AMPK、NF-κB、COX-2及PGE2在非小細胞肺癌中的表達*

李韶今，張相民，劉聯(lián)斌，曾汶，李榮，梁婷，王冬梅，周茂華

（贛南醫(yī)學院附屬腫瘤醫(yī)院 腫瘤防治研究所，江西 贛州 341000）

臨床研究·論著

AMPK、NF-κB、COX-2及PGE2在非小細胞肺癌中的表達*

李韶今，張相民，劉聯(lián)斌，曾汶，李榮，梁婷，王冬梅，周茂華

（贛南醫(yī)學院附屬腫瘤醫(yī)院 腫瘤防治研究所，江西 贛州 341000）

D O I：10.3969/j.i s s n.1005-8982.2017.03.010

目的探討腺苷酸活化蛋白激酶（AM PK）、核因子κB（N F-κB）、環(huán)氧合酶2（C O X-2）及前列腺素E2（PG E2）在非小細胞肺癌（N SC LC）中的表達及其關系。方法采用免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法檢測N SC LC和正常肺組織標本中可以直接反映AM PK激活狀態(tài)的乙酰輔酶A羧化酶磷酸化后的產物（P-AC C）、N F-κB、C O X-2的表達，實時熒光定量聚合酶鏈反應（qR T-PC R）和W es t ern bl ot檢測N SC LC標本及血液、正常肺組織標本及血液中AM PK、C O X-2及PG E2受體的表達。結果免疫組織化學法檢測發(fā)現(xiàn)，P-AC C在N SC LC中低表達，N F-κB和C O X-2在N SC LC中高表達，其陽性率分別為33.9%、75.8%和66.1%，且與正常肺組織中的表達差異有統(tǒng)計學意義；qR T-PC R和W es t ern bl ot檢測發(fā)現(xiàn)，在N SC LC標本及血液中，AM PK m R N A表達降低，C O X-2和PG E2受體m R N A表達升高。結論在N SC LC中，AM PK低表達，N F-κB、C O X-2及PG E2高表達，其相互作用可能在N SC LC的增殖、凋亡耐受、侵襲及轉移過程中占據(jù)重要位置，其表達情況為臨床治療N SC LC提供新的思路。

非小細胞肺癌；聚合酶鏈反應；P-AC C；核因子κB；環(huán)氧合酶2

非小細胞肺癌（non-sm al l-cel l l ung cancer，NSCLC）的發(fā)病機制是包含基因突變的復雜過程，基因突變導致細胞凋亡受阻、增殖失控、轉移侵襲、血管生成等惡性行為[1-3]。表皮細胞向間葉細胞化生是癌變的一個重要過程，其發(fā)生是由于人體內解除控制的炎癥反應，從而導致細胞免疫的削弱和惡性腫瘤的發(fā)生[4-8]。大量失控的炎癥反應使機體罹患NSCLC的風險大大增加[9-11]。

炎癥相關基因腺苷酸活化蛋白激酶（AM P-act ivat ed prot ei n ki nase，AM PK）、核因子κB（nucl ear f act orκB，NF-κB）、環(huán)氧合酶 2（cycl ooxygenase，COX-2）及前列腺素E2（prost agl andi n E2，PGE2）在慢性炎癥啟動致癌信號通路過程中具有重要作用，且可以相互作用，共同促進腫瘤的增殖、凋亡及轉移過程[12]。本研究初步探討AM PK、NF-κB、COX-2及PGE2在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中的作用，可望為進一步闡明NSCLC發(fā)生、發(fā)展的分子生物學機制，為相關疾病的臨床診斷、治療、預后提供理論與實驗依據(jù)，為NSCLC的三級預防提供新的視角。

1 資料與方法

1.1 病例資料

選取2008年1月1日-2010年12月31日在贛南醫(yī)學院附屬腫瘤醫(yī)院就診，有完整臨床病理資料，病理檢查證實為NSCLC的62例患者作為NSCLC組；同時選取20例因其他原因行肺葉切除患者作為正常組。NSCLC組，男性48例，女性14例；年齡21～69歲，平均55.65歲，中位年齡58.00歲；其中鱗癌33例，腺癌16例，腺鱗癌8例，大細胞癌2例，類癌1例，淋巴上皮樣癌1例，原位癌1例。選取2015年1月-2015年10月在贛南醫(yī)學院附屬腫瘤醫(yī)院就診的肺部疾病患者30例作為實驗組，男性25例，女性5例；年齡38～80歲，平均59.43歲，中位年齡60歲；其中21例鱗癌，8例腺癌，1例大細胞癌。對照組11例因其他原因行肺葉切除術的患者。NSCLC組和正常組作為免疫組織化學法標本，取實驗組和對照組的新鮮組織及血液標本做實時熒光定量聚合酶鏈反應（quant i t at i ve real-t i m e pol ym erase chai n react i on，qRT-PCR）和W est ern bl ot檢測。

1.2 主要試劑

改良伊格爾培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gbi co公司，多克隆抗體AM PK、乙酰輔酶A羧化酶磷酸化后的產物（acet yl-coa carboxyl ase product of phosphoryl at i on，P-ACC）抗體、COX-2抗體、前列腺素E2受體（prost agl andi n E recept or 2，EP2）抗體購自美國 Cel l Si gnal i ng Technol ogy公司，NF-κB（美國Sant a Cruz公司），二抗（美國Sant a Cruz公司），Tri zol（美國 Invi t rogen公司），二喹啉甲酸（bi ci nchoni ni c aci d，BCA）蛋白定量試劑盒（美國H ycl one公司），qRT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），增強化學發(fā)光法（enhanced chem i l um i nescence，ECL）試劑盒（瑞典Am ersham公司），qRT-PCR儀器（日本TaKaRa公司）。

1.3 免疫組織化學法檢測 P-ACC、NF-κB、COX-2的表達

免疫組織化學法主要參照免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白 -過氧化物酶連接法（st rept avi di n-perosi dase，SP）檢測試劑盒說明書進行操作，主要步驟為：標本用10%福爾馬林固定、脫水，石蠟包埋，高壓抗原修復、內源性過氧化物酶滅活、封閉，一抗孵育、二抗孵育、二氨基聯(lián)苯氨顯色，蘇木精復染、脫水、透明，封片、鏡檢。

1.4 免疫組織化學法結果判定

由2位高年資病理醫(yī)師雙盲評判。在400倍視野下，每例隨機選取不重復5個視野，然后按陽性細胞占全部細胞的百分率分為：表達陰性（-），即無陽性細胞或僅有個別細胞；表達弱陽性（+），即陽性細胞數(shù)為10%～25%；表達中度陽性（++），即陽性細胞數(shù)為25%～50%；表達強陽性（+++），即陽性細胞數(shù)≥50%。

1.5qRT-PCR檢測P-ACC、NF-κB、COX-2及PGE2受體mRNA的表達

引物根據(jù)Prem er pri m er 5.0設計，由上海吉凱基因化學技術有限公司合成。采用Tri zol法提取組織和血液總RNA，根據(jù)日本TaKaRa公司M-M LV逆轉錄試劑盒步驟逆轉錄合成cDNA，置入-20℃冰箱冷凍保存。Super Peal PreM i x（SYBR Green）作為熒光指示劑進行PCR擴增反應，PCR反應體系共50μl，SYBR Green 25 μl，cDNA模板2 μl，正、反向引物各1μl，ddH2O 20μl。反應條件：95℃預變性15m i n，95℃變性10 s，63℃退火20 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（gl yceral dehyde-3-phosphat e dehydrogenase，GAPDH）作為內參照。采用Li vak（2-△△Ct）法分析基因的相對表達差異，每個樣本每個基因進行3個復孔平行實驗?！鳌鰿t=實驗組（Ct目的基因-CtGAPDH）-對照組（Ct目的基因-CtGAPDH）。見表1。

表1 PCR引物序列

1.6 Western blot檢測P-ACC、NF-κB、COX-2及PGE2受體蛋白的表達

用蛋白裂解酶裂解組織或血液中蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定各組樣品蛋白總蛋白濃度。提取總蛋白，定量，按比例加上樣緩沖液，混勻，95℃變性10 m i n，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉移至聚偏二氟乙烯膜（pol yvi nyl i dene f l uori de，PVDF）上，5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，然后將PVDF膜分別與一抗APM K（1∶1 000）、COX-2（1∶1 000）、PGE2（1∶1 000）孵育，4℃過夜。TBST洗滌3次，每次10 m i n。加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室孵育2 h。ECL試劑盒顯色，凝膠成像儀顯相。實驗以β-act i n為內參照，采用Im age J軟件分析各組蛋白表達條帶的灰度值，該灰度值減去對應背景灰度值后得到該蛋白表達的灰度值，再除以內參GAPDH的灰度值即為該蛋白表達的含量水平。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，用獨立樣本t檢驗，等級資料用等級表示，計數(shù)資料以百分率（%）表示，用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 P-ACC在NSCLC中的表達

免疫組織化學法檢測發(fā)現(xiàn)，P-ACC在正常肺組織中陽性表達率為80%，且著色較強，均為（++）或（+++），而在NSCLC中陽性表達率為33.9%，經χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=21.971，P=0.000），NSCLC組織低于正常肺組織。P-ACC是AM PK的下游直接靶蛋白，可以直接反映AM PK的激活狀態(tài)，因此在NSCLC組織中，AM PK m RNA和蛋白的表達低于正常肺組織，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.045），見表2和圖1～3。

表2 兩組P-ACC蛋白的表達比較

圖1 正常肺組織及NSCLC組織中P-ACC蛋白表達（SP×400）

圖2 不同樣本中AMPK、COX-2、EP2蛋白表達

圖3 qRT-RCR檢測AMPK mRNA的表達 （±s）

2.2NF-κB在NSCLC中的表達

NF-κB在正常肺組織中陽性表達率為15%，而在NSCLC中陽性表達率為75.8%，經χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=23.608，P=0.000），NSCLC組織高于正常肺組織。見表3和圖4。

2.3COX-2在NSCLC中的表達

COX-2在正常肺組織中陽性表達率為20.0%，而在NSCLC組織中陽性表達率為66.1%，經χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=12.836，P=0.004），NSCLC組織高于正常肺組織。在NSCLC組織中，COX-2 m RNA和蛋白的表達高于正常肺組織，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.007）；在NSCLC組與正常組的血清中，COX-2 m RNA和蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義（P= 0.032），見表4和圖2、5、6。

表3 NF-ΚB蛋白的表達比較

圖4 正常肺組織及NSCLC組織中NF-κB蛋白表達（SP×400）

表4 COX-2蛋白的表達比較

圖5 正常肺組織及NSCLC組織中COX-2蛋白表達（SP×400）

2.4PGE2在NSCLC中的表達

在NSCLC組織中，PGE2受體m RNA和蛋白的表達高于正常肺組織，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.028）；在NSCLC組與正常組的血清中，PGE2 m RNA和蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義（P=0.004）。見圖2、7。

圖6 qRT-RCR檢測COX-2 mRNA的表達 （±s）

圖7 qRT-RCR檢測EP2 mRNA的表達 （±s）

3 討論

P-ACC是腺苷酸活化蛋白激酶被激活后，乙酰輔酶A羧化酶磷酸化失活而形成的，P-ACC是AM PK的下游直接靶蛋白，可以直接反映AM PK的激活狀態(tài)[13]。AM PK激活后可顯著減輕機體炎癥介質的表達，減少組織的炎癥損傷。STEINBERG等[14]研究發(fā)現(xiàn)，AM PK的活性可以被腫瘤壞死因子α上調蛋白磷酸酶2C的表達抑制。另有學者觀察到，抗炎細胞因子白細胞介素10和轉化生長因子β可提高老鼠和人類的巨噬細胞中AM PK的活性，而脂多糖則降低AM PK的活性[15]。該研究說明，AM PK的活性可以調節(jié)炎癥反應，AM PK的失活促進炎癥的發(fā)展。

NF-κB是一種重要的轉錄因子蛋白，參與多個基因表達的調節(jié)。NF-κB是在B細胞免疫球蛋白的κ輕鏈上被發(fā)現(xiàn)，對細胞的生長、黏附、炎癥反應和分化具有重要作用，當細胞受到炎癥因子、免疫相關因子和腫瘤壞死因子等多種信號刺激時，NF-κB被激活，其與調控DNA上的κB序列相結合后能夠啟動下游與腫瘤形成及轉移相關的基因轉錄，在腫瘤增殖、侵襲、轉移過程中發(fā)揮重要作用[16-17]。NF-κB是促炎反應的關鍵分子，能夠調節(jié)各種細胞因子及趨化因子的表達及功能，激活上皮細胞生長，促進腫瘤細胞惡性轉化。

COX-2在肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用。COX-2能夠通過抑制凋亡通路，促進血管生成、腫瘤侵襲轉移等途徑促進NSCLC的發(fā)生、發(fā)展。通過在細胞系中對比分析COX-2與凋亡相關基因表達的相關性發(fā)現(xiàn)，COX-2能通過降低凋亡相關基因Bcl-2的表達，以及促進其磷酸化，抑制肺癌細胞凋亡，且可促進survi vi n蛋白泛素化，促進肺癌細胞產生凋亡耐受[18]。此外，COX-2與肺癌的侵襲及轉移具有相關性，上調肺癌細胞系COX-2的表達后，基質金屬蛋白酶7（m at ri x m et al l oprot ei nase，M M P-7）及遷移誘導蛋白7等轉移及遷移相關基因表達增高，促進肺癌細胞侵襲及轉移[19]。

PGE2為啟動腫瘤致癌信號通路的重要基因，在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B、蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶、細胞外信號調節(jié)激酶等信號通路是促進肺癌細胞增殖、凋亡、轉移的關鍵通路，而PGE2能夠活化磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B、c-Jun氨基末端激酶、細胞外信號調節(jié)激酶信號通路，刺激肺癌細胞生長[20]。肺癌的侵襲及轉移是多個基因改變的結果，PGE2能夠調節(jié)M M P-2和上皮細胞鈣黏蛋白的表達，促進肺癌細胞的侵襲及轉移[21]。PGE2在NSCLC和炎癥細胞上表達增高，可使c-M yc表達上調，促進腫瘤細胞產生凋亡耐受，使腫瘤細胞存活[22]。

炎癥相關基因AM PK、NF-κB、COX-2及PGE2在慢性炎癥啟動致癌信號通路過程中具有重要作用，且可以相互作用，共同促進腫瘤的增殖、凋亡及轉移過程[23]。本研究結果顯示，P-ACC在NSCLC中低表達，NF-κB和COX-2在NSCLC中高表達，q RT-RCR和W est ern bl ot檢測也發(fā)現(xiàn)，AM PK m RNA表達降低，COX-2和PGE2 m RNA表達升高。其相互作用可能在NSCLC的增殖、凋亡耐受、侵襲及轉移過程中占據(jù)重要位置，其表達情況為臨床治療NSCLC提供新的思路。

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（童穎丹 編輯）

Expressions of AMPK,NF-κB,COX-2 and PGE2 in non-small cell lung cancer*

Shao-jin Li,Xiang-min Zhang,Lian-bin Liu,Wen Zeng,Rong Li, Ting Liang,Dong-mei Wang,Mao-hua Zhou
(Institute of Cancer Research,the Affiliated Tumor Hospital of Gannan Medical University, Ganzhou,Jiangxi 341000,China)

ObjectiveTo discuss the expressions and relations of AMP-activated protein kinase(AMPK), nuclear factor-κB(NF-κB),cyclooxygenase 2(COX-2)and prostaglandin E2(PGE2)in non-small cell lung cancer (NSCLC).MethodsThe expressions of phosphorylation product of acetyl coenzyme A carboxylase (PACC,which could directly reflect active AMPK),NF-κB and COX-2 in NSCLC and normal lung tissue specimens were detected by immunohistochemical SP method.The expressions of AMPK,COX-2 and EP2 in NSCLC,normal lung tissues and blood specimens were detected by qRT-PCR and Western blot.The SPSS 22.0 software package was used for statistical analysis.ResultsThe positive expression rate of P-ACC in the NSCLC specimens was 33.9%which was significantly lower than that in the normal lung tissue;while the positive expression rates of NF-ΚB and COX-2 in the NSCLC specimens were 75.8%and 66.1%respectively, which were significantly higher than those in the normal lung tissue.The expression of AMPK mRNA was reduced,while the expressions of COX-2 mRNA and PGE2 mRNA increased in the NSCLC specimens and blood,there were significant differences.ConclusionsLow-expression of AMPK and high-expressions of NF-κB, COX-2 and EP2 in NSCLC may play important roles in NSCLC proliferation,apoptosis tolerance,invasionand metastasis.These different expressions provide a new idea for clinical treatment of NSCLC.

non-small cell lung cancer;AMP-activated protein kinase;phosphorylation product of acetyl coenzyme A carboxylase;nuclear factor κB;cyclooxygenase 2

1005-8982（2017）03-0053-06

R 734.2

A

2016-08-18

國家自然科學基金（No：81441069）