△△ 承德醫(yī)學(xué)院中醫(yī)學(xué)院(承德067000)