MicroRNA-222對肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

盧濱，賈金廣，李利華，姚菲菲

（河南省鄭州人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，河南 鄭州 450003）

MicroRNA-222對肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

盧濱，賈金廣，李利華，姚菲菲

（河南省鄭州人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，河南 鄭州 450003）

D O I：10.3969/j.i s s n.1005-8982.2017.03.007

目的探討m i croR N A-222（m i R-222）對肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。方法將m i R-222和對照分別轉(zhuǎn)染入肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)法試劑盒（C C K-8）增殖實(shí)驗(yàn)、Trans w el l遷移及M at ri gel侵襲實(shí)驗(yàn)，觀察m i R-222對肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。運(yùn)用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qR T-PC R）及W es t ern bl ot驗(yàn)證m i R-222靶向下調(diào)ETS1的過程。結(jié)果C C K-8增殖實(shí)驗(yàn)，Trans w el l遷移及M at ri gel侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對照組相比m i R-222能夠促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、qR T-PC R及W es t ern bl ot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，m i R-222可以靶向下調(diào)ETS1的表達(dá)，且ETS1參與調(diào)節(jié)上述過程。結(jié)論m i R-222通過靶向下調(diào)ETS1，促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

m i croR N A-222；ETS1；增殖；遷移；侵襲

肺腺癌為肺癌的一種，屬于病理分型中非小細(xì)胞肺癌。在全世界范圍內(nèi)有很高的發(fā)病率，其中包括中國，且肺腺癌惡性程度高，5年生存率約為15%[1-2]。腺癌初發(fā)時多位于肺周邊部，界限清楚，但具有高度浸潤和破壞性生長特征，容易侵犯血管和淋巴管壁，而出現(xiàn)較多的血行及淋巴轉(zhuǎn)移[3]。肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，包括細(xì)胞的異常增殖、表觀遺傳學(xué)的改變、癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移等過程[4-5]。最近關(guān)于m icroRNAs（m i RNAs）在肺腺癌發(fā)生過程中發(fā)揮的作用受到廣泛關(guān)注，尤其在細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和對化療藥物的抵抗方面發(fā)揮的作用研究較多。許多m i RNAs在肺癌組織、患者血清中表達(dá)水平發(fā)生改變，但關(guān)于其在肺腺癌中的作用研究得較少[6]。先前文獻(xiàn)報(bào)告m i R-222在許多腫瘤中高表達(dá)，比如膠質(zhì)細(xì)胞瘤、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌等[7-11]。功能學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，m i R-222通過靶向10號染色體上張力蛋白同源物缺失活化PI3K/AKT信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和微管形成[7]。另外，m i R-222可以作用于ETS1，間接促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶的表達(dá)水平[12]，而在黑色素瘤中m i R-222通過下調(diào)ETS1的表達(dá)促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[13]。為探索m i R-222在肺腺癌的發(fā)生過程中發(fā)揮的作用，本文通過過表達(dá)m i R-222，觀察該m i RNA對肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，并尋找參與該過程m i R-222的靶基因。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒

人肺腺癌細(xì)胞A549[14-15]和人胚腎上皮細(xì)胞293T細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，其中A549生長于含10%滅活胎牛血清（f et alcal fserum，F(xiàn)BS）、2m m ol/L L-谷氨酰胺、青霉素（100 U/m L）和鏈霉素（100 μg/m L）的RPM I 1640培養(yǎng)基中。293T細(xì)胞生長于10%FBS改良伊格爾培養(yǎng)基（dul becco's m odi f i ed eagl e m edi um，DM EM）中。

表達(dá)海腎熒光素酶的質(zhì)粒pRL-TK購自美國Prom ega公司。pGL3-cont rol報(bào)告質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)所有，在pGL3-cont rol蟲熒光素酶序列下游插入ETS1 3’-UTR序列的質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建，經(jīng)測序驗(yàn)證正確并命名為pGL3-ETS1 3’-UTR。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

Tri zol試劑、蛋白分子量M arker及轉(zhuǎn)染試劑Li pof ect am i neTM2000購自美國Invi t rogene公司，蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑及苯甲基磺酰氟購自上?？党缮锕荆笶TS1單克隆抗體、抗α-t ubul i n單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白G購自美國Sant a Cruz公司，活細(xì)胞計(jì)數(shù)法試劑盒（cel l count i ng ki t-8，CCK-8）購自日本同仁化學(xué)研究所，Transwel l小室（8μm）購于德國M i ll i pore公司，基質(zhì)膠購自美國BD Bi osci ences公司，M i R-222 m i m i c和陰性對照（negat i ve cont rol，NC）由上海吉瑪生物公司合成，定量引物由上海申能博彩生物公司合成。

1.3 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

將293T按2×104個/孔接種于48孔板中，加入0.2 m l DM EM培養(yǎng)基。次日將m i R-222和陰性對照分別與pGL3-Cont rol或pGL3-ETS1 3’-UTR及pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。48 h后收集細(xì)胞，運(yùn)用GLOM AX多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光素酶報(bào)告分析。

1.4 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測ETS1 mRNA的表達(dá)

于實(shí)驗(yàn)前1天將5×104A549鋪入6孔板中，次日細(xì)胞貼壁，細(xì)胞匯合度達(dá)60%～70%，按照Li pof ect am i neTM2000說明書操作，將m i R-222和陰性對照分別轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞，48 h后用Tri zol試劑收取細(xì)胞，提取RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按SYBRRPrem i x Ex TaqT（MTl i RNaseH Pl us）說明書建立反應(yīng)體系，運(yùn)用ABI7300進(jìn)行實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quant i t at i ve real-t i m e pol ym erase chai n react i on，qRT-PCR）實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5s，60℃退火31 s，共40次循環(huán)，獲得Ct值。獲得的Ct值按美國Appl i ed Bi osyst em公司ABI PRISM 7700 Sequence Det ect i on Syst em User Bul l et i n#2推薦方法進(jìn)行計(jì)算，并比較各樣本中目的基因的表達(dá)水平。引物序列：ETS1正向引物：5'-GTGGTGAGGC AAGGACCTAG-3'，反向引物：5'-TGAGTTGCCATCT CATCCCA-3'；β-act i n正向引物：5'-TTGCCGACAG GATGCAGAAGGA-3'，反向引物：5'-AGGTGGACAG CGAGGCCAGGAT-3'。

1.5 Western blot檢測

將m i R-222和NC分別轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞，48 h收取細(xì)胞蛋白進(jìn)行W est ern bl ot檢測。每孔加樣20μl，先恒壓60 V電泳30 m i n，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后再110V電泳90m i n，然后恒流80m A、100m i n將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏（二）氟乙烯膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%脫脂牛奶37℃封閉1 h，三羥基甲胺-鹽酸緩沖鹽溶液（Tri s-H Clbuf f er sal i ne，TBS）-T洗3次，5m i n/次，加入以抗體稀釋液1∶1 000配制的抗ETS1抗體4℃過夜，TBS-T洗3次，10 m i n/次，加入抗體稀釋液1∶4 000配制的辣根過氧化物酶（horseradi shperoxi dase，H RP）標(biāo)記山羊抗小鼠免疫球蛋白，37℃作用1 h，TBS-T洗3次，10 m i n/次，以化學(xué)發(fā)光法檢測。同時以抗體稀釋液1∶1 000配制的抗αt ubul i n為一抗，以抗體稀釋液1∶4 000配制的H RP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體為二抗，檢測α-Tubul i n作為參照。

1.6 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)

于實(shí)驗(yàn)前1天分別將m i R-222和NC分別轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞，次日用胰酶消化細(xì)胞以3 000個/孔細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1、2、3、4和5 d后，每孔加入10 μl CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)1h，以空白孔調(diào)零，波長450 nm下，用Bi ot eck DR-3506全自動酶標(biāo)讀數(shù)儀上測出每孔光密度（opt i cal densi t y，OD）值。

1.7 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)

于實(shí)驗(yàn)前1天，將m i R-222和NC分別轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞，第2天進(jìn)行Transwel l遷移實(shí)驗(yàn)。首先于24孔板中加入500μl 10%FBS 1640培養(yǎng)基，將Tran-swel l小室置于孔上，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱平衡30 m i n。然后將轉(zhuǎn)染有m i R-222和NC的細(xì)胞消化用純1640培養(yǎng)基配制成5×105個/m l的細(xì)胞懸液。每個小室加入200 μl細(xì)胞懸液，即每孔細(xì)胞約為1×105個。每組設(shè)置3個復(fù)孔，將24孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，分別于培養(yǎng)6和12 h后取出小室染色固定，顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)，觀察進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量以判斷細(xì)胞遷移情況。

1.8 Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)

將基質(zhì)膠和1640培養(yǎng)基按2∶1配成基質(zhì)膠-1640混合液，置于冰上備用。將Transwel l小室置于24孔板中，下室加入500μl10%FBS 1640培養(yǎng)基，每個小室加入60 μl基質(zhì)膠-1640混合液，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h。然后將轉(zhuǎn)染有m i R-222和NC的細(xì)胞消化用純1640培養(yǎng)基配制成5× 105個/m l的細(xì)胞懸液。每個小室加入200 μl細(xì)胞懸液，即每孔細(xì)胞約為1×105個，每組設(shè)置3個復(fù)孔。將24孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，分別于6和12 h取出小室染色固定，顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)，觀察進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量以判斷細(xì)胞侵襲情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，任意兩組間比較用LSD-t檢驗(yàn)，偏態(tài)數(shù)據(jù)則為秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)miR-222促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖

將m i R-222和NC分別轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞后1、2、3、4和5 d進(jìn)行CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：①轉(zhuǎn)染不同時間點(diǎn)間的細(xì)胞增殖比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.782，P=0.000）；②轉(zhuǎn)染m i R-222組和對照組的細(xì)胞增殖情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.128，P=0.000）；③轉(zhuǎn)染m i R-222組和對照組的細(xì)胞增殖的變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.781，P=0.000）。見表1和圖1。

表1 兩組過表達(dá)miR-222促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖的OD值（±s）

表1 兩組過表達(dá)miR-222促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖的OD值（±s）

組別5 d NC組 1.33±0.32 1.98±0.41 2.31±0.42 3.31±0.44 3.82±0.49 m i R-222組 1.41±0.41 2.21±0.39 2.89±0.40 4.25±0.47 5.01±0.53 4 d 1 d2 d 3 d

圖1 轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞后，過表達(dá)miR-222促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖 （±s）

2.2 過表達(dá)miR-222促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲

對轉(zhuǎn)染有m i R-222和NC的A549細(xì)胞分別進(jìn)行Transwel l遷移實(shí)驗(yàn)。NC組6和12 h遷移細(xì)胞數(shù)分別為（98±5）和（190±38）個；m i R-222組6和12 h遷移細(xì)胞數(shù)分別為（160±17）和（282±18）個，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：①轉(zhuǎn)染不同時間點(diǎn)的細(xì)胞遷移比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.182，P= 0.000）；②轉(zhuǎn)染m i R-222組和對照組的細(xì)胞遷移情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.122，P=0.000）；③轉(zhuǎn)染m i R-222組和對照組的細(xì)胞遷移變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.981，P=0.000）。見圖2A。

對轉(zhuǎn)染有m i R-222和NC的A549細(xì)胞分別進(jìn)行M at ri gel侵襲實(shí)驗(yàn)。NC組6和12 h侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（58±4）和（110±12）個；m i R-222組6和12 h侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（104±11）和（176±10）個，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：①轉(zhuǎn)染不同時間點(diǎn)的細(xì)胞侵襲比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.467， P=0.000）；②轉(zhuǎn)染m i R-222組和對照組的細(xì)胞侵襲情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.162，P=0.000）；③轉(zhuǎn)染m i R-222組和對照組的細(xì)胞侵襲變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.512，P=0.000）。提示過表達(dá)m i R-222促進(jìn)A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力。見圖2B。

圖2 過表達(dá)miR-222促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲 （±s）

2.3 miR-222靶向作用于ETS1

熒光素酶雙報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NC組轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染48 h后熒光素梅活性分別為（1.15±0.14）%和（1.13±0.07）%；m i R-222組分別為（1.14±0.16）%和（0.66±0.10）%。采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：①轉(zhuǎn)染不同時間點(diǎn)的細(xì)胞表達(dá)ETS1比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.131，P=0.007）；②轉(zhuǎn)染m i R-222組和對照組的細(xì)胞表達(dá)ETS1水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.012，P=0.003）；③轉(zhuǎn)染m i R-222組和對照組的細(xì)胞表達(dá)ETS1變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.631，P=0.010）。見圖3A。

圖3 miR-222靶向作用于ETS1（±s）

M i croRNA作用于靶基因的結(jié)果是抑制靶基因的表達(dá)水平，本實(shí)驗(yàn)將m i R-222、NC分別轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞，利用qRT-PCR反應(yīng)和W est ern bl ot檢測ETS1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，過表達(dá)m i R-222后ETS1 m RNA表達(dá)水平較對照下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 2.417，P=0.007）。W est ern bl ot檢測顯示，轉(zhuǎn)染m i R-222后與NC比較，ETS1的表達(dá)水平下調(diào)。見圖3B、4。

圖4 Western blot檢測ETS1蛋白表達(dá)水平

2.4 過表達(dá)ETS1抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖過程

為說明ETS1是否參與m i R-222促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖過程，筆者將ETS1質(zhì)粒及對照分別轉(zhuǎn)染入過表達(dá)NC和m i R-222的細(xì)胞中進(jìn)行CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：①過表達(dá)不同時間點(diǎn)的細(xì)胞增殖比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.411，P=0.012）；②轉(zhuǎn)染不同組的細(xì)胞增殖水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.578，P=0.006）；③轉(zhuǎn)染不同組的細(xì)胞增殖變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.821，P=0.005）。見表2和圖5。

2.5 過表達(dá)ETS1抑制肺腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲過程

為說明ETS1是否參與m i R-222促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲過程，筆者將ETS1質(zhì)粒及對照分別轉(zhuǎn)染入過表達(dá)NC和m i R-222的細(xì)胞中進(jìn)行Transwel l遷移實(shí)驗(yàn)，并采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：①過表達(dá)不同時間點(diǎn)的細(xì)胞遷移比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.424，P=0.000）；②轉(zhuǎn)染不同組的細(xì)胞遷移水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.524，P= 0.000）；③轉(zhuǎn)染不同組的細(xì)胞遷移變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.831，P=0.000）。見表3和圖6A。

同樣進(jìn)行M at ri gel侵襲實(shí)驗(yàn)，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：①過表達(dá)不同時間點(diǎn)的細(xì)胞侵襲比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.411，P=0.000）；②轉(zhuǎn)染不同組的細(xì)胞侵襲水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 7.783，P=0.000）；③轉(zhuǎn)染不同組的細(xì)胞侵襲變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.812，P=0.000）。該結(jié)果提示m i R-222通過靶向ETS1促進(jìn)A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力。見表4和圖6B。

表2 過表達(dá)ETS1抑制肺腺癌細(xì)胞增殖的OD值 （±s）

表2 過表達(dá)ETS1抑制肺腺癌細(xì)胞增殖的OD值 （±s）

組別5 d NC+對照組 1.27±0.21 1.57±0.40 1.91±0.42 2.11±0.44 2.82±0.43 NC+STS1組 1.30±0.22 1.37±0.31 1.34±0.33 1.72±0.31 2.11±0.481 d2 d3 d4 dm i R-222+對照組 1.31±0.20 1.62±0.39 2.21±0.45 3.21±0.38 4.17±0.38 m i R-222+ STS1組 1.32±0.35 1.36±0.30 1.36±0.51 1.92±0.41 2.11±0.48

表3 過表達(dá)ETS1抑制肺腺癌細(xì)胞的遷移 （個±s）

表3 過表達(dá)ETS1抑制肺腺癌細(xì)胞的遷移 （個±s）

組別12 h NC+對照組 97±12 191±21 NC+STS1組 76±8 97±16 m i R-222+對照組 135±12 289±18 m i R-222+STS1組 81±4 99±106 h

圖6 過表達(dá)ETS1抑制肺腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲過程

表4 過表達(dá)ETS1抑制肺腺癌細(xì)胞的侵襲 （個±s）

表4 過表達(dá)ETS1抑制肺腺癌細(xì)胞的侵襲 （個±s）

組別12 h NC+對照組 61±17 112±21 NC+STS1組 37±10 67±11 m i R-222+對照組 100±21 232±21 m i R-222+STS1組 71±11 85±176 h

3 討論

肺癌是最常見的惡性腫瘤，具有較高的死亡率，全世界每年約有130萬人死于肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌占全部肺癌的85%，且40%非小細(xì)胞肺癌為肺腺癌。盡管現(xiàn)在診斷與治療方式不斷革新，但是肺腺癌的預(yù)后仍較差，很多患者會發(fā)生轉(zhuǎn)移，5年生存率僅為15%[1]。因此關(guān)于肺腺癌發(fā)生的機(jī)制，尤其關(guān)于轉(zhuǎn)移方面仍需更多的研究，為進(jìn)一步治療提供理論基礎(chǔ)。

m i R-222屬于m i R-221/m i R-222家族，在許多腫瘤中高表達(dá)，被認(rèn)為是腫瘤相關(guān)m i croRNAs，參與許多腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移過程。M AO等[16]對非小細(xì)胞肺癌組織和鄰近正常組織進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，m i R-222在癌組織中有較高的表達(dá)水平，且高表達(dá)的m i R-222與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，且m i R-222表達(dá)水平較高的患者生存周期較短，這提示m i R-222可能參與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程。且另一課題組研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)m i R-222可以明顯促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H 460的增殖[17]，但是關(guān)于m i R-222在肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中的研究尚未有報(bào)道。因此，本文研究m i R-222對肺腺癌的影響。在肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中分別過表達(dá)m i R-222進(jìn)行功能學(xué)實(shí)驗(yàn)后，通過重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析發(fā)現(xiàn)，m i R-222促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。已知m i croRNA通過下調(diào)其靶基因的表達(dá)水平發(fā)揮生物學(xué)功能，且m i R-222被報(bào)道可靶向p27促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖[17]。而事實(shí)上1個m i croRNA可以作用于較多靶基因，因此筆者預(yù)尋找參與該過程的m i R-222靶基因。m i R-222可以靶向結(jié)合ETS1，但關(guān)于m i R-222與ETS1在肺癌中的相互作用尚未有報(bào)道，因此本研究通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和W est ern bl ot檢測證實(shí)，ETS1確實(shí)為m i R-222的靶基因，該結(jié)果與EVANGELISTA等[12]的研究一致。接著，本文通過過表達(dá)ETS1再次進(jìn)行功能學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)ETS1后，A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯下降。以上結(jié)果說明m i R-222確實(shí)通過抑制ETS1的表達(dá)促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。ETS1為轉(zhuǎn)錄因子家族成員，參與調(diào)節(jié)許多基因的轉(zhuǎn)錄過程，且ETS1在疾病發(fā)生過程中發(fā)揮多重作用[18]，而低水平的ETS1被報(bào)道參與非小細(xì)胞肺癌化療的耐藥過程[19]。本研究推測m i R-222通過下調(diào)ETS1的表達(dá)，從而抑制其下游多種基因的轉(zhuǎn)錄，有利于肺腺癌細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移和侵襲過程，但詳細(xì)的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本文通過在肺腺癌細(xì)胞A549中過表達(dá)m i R-222進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，m i R-222通過靶向下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子ETS1的表達(dá)，從而促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，再次證明m i R-222在肺癌中發(fā)揮作用，為m i R-222作為肺癌尤其是肺腺癌的生物診斷標(biāo)記物和新的治療靶點(diǎn)提供更多理論基礎(chǔ)。

[1]SIEGEL R,M A J,ZOU Z,et al.Cancer st at i st i cs,2014[J].CA：a cancer j ournal f or cl i ni ci ans,2014,64(1)：9-29.

[2]黃霞,陳亮,劉景麗,等.紫杉醇聯(lián)合卡培他濱治療Ⅳ期肺腺癌臨床療效及毒理研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015,15(17)：3276-3279.

[3]M ORALES-OYARVIDE V,M INO-KENUDSON M.Tum or i sl ands and spread t hrough ai r spaces：di st i nct pat t erns of i nvasi on i n l ung adenocarci nom a[J].Pat hol ogy Int ernat i onal,2016,66(1)：1-7.

[4]DEVARAKONDA S,M ORGENSZTERN D,GOVINDAN R.Genom i c al t erat i ons i n l ung adenocarci nom a[J].The Lancet Oncol ogy,2015,16(7)：e342-e351.

[5]KIM H,CH UNG J H.Overvi ew of cl i ni copat hol ogi c f eat ures of ALK-rearranged l ung adenocarci nom a and current di agnost i c t esti ng f or ALK rearrangem ent[J].Transl at i onal Lung Cancer Research,2015,4(2)：149-155.

[6]RANI S,GATELY K,CROW N J,et al.Gl obal anal ysi s of serum m i croRNAs as pot ent i al bi om arkers f or l ung adenocarci nom a[J]. Cancer Bi ol ogy Therapy,2013,14(12)：1104-1112.

[7]ZH ANG C Z,H AN L,ZH ANG A L,et al.M i croRNA-221 and m i croRNA-222 regul at e gast ri c carci nom a cel l prol i f erat i on and radi oresi st ance by t arget i ng PTEN[J].BM C Cancer,2010,10：367.

[8]H W ANG M S,YU N,STINSON S Y,et al.m i R-221/222 t arget s adi ponect i n recept or 1 t o prom ot e t he epi t hel i al-t o-m esenchym al t ransi t i on i n breast cancer[J].PLoS One,2013,8(6)：DOI：10.1371/ j ournal.pone.0066502.

[9]XU K,LIANG X,SH EN K,et al.M i R-222 m odul at es m ul t i drug resi st ance i n hum an col orect al carci nom a by down-regul at i ng ADAM-17[J].Experi m ent al Cel l Research,2012,318(17)：2168-2177.

[10]LEE C,H E H,JIANG Y,et al.El evat ed expressi on of t um or m i R-222 i n pancreat i c cancer i s associ at ed wi t h Ki 67 and poor prognosi s[J].M ed Oncol,2013,30(4)：700.

[11]PUERTA-GIL P,GARCIA-BAQUERO R,JIA A Y,et al. m i R-143,m i R-222,and m i R-452 are usef ul as t um or st rat i f icat i on and noni nvasi ve di agnost i c bi om arkers f or bl adder cancer[J]. The Am eri can Journal of Pat hol ogy,2012,180(5)：1808-1815.

[12]EVANGELISTA A M,DESCH AM PS A M,LIU D,et al. m i R-222 cont ri but es t o sex-di m orphi c cardi ac eNOS expressi on vi a et s-1[J].Physi ol ogi cal Genom i cs,2013,45(12)：493-498.

[13]M ATTIA G,ERRICO M C,FELICETTI F,et al.Const i t ut i ve act i vat i on of t he ETS-1-m i R-222 ci rcui t ry i n m et ast at i cm el anom a[J].Pi gm ent Cel l M el anom a Research,2011,24(5)：953-965.

[14]H UANG Q M,ZENG Y M,ZH ANG H P,et al.4-Ni t roqui nol i ne-1-oxi de ef f ect s hum an l ung adenocarci nom a A549 cel l s by regul at i ng t he expressi on of POLD4[J].Bi om edi cal Report s, 2016,4(3)：345-348.

[15]ZH ANG B,DENG S M,GUO L C,et al.Ef f ect of gem ci t abi ne on t he upt ake of(18)F-f l uorodeoxygl ucose and(18)F-f l uorot hym idi ne i n l ung adenocarci nom a A549 cel l s and t he ani m al t um or m odel[J].Journal of Cancer Research and Therapeut i cs,2016, 12(1)：271-276.

[16]M AO K P,ZH ANG W N,LIANG X M,et al.M i croRNA-222 expressi on and i t s prognost i c pot ent i al i n non-sm al l cel l l ung cancer[J].The Sci ent i f i c W orl d Journal,2014：DOI：10.1155/2014/ 908326.

[17]ZH ONG C,DING S,XU Y,et al.M i croRNA-222 prom ot es hum an non-sm al l cel l l ung cancer H 460 growt h by t arget i ng p27[J].Int ernat i onalJournalofCl i ni caland Experi m ent alM edi ci ne, 2015,8(4)：5534-5540.

[18]DITTM ER J.The rol e of t he t ranscri pt i on f act or Et s1 i n carcinom a[J].Sem i nars i n Cancer Bi ol ogy,2015,35：20-38.

[19]PH UCH AREON J,M CCORM ICK F,EISELE D W,et al.EGFR i nhi bi t i on evokes i nnat e drug resi st ance i n l ung cancer cel l s by prevent i ng Akt act i vi t y and t hus i nact i vat i ng Et s-1 f unct i on[J]. Proceedi ngs of t he Nat i onal Academ y of Sci ences of t he Uni t ed St at es of Am eri ca,2015,112(29)：E3855-E3863.

（童穎丹 編輯）

MicroRNA-222 promotes proliferation,migration and invasion of human lung adenocarcinoma cells by directly targetingETS1

Bin Lu,Jin-guang Jia,Li-hua Li,Fei-fei Yao
(Department of Respiratory Medicine,Zhengzhou People's Hospital,Zhengzhou, Henan 450003,China)

ObjectiveTo investigate the role of microRNA-22 (miR-222)in the proliferation,migration and invasion of human lung adenocarcinoma cells.MethodsFirstly,miR-222 and negative control were transfected into lung adenocarcinoma cells,and the CCK-8 assay,Transwell migration and Matrigel invasion assays were performed to detect the effect of miR-222 on cell proliferation,migration and invasion respectively.Then the luciferase reporter assay,quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR)and Western blot were performed to validate the putative target of miR-222.Subsequently,loss-of-function assay was applied to determine the target involved in the regulation of proliferation,migration and invasion of lung adenocarcinoma cells.ResultsThe results of CCK-8 assay,Transwell migration and Matrigel invasion assays indicated that miR-222 could promote the proliferation,migration and invasion of lung adenocarcinoma cells.The luciferase reporter assay,qRT-PCR and Western blot showed that miR-222 directly targeted the 3'UTR ofETS1.And overexpression ofETS1significantly inhibited the miR-222-induced proliferation,migration and invasion of lung adenocarcinoma cells.ConclusionsmiR-222 facilitates proliferation,migration and invasion of lung adenocarcinoma cells by repressingETS1.

miR-222;ETS1;proliferation;migration;invasion

1005-8982（2017）03-0034-07

R 734.2

A

2016-05-09

圖5 過表達(dá)ETS1抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖過程 （±s）