超臨界CO2萃取銀杏葉中總黃酮醇苷的夾帶劑工藝條件

劉雯，李素娟，馬丹鳳3

（1.湖北省武漢市普愛醫(yī)院 藥劑科，湖北 武漢 430032；2.湖北省武漢市東西湖區(qū)人民醫(yī)院 藥劑科，湖北 武漢 430040；3.湖南省兒童醫(yī)院 藥劑科，湖南 長沙 410007）

論著

超臨界CO2萃取銀杏葉中總黃酮醇苷的夾帶劑工藝條件

劉雯1，李素娟2，馬丹鳳3

（1.湖北省武漢市普愛醫(yī)院 藥劑科，湖北 武漢 430032；2.湖北省武漢市東西湖區(qū)人民醫(yī)院 藥劑科，湖北 武漢 430040；3.湖南省兒童醫(yī)院 藥劑科，湖南 長沙 410007）

D O I：10.3969/j.i s s n.1005-8982.2017.03.008

目的探討夾帶劑在超臨界二氧化碳C O2中萃取銀杏葉總黃酮醇苷的工藝條件。方法以夾帶劑加入方式、夾帶劑種類、夾帶劑加入量及夾帶劑流速為考察因素，總黃酮醇苷的提取率作為考察指標(biāo)，用L9（34）正交表優(yōu)化工藝條件，高效液相色譜法測定總黃酮醇苷含量。結(jié)果夾帶方式選擇預(yù)浸+動(dòng)態(tài)萃取模式，以95%乙醇作為夾帶劑，加入量300m l，加入流速10m l/m i n。在上述條件進(jìn)行超臨界萃取時(shí)，總黃酮苷醇提取率可達(dá)5.03%：萃取壓力20 M Pa，萃取溫度60℃，出口溫度70℃，用95%乙醇液態(tài)收集萃取物，動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間1 h。結(jié)論該實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的工藝明顯提高超臨界C O2萃取銀杏葉中總黃酮醇苷的提取效率。

夾帶劑；超臨界C O2萃??；總黃酮醇苷；正交實(shí)驗(yàn)

銀杏葉為銀杏科植物銀杏的干燥葉，其藥用價(jià)值很高。銀杏葉中含有黃酮苷類化合物、萜類內(nèi)酯化合物及少量多酚類、酮類、生物堿等成分[1]。其藥理作用包含對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)和對(duì)心血管系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[2]。采用超臨界二氧化碳CO2萃取銀杏葉中黃酮類化合物，在超臨界流體中加入部分夾帶劑，極大地增加提取效率[3-5]。曾琦華等[6]研究表明，夾帶劑的選擇對(duì)超臨界CO2萃取銀杏葉中黃酮類化合物有著重要影響。張玉祥等[7]研究得出，銀杏內(nèi)酯類受夾帶劑影響不大，而黃酮類化合物需要更多夾帶劑的結(jié)論。本文研究不同的夾帶劑加入種類及加入方式下進(jìn)行超臨界CO2萃取銀杏葉中黃酮類化合物，并對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行正交優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

銀杏葉購自本地藥材市場，槲皮素（批號(hào)：100081-200907）、山柰素（批號(hào)：110861-201310）、異鼠李素（批號(hào)：110860-201410）均購自中國食品藥品檢定研究院，甲醇為色譜純，乙醇、磷酸為分析純。Spe-ed SFC超臨界萃取儀（美國Appl i ed Separat i ons有限公司），Ul t i M at e 3000液相色譜儀（美國賽默飛科技有限公司），AUW 220D分析天平（日本島津科技有限公司）。

1.2 夾帶劑單因素考察

銀杏葉粉碎過20目篩，30℃減壓干燥2 h，每次稱取50 g置于萃取釜中。參考張玉祥[7]和孫婷[8]的研究，選擇固定萃取壓力20 M Pa，萃取溫度60℃，出口溫度70℃，95%乙醇液態(tài)收集萃取物，動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間1 h。分別對(duì)夾帶劑加入方式、夾帶劑種類、夾帶劑加入量及夾帶劑流速進(jìn)行考察。

1.2.1 夾帶劑加入方式 選取95%乙醇作為夾帶劑，添加量100m l，動(dòng)態(tài)萃取時(shí)加入流速為10m l/m i n。添加方式：①預(yù)浸。萃取前將100m l夾帶劑全部加入萃取釜中，浸泡12 h后進(jìn)行動(dòng)態(tài)萃取。②預(yù)浸+動(dòng)態(tài)萃取。萃取前將50 m l夾帶劑加入萃取釜中，浸泡12h后進(jìn)行動(dòng)態(tài)萃取，剩余50 m l夾帶劑通過泵在動(dòng)態(tài)萃取開始時(shí)按照加入流速加入。③預(yù)浸-靜態(tài)萃取+動(dòng)態(tài)萃取。萃取前將50 m l夾帶劑加入萃取釜中，浸泡12 h后先按照萃取條件靜態(tài)萃取1 h，剩余50 m l夾帶劑通過泵在靜態(tài)萃取完成后動(dòng)態(tài)萃取開始時(shí)按照加入流速加入。

1.2.2 夾帶劑種類 采取預(yù)浸+動(dòng)態(tài)萃取，夾帶劑添加量100m l，動(dòng)態(tài)萃取時(shí)加入流速為10m l/m i n。夾帶劑選擇無水乙醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇進(jìn)行萃取。

1.2.3 夾帶劑加入量 采取預(yù)浸+動(dòng)態(tài)萃取，選取95%乙醇作為夾帶劑，動(dòng)態(tài)萃取時(shí)加入流速為10m l/m i n。分別選擇100、200、300和400 m l夾帶劑進(jìn)行萃取，預(yù)浸夾帶劑量均為50 m l。

1.2.4 夾帶劑流速 采取預(yù)浸+動(dòng)態(tài)萃取，選取95%乙醇作為夾帶劑添加100m l。夾帶劑流速設(shè)定5、10、15和20 m l/m i n。

1.3 夾帶劑的正交優(yōu)化

為全面考察夾帶劑在超臨界CO2萃取銀杏葉黃酮類化合物中的影響，在單因素的基礎(chǔ)上采用L9（34）的正交設(shè)計(jì)，進(jìn)行各因素之間協(xié)同作用的考察。取銀杏葉原料50 g，萃取壓力20 M Pa，萃取溫度60℃，出口溫度70℃，95%乙醇液態(tài)收集萃取物，以夾帶劑加入方式、夾帶劑種類、夾帶劑加入量及夾帶劑流速作為考察因素，以總黃酮醇苷的提取率為考察指標(biāo)，確定夾帶劑的最佳工藝條件。見表1。

表1 L9（34）因素水平表

1.4 分析方法

1.4.1 總黃酮醇苷的測定方法 采用高效液相色譜法（hi gh perf orm ance l i qui d chrom at ography，H PLC）[9]。選取Therm o C18填充柱，以甲醇-0.1%磷酸溶液（50∶50）為流動(dòng)相，檢測波長為360 nm。

1.4.2 對(duì)照品溶液制備 分別取槲皮素對(duì)照品12.52 m g、山柰素對(duì)照品12.60 m g、異鼠李素對(duì)照品8.33 m g，置于250 m l量瓶中，加甲醇稀釋并定容刻度，制成對(duì)照品混合溶液。

1.4.3 線性考察 吸取混合溶液進(jìn)樣，依次進(jìn)樣3、6、9、12、18μl，采用上述色譜方法測定，以各自色譜峰面積-濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各自的回歸方程。見表2。

表2 回歸方程

1.4.4 樣品含量測定 將收集的銀杏葉萃取液用95%乙醇定容至100 m l，取10 m l提取液揮干，殘?jiān)蛹状既芙廪D(zhuǎn)移至50 m l量瓶，加甲醇至刻度，作為供試品溶液。溶液過0.22μm濾膜進(jìn)行H PLC分析。進(jìn)樣量10μl，記錄色譜峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮醇苷含量，按下列公式計(jì)算總黃酮醇苷的提取率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 萃取劑單因素試驗(yàn)

選擇預(yù)浸+動(dòng)態(tài)萃取的萃取方式提取率（4.891%）高于預(yù)浸-靜態(tài)萃取+動(dòng)態(tài)萃取（4.727%），并遠(yuǎn)高于僅預(yù)浸的萃取方式（3.005%）。95%的乙醇作為夾帶劑提取率（4.905%）高于其他3種夾帶劑的水平。夾帶劑的加入量從100～400 m l、流速從5～20 m l/m i n對(duì)提取率的影響不大，基本維持在同一水平。見表3、4和圖1～4。

表3 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 萃取銀杏葉中總黃酮醇苷工藝條件的方差分析

圖1 夾帶劑加入方式的影響

圖2 夾帶劑種類的影響

圖3 夾帶劑加入量的影響

圖4 夾帶劑加入流速的影響

2.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

夾帶劑條件正交試驗(yàn)各因素對(duì)總黃酮醇苷提取率影響的由大到小依次為A、B、C、D，其最佳組合條件為A2B2C3D3，最優(yōu)條件下提取率達(dá)4.914%。

3 討論

3.1 夾帶劑加入方式的影響

萃取方式Ⅱ：預(yù)浸+動(dòng)態(tài)萃取總黃酮醇苷的提取率最高。因?yàn)闃悠吩谳^多的乙醇溶液中預(yù)浸，待萃取成分處于更加液態(tài)的環(huán)境中，使超臨界流體CO2的擴(kuò)散阻力較大，在萃取中傳質(zhì)效果不好，進(jìn)而影響整個(gè)萃取效率。而采用較少的乙醇溶液進(jìn)行預(yù)浸，在動(dòng)態(tài)萃取中不斷加入新鮮的夾帶劑，使整體萃取環(huán)境更加順暢，傳質(zhì)速度也得到較大提高，從而使整個(gè)萃取過程更加順利，提高萃取效率。萃取方式Ⅲ是在預(yù)浸完成后先靜態(tài)萃取，萃取效果相對(duì)于方式Ⅱ略微降低，這是因?yàn)轭A(yù)浸狀態(tài)下乙醇溶液對(duì)樣品起到溶脹作用，再進(jìn)行靜態(tài)萃取并沒有對(duì)整個(gè)過程產(chǎn)生太大影響，而且靜態(tài)萃取拉長整個(gè)萃取時(shí)間，樣品在高壓環(huán)境下有效成分有所損失，所以萃取效率有所下降。

3.2 夾帶劑種類的影響

95%乙醇作為夾帶劑總黃酮醇苷的提取率最高。這是因?yàn)樵贑O2-乙醇-水的三元體系中，乙醇相對(duì)于水更易溶于CO2中，乙醇溶液的含水量越少，其在超臨界體系中的溶解性越高，傳質(zhì)過程更為順暢，提取率越高。而95%乙醇與無水乙醇比較，含水量相差不大，而在預(yù)浸的過程中，95%乙醇對(duì)基質(zhì)的溶脹效果更明顯，所以其提取率也更高。

3.3 夾帶劑加入量的影響

300 m l夾帶劑用量下總黃酮醇苷的提取率最高。這是因?yàn)閵A帶劑能夠增加超臨界CO2的溶解能力及選擇性，使待萃取物質(zhì)更易被萃取出來。而隨著夾帶劑的進(jìn)一步增多，提取率未得到提升，這說明夾帶劑的加入要適量，夾帶劑過多會(huì)使萃取環(huán)境呈液態(tài)，不利于萃取進(jìn)行，而且會(huì)產(chǎn)生更多的殘留溶劑。

3.4 夾帶劑流速的影響

10m l/m i n流速下總黃酮醇苷的提取率最高。這是因?yàn)殡S著流速的增加，處于待萃取物質(zhì)分子周圍的夾帶劑濃度增強(qiáng)，其傳質(zhì)過程更加迅速，而隨著流速的進(jìn)一步增加，會(huì)使得夾帶劑分子不能完全有序地排列到基質(zhì)的周圍，導(dǎo)致整體夾帶劑濃度增加而局部夾帶劑濃度呈減少的趨勢，從而使萃取效率在逐漸減弱。

3.5 正交優(yōu)化

夾帶劑條件正交試驗(yàn)各因素對(duì)總黃酮醇苷提取率影響的由大到小依次為A、B、C、D，其最佳組合條件為A2B2C3D3。夾帶劑加入方式對(duì)總黃酮醇苷提取有影響，而夾帶劑的種類也有影響。由于各單因素最佳實(shí)驗(yàn)條件并不在正交表中，按照單因素最佳條件與正交表中最佳條件分別進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，總黃酮醇苷提取率分別為（5.03±0.07）%和（4.97±0.05）%，故夾帶劑最佳條件選擇為預(yù)浸+動(dòng)態(tài)萃取。

本實(shí)驗(yàn)研究夾帶劑在超臨界CO2中萃取銀杏葉總黃酮醇苷的工藝條件，以總黃酮醇苷的提取率作為考察指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)對(duì)夾帶劑加入方式、夾帶劑種類、夾帶劑加入量及夾帶劑加入流速進(jìn)行考察，采用正交試驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化，確定夾帶劑最佳工藝條件。結(jié)果表明，采用預(yù)浸+動(dòng)態(tài)萃取模式，選取95%乙醇作為夾帶劑，加入量300m l，加入流速10m l/m i n，在萃取壓力20M Pa，萃取溫度60℃，出口溫度70℃，95%乙醇液態(tài)收集萃取物，動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間1 h的條件下進(jìn)行超臨界萃取，總黃酮醇苷提取率高達(dá)5.03%。對(duì)比國內(nèi)目前對(duì)超臨界CO2萃取銀杏葉中總黃酮醇苷研究，明顯高于張玉祥等[7]的4.16%，并且為超臨界CO2萃取夾帶劑的加入方式提出一個(gè)全新的思維方法，為進(jìn)一步拓展超臨界CO2萃取的應(yīng)用范圍提供依據(jù)。

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（童穎丹 編輯）

Process condition of entrainer in extracting total favonol glycosides fromGinkgoleaves by supercritical CO2

Wen Liu1,Su-juan Li2,Dan-feng Ma3
(1.Department of Pharmacy,Wuhan Pu'ai Hospital,Wuhan,Hubei 430032,China; 2.Department of Pharmacy,the People's Hospital of East and West Lake District, Wuhan,Hubei 430040,China;3.Department of Pharmacy,Hunan Children's Hospital,Changsha,Hunan 410007,China)

ObjectiveTo research the process condition of entrainer in extracting total favonol glycosides from Ginkgo leavesby supercriticalCO2.MethodsThe optimum extraction technology condition was investigated by orthogonal experiment[L9(34)]with extraction rate of total favonol glycosides as the evaluation index,and with the addition way,kind,amount and flow rate of entrainer as investigation factors.The content of total favonol glycosides was determined by high performance liquid chromatography (HPLC).ResultsThe adding way of entrainer is the presoak treatment plus dynamic extraction type,the entrainer was 95%alcohol, with 300 ml infusing volume and 10 ml/min flowing rate.The best factors of supercritical fluid extraction were as follows:extraction pressure 20 MPa,extraction temperature 60℃,outlet temperature 70℃,collecting extracts with 95%alcohol,dynamic extraction time 1 h.Under the processing conditions,the extraction rate of total favonol glycosides was 5.03%.ConclusionsSupercritical CO2extraction with the optimized process significantly improves the extraction of total flavonol glycosides fromGinkgoleaves.

entrainer;supercritical CO2extraction;total favonol glycosides;orthogonal experiment

1005-8982（2017）03-0041-04

R 284

A

2016-03-09