• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    瑞舒伐他汀抑制血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化的機制研究

    2017-03-08 02:21:46韓慶沈德良王勃張金盈
    中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志 2017年3期
    關(guān)鍵詞:汀對汀組瑞舒伐

    韓慶,沈德良,王勃,張金盈

    (1.鄭州大學附屬鄭州市中心醫(yī)院 心血管內(nèi)科,河南 鄭州 450007;2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科,河南 鄭州 450052)

    瑞舒伐他汀抑制血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化的機制研究

    韓慶1,沈德良2,王勃2,張金盈2

    (1.鄭州大學附屬鄭州市中心醫(yī)院 心血管內(nèi)科,河南 鄭州 450007;2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科,河南 鄭州 450052)

    D O I:10.3969/j.i s s n.1005-8982.2017.03.006

    目的研究瑞舒伐他汀是否可以抑制大鼠主動脈血管平滑肌細胞(VSM C s)表型轉(zhuǎn)化及其機制。方法SD大鼠主動脈VSM C s原代細胞培養(yǎng)鑒定,取4~7代細胞用于實驗。用不同濃度的瑞舒伐他汀干預(yù)VSM C s,W es t ern bl ot檢測各組標本中骨骼肌肌動蛋白(SM-act i n)、平滑肌22α(SM-22α)、滑肌肌球蛋白重鏈(SMM H C)、骨橋蛋白(O PN)的表達,噻唑藍(M TT)法檢測細胞增殖情況,劃痕試驗觀察細胞遷移情況。通過免疫組織化學法(IC C)檢測SM-act i n的表達從而觀察VSM C的形態(tài)。轉(zhuǎn)染過表達KLF-4或空白對照質(zhì)粒至離體培養(yǎng)的VSM C s中,用瑞舒伐他汀干預(yù),并采用上述實驗方法檢測VSM C s表型轉(zhuǎn)化情況。結(jié)果M TT結(jié)果顯示,與對照組比較,瑞舒伐他汀組VSM C s增殖能力降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。劃痕試驗結(jié)果顯示,與對照組比較,他汀組VSM C s遷移減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。W es t ern bl ot檢測顯示,與對照組比較,他汀組VSM C s中SM-22α、SM-M H C、O PN表達增多,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。IC C結(jié)果顯示,與對照組VSM C s的細胞形態(tài)比較,他汀組VSM C s形態(tài)變細、變長。轉(zhuǎn)染KLF-4過表達質(zhì)粒后,與對照組比較,轉(zhuǎn)染KLF-4過表達質(zhì)??梢栽黾覸SM C s的增殖和遷移,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),逆轉(zhuǎn)他汀對VSM C s表型轉(zhuǎn)化有抑制作用。結(jié)論瑞舒伐他汀通過下調(diào)KLF-4,抑制大鼠主動脈VSM C s表型轉(zhuǎn)化。

    動脈粥樣硬化;瑞舒伐他??;血管平滑肌細胞;表型轉(zhuǎn)化

    血管平滑肌細胞(vascul ar sm oot h m uscl e cel l s,VSM Cs)的增殖和遷移是動脈粥樣硬化發(fā)展過程中重要的病理基礎(chǔ),也是造成支架植入術(shù)或冠狀動脈搭橋術(shù)后冠狀動脈再狹窄的重要原因[1]。最近有研究顯示,血管平滑肌細胞在不同的分化階段具有不同的細胞表型,不同表型之間的平滑肌細胞生理特性相差巨大,并且在外界因素發(fā)生變化時,VSM Cs不同表型之間可以相互轉(zhuǎn)化[2]。正常血管中的VSM Cs一般是已分化的收縮型平滑肌細胞,在血管受到損傷時,一些已分化的收縮型VSM Cs可以去分化,成為分泌型細胞。收縮型VSM Cs低增殖、低分泌,特異性表達骨骼肌肌動蛋白(skel et al m uscl e act i n,SM-act i n)、平滑肌22α(sm oot h m uscl e 22α,SM-22α)、滑肌肌球蛋白重鏈(sm oot h m uscl e m yosi n heavy chai n, SM-M H C)等具有標志意義的特征性蛋白,分泌型VSM Cs增殖加快,細胞外基質(zhì)分泌增加[3],骨橋蛋白(Ost eopont i n,OPN)、基質(zhì)金屬蛋白酶(m at ri x m et all oprot ei nases,M M Ps)等蛋白表達增多[4]。過去的實驗結(jié)果顯示,在粥樣斑塊中,收縮型VSM Cs減少,分泌型VSM Cs增多[5]。最近研究證實,V脈粥樣SM Cs表型轉(zhuǎn)化在動硬化的病理發(fā)展過程中具有重要的作用[6]。

    他汀類藥物通過降脂、改善內(nèi)皮功能、減輕或消除炎癥反應(yīng)、抑制血管平滑肌增殖等作用延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[7-8]。瑞舒伐他汀可以顯著減少低密度脂蛋白受體-/-小鼠主動脈內(nèi)粥樣硬化斑塊的面積,抑制高半胱氨酸(H om ocyst ei ne,H cy)誘導的VSM Cs表達M M Ps等,破壞細胞外基質(zhì)平衡的蛋白[9]。但是瑞舒伐他汀是否可以抑制VSM Cs表型轉(zhuǎn)化,以及其作用機制尚未探明。本實驗通過用不同濃度的瑞舒伐他汀干預(yù)VSM Cs,觀察瑞舒伐他汀對 VSM Cs表型轉(zhuǎn)化及對 Krüppel樣因子 4(Krüppel-l i ke f act or4,KLF4)表達的影響,再通過在VSM Cs中轉(zhuǎn)染過表達KLF-4質(zhì)粒,觀察過表達KLF-4對VSM Cs表型轉(zhuǎn)化的影響,驗證KLF-4是否參與他汀抑制VSM Cs表型轉(zhuǎn)化的過程。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    1.1.1 實驗動物 無特定病原體級SD大鼠,雌雄不限,50 d左右,體重150~180 g(購自浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心)。

    1.1.2 實驗試劑 胎牛血清(美國Gi bco公司),瑞舒伐他汀鈣(美國Si gm a公司),RNA提取試劑(美國Invi t rogen公司),無內(nèi)毒素質(zhì)粒小、大提取試劑盒、脂質(zhì)體2000均購自上海英駿公司,4',6-二脒基-2- 苯 基 吲 哚(4',6-di am i di no-2-phenyl i ndol e,DAPI)(瑞士Rcohe公司),噻唑藍[3-(4,5-di m et hyl-2-t hi azol yl)-2,5-di phenyl-2-H-t et razol i um brom i de,M TT](美國Em resco公司),兔或鼠抗兔SM-act i n、SM-22α、SM-M CH、OPN、KLF-4、β-act i n多克隆抗體均購自英國Abcam公司,辣根過氧化酶標記的山羊抗兔或者抗鼠二抗、異硫氰酸熒光素、異硫氰酸熒光素(f l uorescei n i sot hi ocyanat e,F(xiàn)ITC)標記的山羊抗兔免疫球蛋白G均購自美國Jackson公司,蛋白免疫印跡相關(guān)試劑(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 VSM C原代細胞培養(yǎng) 采用組織貼塊法培育大鼠胸主動脈VSM Cs,采用形態(tài)學觀察和細胞免疫熒光檢測SM A,鑒定VSM Cs。通過SM A與DAPI核染的關(guān)系鑒定VSM Cs的純度,取第3~5代細胞用于后續(xù)實驗。使用脂質(zhì)體Li pof ect am i ne 2000轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染時使用不含胎牛血清改良伊格爾培養(yǎng)基培養(yǎng)基,在轉(zhuǎn)染6 h后改換含10%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h,提取細胞中的總蛋白,通過W est ren bl ot檢測KLF-4的表達鑒定轉(zhuǎn)染效率。

    1.2.2 實驗分組 實驗分兩部分,第一部分用以驗證瑞舒伐他汀是否可以抑制KLF-4的表達及VSM Cs表型轉(zhuǎn)化。VSM Cs分4組:對照組、1μm ol/L瑞舒伐他汀組、5μm ol/L瑞舒伐他汀組、20μm ol/L瑞舒伐他汀組 [瑞舒伐他汀用0.1%二甲基亞砜(di m et hyl sul f oxi de,DM SO)溶解]。第二部分用以驗證瑞舒伐他汀通過下調(diào)KLF-4抑制VSM Cs表型轉(zhuǎn)化。細胞分為4組:對照組、他汀組、過表達KLF-4組、他汀+過表達KLF-4組。

    1.2.3 KLF-4過表達質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 通過Pubm ed查找KLF-4基因序列,引物根據(jù)Genebank中KLF-4m RNA序列設(shè)計引物。正向引物:5'-CGCG GATCCATGAGCAGCCACCTGGCGAGTC-3';反向引物:5'-CCGCTCGAGTCATTAAAAATGCCTCCTCATGTGT-3'。通過Pri m est ar法進行聚合酶鏈反應(yīng)擴增KLF-4基因片段,獲得的KLF-4基因片段用1%瓊脂糖凝膠電泳,紫外線觀察目的條帶,膠回收,靶基因恢復KLF-4和質(zhì)粒DNA的T4DNA連接酶相同的酶切連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α,涂層板,篩選重組質(zhì)粒,質(zhì)粒提取后測序驗證。將VSM C細胞接種至6孔板,生長至50%~70%密度時,以脂質(zhì)體Li pof ect am i ne 2000分別轉(zhuǎn)染KLF-4或空白對照各100 pm ol,24 h后,提取總蛋白鑒定轉(zhuǎn)染效率,進行后續(xù)試驗。

    1.2.4 W es t ern bl ot檢測蛋白表達量 轉(zhuǎn)染過表達KLF-4的質(zhì)?;蛘呖瞻踪|(zhì)粒的VSM Cs血清饑餓24 h同步化,用1.2.2中不同的瑞舒伐他汀干預(yù),培養(yǎng)48 h后,提取各組細胞中總蛋白,二喹啉甲酸(bi ci nchoni ni c aci d,BCA)法定量蛋白,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(sodi um dodecylsul f at e-pol yacryl am i de gel el ect ro-phoresi s,SDS-PAGE)凝膠每孔加入30μl樣品,70V 30m i n進行蛋白濃聚,110V 2h進行凝膠電泳,并用孔徑0.45μm聚偏氟乙烯膜250 m A 100 m i n進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后經(jīng)常溫下三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液(t ri s buf f ered sal i ne and t ween 20,TBST)洗膜3次,封閉1 h后,以1∶1 000濃度加入兔(鼠)抗人 SM-act i n一抗(或抗SM-22α、SM-M H C、OPN、KLF-4、β-act i n一抗),4℃孵育過夜,常溫下TBST洗膜3次,辣根過氧化物酶標記羊抗兔(鼠)二抗孵育后增強化學發(fā)光法檢測。柯達膠片暗室顯影,Quant i t y one軟件分析。

    1.2.5 M TT法檢測 VSM C s增殖 轉(zhuǎn)染過表達KLF-4的質(zhì)?;蛘呖瞻踪|(zhì)粒的VSM Cs在96孔板中培養(yǎng),血清饑餓24 h同步化之后,用1.2.2中不同濃度的瑞舒伐他汀干預(yù),每組細胞設(shè)3個復孔,2個不加細胞的空白孔。細胞在各自條件下培養(yǎng)24、48和72 h。培養(yǎng)結(jié)束后,每孔加入M TT液20μl,37℃下繼續(xù)孵育4~6 h,小心棄去培養(yǎng)上清液,每孔加入150μl DM SO溶液,震蕩10 m i n,選擇492 nm波長在酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔光密度(opt i cal del nsi t y,OD)值并記錄。以時間為橫軸,吸光值為縱軸繪制各組VSM Cs細胞生長曲線。

    1.2.6 細胞劃痕實驗檢測VSM C s遷移 轉(zhuǎn)染過表達KLF-4的質(zhì)?;蛘呖瞻踪|(zhì)粒的VSM Cs在6孔板中培養(yǎng),血清饑餓24 h同步化之后,用1.8 m m ol/L羥基脲作用12 h抑制細胞增殖,100μl黃色槍頭垂直孔板制造細胞劃痕,吸掉細胞培養(yǎng)液,磷酸鹽緩沖溶液(phosphat e buf f er sal i ne,PBS)沖洗3次,用1.2.2中不同濃度的瑞舒伐他汀干預(yù),在相應(yīng)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)細胞,拍照記錄0、12、24、48和72 h圖片,Im age pro pl us 6.0軟件分析計算細胞遷移面積,并以遷移面積與原劃痕面積比值來表示各組VSM Cs遷移的多少。

    1.2.7 細胞免疫熒光法檢測各組SM-act i n在細胞中的分布及表達 VSM Cs按1.2.2中分組在96孔板中培養(yǎng),同步化之后加入不同濃度的瑞舒伐他汀,培養(yǎng)48 h后,PBS洗3遍,4%多聚甲醛固定,0.25% Tri t on X 100穿破細胞膜,山羊血清室溫封閉1 h,加入稀釋250倍的ant i-SM A抗體,4℃過夜,PBS清洗3遍,加入結(jié)合有異硫氰酸熒光素的山羊抗兔二抗,室溫孵育1 h,PBS清洗3遍,熒光顯微鏡拍照后圖片用Iam ge pro pl us 6.0軟件分析。

    1.3 統(tǒng)計學方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件,計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示,多組均比較用單因素方差分析,若方差齊則兩兩比較用LSD-t法,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 VSMCs原代培養(yǎng)鑒定

    組織貼塊法培養(yǎng)SD大鼠胸主動脈VSM Cs,8d左右組織塊周圍有細胞爬出,2周左右細胞融合可傳代。傳代后細胞呈典型峰谷狀排列生長,用SM-act i n細胞免疫熒光鑒定VSM C,DAPI核染后確定細胞純度>99%。見圖1。

    圖1 VSMCs原代培養(yǎng)鑒定

    2.2 瑞舒伐他汀抑制VSMCs表型轉(zhuǎn)化

    2.2.1 瑞舒伐他汀抑制VSM C s增殖和遷移 不同濃度的瑞舒伐他汀處理12 h后,各組OD值比較,差異無統(tǒng)計學意義(F=7.531,P=0.012)。與對照組比較,24 h后瑞舒伐他汀組OD值降低,差異有統(tǒng)計學意義(F=7.513,P=0.012),并與瑞舒伐他汀的濃度呈正相關(guān),說明瑞舒伐他汀可抑制VSM Cs的增殖。各干預(yù)因素處理48 h后,與對照組比較,瑞舒伐他汀組VM SCs的遷移面積減少,差異有統(tǒng)計學意義(F= 15.682,P=0.001),并與瑞舒伐他汀的濃度呈正相關(guān),說明瑞舒伐他汀可抑制VSM Cs的遷移。見圖2。

    2.2.2 瑞舒伐他汀抑制VSM C s形態(tài)變化 不同濃度的瑞舒伐他汀處理48 h后,各組平滑肌細胞中SM-act i n熒光形態(tài)不同,對照組中形態(tài)變圓,SM-act i n排列紊亂,失去VSM Cs原有的細胞形態(tài)。與對照組比較,瑞舒伐他汀組中VSM Cs細長呈梭形,SM-act i n排列整齊。見圖3。

    圖2 瑞舒伐他汀抑制VSMCs增殖和遷移

    2.2.3 瑞舒伐他汀影響VSM C s內(nèi)細胞表型相關(guān)蛋白及KLF-4的表達 各組VSM Cs中SM-act i n表達量比較,差異無統(tǒng)計學意義(F=1.346,P=0.349)。與對照組比較,瑞舒伐他汀組VSM Cs中SM-22α和SM-M H C表達增加,差異有統(tǒng)計學意義(F=18.917,P=0.000),并與瑞舒伐他汀的濃度呈正相關(guān);OPN和KLF-4的表達增加,差異有統(tǒng)計學意義(F=22.371,P=0.000)。見圖4。

    圖3 瑞舒伐他汀抑制VSMCs形態(tài)變化

    2.3 過表達KLF-4逆轉(zhuǎn)瑞舒伐他汀對VSMCs表型轉(zhuǎn)化的抑制作用

    2.3.1 過表達KLF-4逆轉(zhuǎn)瑞舒伐他汀對VSM C s增殖和遷移的抑制作用 與空質(zhì)粒對照組比較,轉(zhuǎn)染過表達KLF-4質(zhì)粒組VSM Cs中KLF-4的表達增加,差異有統(tǒng)計學意義(F=22.838,P=0.000)。與對照組比較,瑞舒伐他汀組OD值降低,差異有統(tǒng)計學意義(F= 9.436,P=0.002);轉(zhuǎn)染過表達KLF-4質(zhì)粒后,與對照組比較,KLF-4組、瑞舒伐他汀+KLF-4組的OD值升高,差異有統(tǒng)計學意義(F=33.562,P=0.000),說明過表達KLF-4可以增加VSM Cs的增殖,逆轉(zhuǎn)瑞舒伐他汀對VSM Cs增殖的抑制的作用。與對照組比較,瑞舒伐他汀組VSM Cs遷移面積減少,差異有統(tǒng)計學意義(F=18.255,P=0.000);與對照組比較,KLF-4過表達組和瑞舒伐他汀+KLF-4組VSM Cs遷移面積增加,差異有統(tǒng)計學意義(F=22.938,P=0.000),說明過表達KLF-4可以增加VSM Cs的遷移,逆轉(zhuǎn)瑞舒伐他汀對VSM Cs遷移的抑制作用。見圖5。

    2.3.2 過表達KLF-4逆轉(zhuǎn)瑞舒伐他汀對VSM C s形態(tài)變化的抑制作用 與對照組比較,瑞舒伐他汀組中VSM Cs細長呈梭形,SM-act i n排列整齊。轉(zhuǎn)染過表達KLF-4質(zhì)粒后,KLF-4組和瑞舒伐他汀+KLF-4組中VSM Cs形態(tài)變圓,SM-act i n排列紊亂,失去VSM Cs原有的細胞形態(tài),說明過表達KLF-4可以導致VSM Cs形態(tài)變圓,逆轉(zhuǎn)瑞舒伐他汀的作用。見圖6。

    圖4 Western blot檢測各組VSMCs中SM-actin、SM-22α、SM-MHC、OPN及KLF-4的表達

    圖5 過表達KLF-4逆轉(zhuǎn)瑞舒伐他汀對VSMCs增殖和遷移的抑制作用

    2.3.3 過表達KLF-4逆轉(zhuǎn)瑞舒伐他汀對VSM C s內(nèi)細胞表型相關(guān)蛋白的影響 與對照組比較,瑞舒伐他汀組SM-M H C、SM 22α表達增加,差異有統(tǒng)計學意義(F=31.541,P=0.000),OPN、KLF-4表達減少,差異有統(tǒng)計學意義(F=35.518,P=0.000);轉(zhuǎn)染過表達KLF-4質(zhì)粒后,與對照組比較,KLF-4組、瑞舒伐他汀+KLF-4組的SM-M H C、SM 22α表達減少,差異有統(tǒng)計學意義(F=5.784,P=0.032),OPN表達增加,差異有統(tǒng)計學意義(F=6.723,P=0.000),說明過表達KLF-4可以減少SM-M H C、SM 22α的表達,增加OPN的表達,逆轉(zhuǎn)瑞舒伐他汀對VSM Cs表型轉(zhuǎn)化的抑制作用。見圖7。

    圖6 過表達KLF-4逆轉(zhuǎn)瑞舒伐他汀對VSMCs形態(tài)變化的抑制作用

    圖7 Western blot檢測各組VSMCs中SM-actin、SM-22α、SM-MHC、OPN及KLF-4的表達

    3 討論

    在不同的外界因素刺激下,VSM C有不同的細胞表型,具有很強的可塑性。在正常血管中膜中,VSM Cs是一種高分化細胞,細胞形態(tài)呈梭形,主要起維持血管形狀和收縮血管的作用,具有低增殖、遷移慢、蛋白分泌少等特征[10]。當發(fā)生動脈粥樣硬化等血管疾病時,VSM Cs可以去分化為未分化的細胞,細胞形態(tài)變圓,收縮性能下降,表現(xiàn)出高增殖、高遷移、高蛋白分泌等特征[11],在血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。

    目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一大批特異性比較高,可以當作已分化成熟VSM Cs標志的蛋白,如與細胞收縮密切相關(guān)的 SM-act i n、SM-M H C、Cal poni n、SM 22α、Sm oot hel i n等蛋白,以及參與細胞骨架構(gòu)成的H-cal desm on、Tel oki n、β-vi ncul i n、M et avi ncul i n、Desm i n等蛋白[3]。該蛋白在收縮型VSM Cs中高表達,其表達量隨著VSM Cs的去分化而逐漸減少。相反,OPN、M M Ps、糖基質(zhì)蛋白等在去分化的分泌型VSM Cs中高表達,并且表達量跟細胞的去分化程度呈正相關(guān)[4]。因此結(jié)合VSM Cs的增殖和遷移,再檢測SM α-act i n、SM-M H C、 SM 22α及OPN等蛋白的表達,是近幾年來國內(nèi)外研究者常用的用來鑒別VSM Cs不同細胞表型的方法。

    瑞舒伐他汀是一種選擇性羥甲基戊二酸甲酰輔酶A還原酶抑制劑,通過減少甲羥戊酸的生成,從而抑制膽固醇的合成,進而降低血清中低密度脂蛋白的水平。最近許多研究表明,他汀類藥物的療效不僅能用其降脂作用來解釋,而且具有保護血管內(nèi)皮細胞、抗氧化、抗炎、抗心肌重構(gòu)等作用[12]。筆者的實驗結(jié)果顯示,瑞舒伐他汀可以抑制VSM Cs的增殖和遷移,使VSM Cs細胞形態(tài)呈細長的梭形,增加SM-M H C、SM-22α的表達,減少OPN在VSM Cs中的表達,從而證實瑞舒伐他汀可以抑制VSM Cs表型轉(zhuǎn)化,這可能也是其抗動脈粥樣硬化的機制之一。同時,筆者也發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀可以抑制VSM Cs中KLF-4的表達。

    KLF-4是一種真核鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子,在細胞增殖分化、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移進展等多種生理、病理過程中發(fā)揮重要作用。過去的研究顯示,轉(zhuǎn)化生長因子-α、血小板衍生生長因子(pl at el et-deri ved growt h f act or-BB,PDGF-BB)、H cy等眾多因素對VSM Cs增殖有影響[13-16]。CHENG[17]和DAVIS-DUSENBERY等[18]發(fā)現(xiàn),m i croRNA-145是通過抑制 KLF-4而減少VSM Cs的表型轉(zhuǎn)化。與此同時,ZH ENG等[19]的實驗結(jié)果顯示,在用PDGF-BB誘導VSM Cs表型轉(zhuǎn)化時,KLF-4的表達升高,抑制KLF-4的表達可以抑制PDGF-BB誘導VSM Cs表型轉(zhuǎn)化的作用。與上述研究結(jié)果相符,筆者通過向VSM Cs轉(zhuǎn)染過表達KLF-4的質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)KLF-4可以促進VSM Cs的增殖和遷移,可以逆轉(zhuǎn)瑞舒伐他汀對VSM Cs表型轉(zhuǎn)化的抑制作用。

    本實驗采用不同濃度的瑞舒伐他汀干預(yù)VSM Cs,發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀具有抑制VSM Cs表型轉(zhuǎn)化,減少KLF-4表達的作用。之后通過進一步向VSM Cs轉(zhuǎn)染過表達KLF-4質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)過表達KLF-4可以促進VSM Cs的增殖和遷移,逆轉(zhuǎn)瑞舒伐他汀對VSM Cs表型轉(zhuǎn)化的抑制作用,最終證實瑞舒伐他汀是通過下調(diào)KLF-4,抑制VSM Cs的表型轉(zhuǎn)化。

    [1]ROTLLA N N,W ANSCH EL A C,FERNANDEZ-H ERNANDO A, et al.Genet i c evi dence support s a m aj or rol e f or AKT1 i n vsm cs duri ng at herogenesi s[J].Ci rc Res,2015,116(11):1744-1752.

    [2]OW ENS G K,KUM AR M S,W AM H OFF B R.M ol ecul ar regul at i on of vascul ar sm oot h m uscl e cel l di f f erent i at i on i n devel opm ent and di sease[J].Physi ol Rev,2004,84(3):767-801.

    [3]ALEXANDER M R,OW ENS G K.Epi genet i c cont rol of sm oot h m uscl e cel l di f f erent i at i on and phenot ypi c swi t chi ng i n vascul ar devel opm ent and di sease[J].Annu Rev Physi ol,2012,74:13-40.

    [4]JIANG H,LUN Y,W U X,et al.Associ at i on bet ween t he hypom et hyl at i on of ost eopont i n and i nt egri n bet a3 prom ot ers and vascul ar sm oot h m uscl e cel l di f f erent i at i on i n great saphenous vari cose vei ns[J].Int J M ol Sci,2014,15(10):18747-18761.

    [5]GOM EZ D,OW ENS G K.Sm oot h m uscl e cel l phenot ypi c swi t chi ng i n at heroscl erosi s[J].Cardi ovasc Res,2012,95(2):156-164.

    [6]CH ISTIAKOV D A,OREKH OV A N,BOBRYSH EV Y V.Vascul ar sm oot h m uscl e cel l i n at heroscl erosi s[J].Act a Physi ol(Oxf), 2015,214(1):33-50.

    [7]KOH LI P,W ATERS D D,NEM R R,et al.Ri sk of new-onset di abet es and cardi ovascul ar ri sk reduct i on f rom hi gh-dose st at i n t herapy i n pre-di abet i cs and non-pre-di abet i cs:an anal ysi s f rom TNT and IDEAL[J].J Am Col l Cardi ol,2015,65(4):402-404.

    [8]ROSENSON R S,KENT S T,BROW N T M,et al.Underut i l i zat i on of hi gh-i nt ensi t y st at i n t herapy af t er hospi t al i zat i on f or coronary heart di sease[J].J Am Col l Cardi ol,2015,65(3):270-277.

    [9]SH I Y F,CH I JF,TANG W L,et al.Ef f ect s of rosuvast at i n on t he product i on and act i vat i on of m at ri x m et al l oprot ei nase-2 and m i grat i on of cul t ured rat vascul ar sm oot h m uscl e cel l s i nduced by hom ocyst ei ne[J].Journal of Zhej i ang Uni versi t y-Sci ence B, 2013,14(8):696-704.

    [10]季軍,潘一峰,何霞,等.超聲靶向轉(zhuǎn)染c-m yc基因的反義肽核酸抑制兔髂動脈平滑肌細胞增生的實驗研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2015,25(2):32-36.

    [11]LIU R,LESLIE K L,M ARTIN K A.Epi genet i c regul at i on of sm oot h m uscl e cel l pl ast i ci t y[J].Bi ochi m Bi ophys Act a,2014, 24(4):567-579.

    [12]TOUSOULIS D,PSARROS C,DEM OSTH ENOUS M,et al.Innat e and adapt i ve i nf l am m at i on as a t herapeut i c t arget i n vascul ar di sease:t he em ergi ng rol e of st at i ns[J].J Am Col l Cardi ol, 2014,63(23):2491-2502.

    [13]ZH ENG B,H AN M,W EN JK.Rol e of Kruppel-l i ke f act or 4 i n phenot ypi c swi t chi ng and prol i f erat i on of vascul ar sm oot h m uscl e cel l s[J].IUBM B Li f e,2010,62(2):132-139.

    [14]YU K,ZH ENG B,H AN M,et al.ATRA act i vat es and PDGFBB represses t he SM 22 al pha prom ot er t hrough KLF4 bi ndi ng t o,or di ssoci at i ng f rom,i t s ci s-DNA el em ent s[J].Cardi ovasc Res,2011,90(3):464-474.

    [15]SIVRITAS D,BECH ER M U,EBRAH IM IAN T,et al.Ant i prol i f erat i ve ef f ect of est rogen i n vascul ar sm oot h m uscl e cel l s i s m edi at ed by Kruppel-l i ke f act or-4 and m anganese superoxi de di sm ut ase[J].Basi c Res Cardi ol,2011,106(4):563-575.

    [16]GARVEY S M,SINDEN D S,SCH OPPEE BORTZ P D,et al. Cycl ospori ne up-regul at es Kruppel-l i ke f act or-4(KLF4)i n vascul ar sm oot h m uscl e cel l s and dri ves phenot ypi c m odul at i on i n vi vo[J].J Pharm acol Exp Ther,2010,333(1):34-42.

    [17]CH ENG Y,LIU X,YANG J,et al.M i croRNA-145,a novel sm oot h m uscl e cel l phenot ypi c m arker and m odul at or,cont rol s vascul ar neoi nt i m al l esi on f orm at i on[J].Ci rc Res,2009,105(2):158-166.

    [18]DAVIS-DUSENBERY B N,CH AN M C,RENO K E,et al. Down-regul at i on of Kruppel-l i ke f act or-4 (KLF4)by m i croRNA-143/145 i s cri t i cal f or m odul at i on of vascul ar sm oot h m uscl e cel l phenot ype by t ransf orm i ng growt h f act or-bet a and bone m orphogenet i c prot ei n 4[J].J Bi ol Chem,2011,286(32):28097-28110.

    [19]ZH ENG B,H AN M,BERNIER M,et al.Kruppel-l i ke f act or 4 i nhi bi t s prol i f erat i on by pl at el et-deri ved growt h f act or recept or bet a-m edi at ed,not by ret i noi c aci d recept or al pha-m edi at ed, phosphat i dyl i nosi t ol 3-ki nase and ERK si gnal i ng i n vascul ar sm oot h m uscl e cel l s[J].J Bi olChem,2009,284(34):22773-22785.

    (童穎丹 編輯)

    Rosuvastatin inhibits phonotype transformation of vascular smooth muscle cells by down-regulation of KLF-4

    Qing Han1,De-liang Shen2,Bo Wang2,Jin-ying Zhang2
    (1.Department of Cardiology,Zhengzhou Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University, Zhengzhou,Henan 450007,China;2.Department of Cardiology,the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450052,China)

    ObjectiveTo verify whether Rosuvastatin could inhibit vascular smooth muscle cell(VSMC) phonotype switch by down-regulation of KLF-4.MethodsThe primary culture and identification of SD rat VSMCs were conducted,VSMCs in the 3rd to 5th passages were used for the following experiments.After treatment with different concentrations of Rosuvastatin,MTT was used to investigate the proliferative ability of VSMCs.Transwell chambers and wound healing were employed to test the migration ability of VSMCs.IHC was used to detect the expression of SM-actin and the morphological structure of VSMCs.Western blot was used to investigate the expressions of SM-actin,SM-MHC,SM-22α,osteopontin (OPN)and KLF-4 in VSMCs. After KLF-4 was transfected into VSMCs,the metheods were used again to test the phonotype changes of the VSMCs.ResultsCompared with the control group,the migration and proliferation ability of the VSMCs were decreased in the Rosuvastatin group.The expressions of SM-actin,SM-22α and SM-MHC in the Rosuvastatin group were significantly increased(P<0.05),and the expression of OPN also increased(P<0.05).IHC showed the VSMCs in the Rosuvastatin group became thinner and longer than those of the control group.After KLF-4 was transfected into VSMCs,the proliferation and migration ability of the VSMCs increased (P<0.05).Over-expression of KLF-4 reversed the effect of Rosuvsatatin on VSMCs phonotype transformation.ConclusionsRosuvastatin inhibits VSMCs phonotype switch by down-regulation of KLF-4.

    atherosclerosis;Rosuvastatin;VSMCs;phonotype switch

    1005-8982(2017)03-0027-07

    R 543.31

    A

    2016-01-26

    猜你喜歡
    汀對汀組瑞舒伐
    隔姜灸聯(lián)合瑞舒伐他汀治療脾虛濕阻型肥胖并發(fā)高脂血癥的臨床觀察
    瑞舒伐他汀與阿托伐他汀對早發(fā)冠心病急性心肌梗死患者血脂及左心射血分數(shù)的影響
    不同他汀類藥物治療老年動脈粥樣硬化性急性腦梗死合并高血脂患者的效果對比研究
    瑞舒伐他汀對高齡冠心病介入治療患者血脂、炎癥反應(yīng)及腎功能的影響觀察
    強化他汀對急性冠狀動脈綜合征經(jīng)皮冠狀動脈介入治療后的療效觀察
    瑞舒伐他汀聯(lián)合曲美他嗪治療冠心病的臨床效果分析
    阿托伐他汀和瑞舒伐他汀用于冠心病治療療效對比
    阿托伐他汀聯(lián)合曲美他嗪治療冠心病的療效評價
    阿托伐他汀對慢性腎臟病患者腎功能的影響
    蒲參膠囊聯(lián)合瑞舒伐他汀片治療中老年混合型高脂血癥43例
    亚洲无线在线观看| 色综合站精品国产| 少妇的逼好多水| 亚洲av电影在线进入| 国模一区二区三区四区视频| 免费看日本二区| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 婷婷精品国产亚洲av| 欧美日本亚洲视频在线播放| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 欧美zozozo另类| 少妇人妻精品综合一区二区 | 99久久精品国产亚洲精品| 日韩欧美国产在线观看| h日本视频在线播放| av国产免费在线观看| 欧美性感艳星| 很黄的视频免费| 天堂网av新在线| 亚洲av五月六月丁香网| 草草在线视频免费看| 欧美一区二区国产精品久久精品| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产精品爽爽va在线观看网站| 精品欧美国产一区二区三| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 99国产精品一区二区三区| 国产精品影院久久| 一个人免费在线观看的高清视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 99热这里只有是精品50| 日本黄大片高清| 一进一出好大好爽视频| 男插女下体视频免费在线播放| 99热这里只有精品一区| 黄色日韩在线| 国产欧美日韩一区二区三| 免费观看人在逋| 99热6这里只有精品| 国产探花在线观看一区二区| 两个人的视频大全免费| 国产精品爽爽va在线观看网站| 日韩有码中文字幕| 久久久久久久久中文| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产91精品成人一区二区三区| 日韩av在线大香蕉| 日本三级黄在线观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 俺也久久电影网| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 小说图片视频综合网站| 亚洲av美国av| 99精品久久久久人妻精品| 天堂网av新在线| 999久久久精品免费观看国产| 久久精品国产清高在天天线| 亚洲成av人片免费观看| 丁香六月欧美| 欧美最新免费一区二区三区 | 欧美黑人欧美精品刺激| 午夜免费激情av| svipshipincom国产片| 国产毛片a区久久久久| 亚洲精品一区av在线观看| 精品国产美女av久久久久小说| 搡老妇女老女人老熟妇| 女人被狂操c到高潮| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 九九热线精品视视频播放| 最近最新中文字幕大全免费视频| 三级毛片av免费| 免费一级毛片在线播放高清视频| 999久久久精品免费观看国产| 黄片小视频在线播放| 在线观看午夜福利视频| 天堂网av新在线| 两个人的视频大全免费| 哪里可以看免费的av片| 国产成人av教育| 日日夜夜操网爽| 国产一区二区三区视频了| 亚洲,欧美精品.| 美女cb高潮喷水在线观看| 最新美女视频免费是黄的| 国产视频一区二区在线看| 国产欧美日韩一区二区三| 黄片大片在线免费观看| 制服人妻中文乱码| 久久国产精品影院| 国产精品,欧美在线| 日本一二三区视频观看| 国产激情欧美一区二区| 亚洲 国产 在线| 哪里可以看免费的av片| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲欧美日韩东京热| 日韩欧美精品v在线| 欧美日韩乱码在线| 国产成人啪精品午夜网站| 成年版毛片免费区| 国产欧美日韩一区二区三| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲片人在线观看| tocl精华| 亚洲无线观看免费| 亚洲美女视频黄频| 午夜精品久久久久久毛片777| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 在线观看av片永久免费下载| 性色av乱码一区二区三区2| 免费看日本二区| 成年版毛片免费区| 一a级毛片在线观看| 亚洲在线观看片| 深爱激情五月婷婷| 免费高清视频大片| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 18美女黄网站色大片免费观看| 1024手机看黄色片| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产欧美日韩精品一区二区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产精品久久久久久精品电影| 精品久久久久久久末码| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产午夜福利久久久久久| 长腿黑丝高跟| 一级黄片播放器| 国产伦在线观看视频一区| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 夜夜爽天天搞| 一级毛片女人18水好多| 成人三级黄色视频| 久久九九热精品免费| 欧美最黄视频在线播放免费| 日韩成人在线观看一区二区三区| 99riav亚洲国产免费| 国产成人a区在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 90打野战视频偷拍视频| 级片在线观看| 久久人人精品亚洲av| 18禁美女被吸乳视频| 日本三级黄在线观看| 精品一区二区三区人妻视频| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 操出白浆在线播放| 天天一区二区日本电影三级| 91麻豆精品激情在线观看国产| av在线天堂中文字幕| 女人被狂操c到高潮| 欧美最新免费一区二区三区 | 观看美女的网站| 亚洲久久久久久中文字幕| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲国产精品合色在线| 久久久久久国产a免费观看| 国产精品久久久久久久久免 | 国产乱人视频| 51午夜福利影视在线观看| svipshipincom国产片| 91久久精品电影网| 欧美在线一区亚洲| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 一级a爱片免费观看的视频| 男女视频在线观看网站免费| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 宅男免费午夜| 久久久国产成人免费| 91在线观看av| 久久中文看片网| 一进一出抽搐动态| 中文亚洲av片在线观看爽| 久久久久久久午夜电影| 亚洲欧美精品综合久久99| 成年女人看的毛片在线观看| 天美传媒精品一区二区| 99热精品在线国产| 国内揄拍国产精品人妻在线| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲中文字幕日韩| а√天堂www在线а√下载| 最新美女视频免费是黄的| 99国产极品粉嫩在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 脱女人内裤的视频| 精华霜和精华液先用哪个| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲欧美日韩东京热| 国产成年人精品一区二区| 在线播放无遮挡| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 99热这里只有精品一区| 脱女人内裤的视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产乱人视频| 久久香蕉国产精品| 久9热在线精品视频| 亚洲人成网站在线播| 亚洲一区二区三区不卡视频| 日韩精品青青久久久久久| 床上黄色一级片| 亚洲最大成人手机在线| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 一本久久中文字幕| 内射极品少妇av片p| 黄片小视频在线播放| 成年免费大片在线观看| 动漫黄色视频在线观看| 欧美zozozo另类| 国产精品野战在线观看| 色吧在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 深夜精品福利| 亚洲不卡免费看| 中文字幕av成人在线电影| 欧美成人a在线观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 欧美在线黄色| x7x7x7水蜜桃| 麻豆久久精品国产亚洲av| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 成人欧美大片| 男女下面进入的视频免费午夜| 一进一出抽搐动态| 亚洲国产高清在线一区二区三| 偷拍熟女少妇极品色| 久久人妻av系列| 色在线成人网| 免费在线观看亚洲国产| ponron亚洲| 亚洲黑人精品在线| 亚洲一区二区三区不卡视频| 丰满乱子伦码专区| 99久久成人亚洲精品观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 一本久久中文字幕| 亚洲专区国产一区二区| 18禁美女被吸乳视频| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产真人三级小视频在线观看| 两个人视频免费观看高清| 亚洲黑人精品在线| 亚洲真实伦在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| 丝袜美腿在线中文| 亚洲国产中文字幕在线视频| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲精品成人久久久久久| 午夜亚洲福利在线播放| 精品日产1卡2卡| 亚洲色图av天堂| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国模一区二区三区四区视频| 一本精品99久久精品77| 亚洲电影在线观看av| 国产高清视频在线观看网站| 午夜精品在线福利| 免费人成在线观看视频色| 无遮挡黄片免费观看| 午夜精品在线福利| 免费无遮挡裸体视频| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 天堂网av新在线| 久久亚洲精品不卡| 欧美极品一区二区三区四区| 午夜影院日韩av| tocl精华| 999久久久精品免费观看国产| 一个人观看的视频www高清免费观看| 午夜免费男女啪啪视频观看 | av黄色大香蕉| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国语自产精品视频在线第100页| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产伦精品一区二区三区四那| 美女黄网站色视频| 国产成人啪精品午夜网站| 无遮挡黄片免费观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 精品国产亚洲在线| 日本一二三区视频观看| 久久香蕉精品热| 欧美在线一区亚洲| 日韩精品中文字幕看吧| 制服丝袜大香蕉在线| 中文字幕av在线有码专区| 99热只有精品国产| av黄色大香蕉| 国产私拍福利视频在线观看| 午夜久久久久精精品| 欧美在线黄色| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产 | 国产精品1区2区在线观看.| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产国拍精品亚洲av在线观看 | 亚洲成人中文字幕在线播放| 老司机午夜福利在线观看视频| 嫩草影视91久久| 久久九九热精品免费| 在线观看66精品国产| 制服丝袜大香蕉在线| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲国产欧美人成| 脱女人内裤的视频| 九色成人免费人妻av| 中文在线观看免费www的网站| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 欧美3d第一页| 亚洲美女黄片视频| x7x7x7水蜜桃| av中文乱码字幕在线| 久99久视频精品免费| 国产精品久久久久久久电影 | 一进一出抽搐gif免费好疼| 99riav亚洲国产免费| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 特级一级黄色大片| 亚洲七黄色美女视频| 韩国av一区二区三区四区| 国产一区二区激情短视频| 99热这里只有是精品50| www.999成人在线观看| 国产高清videossex| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 欧美另类亚洲清纯唯美| 草草在线视频免费看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 日韩成人在线观看一区二区三区| 99久国产av精品| 免费看a级黄色片| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲乱码一区二区免费版| 无人区码免费观看不卡| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 一区二区三区免费毛片| 午夜两性在线视频| or卡值多少钱| 两人在一起打扑克的视频| 99久久精品一区二区三区| 听说在线观看完整版免费高清| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 一本综合久久免费| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲人成电影免费在线| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产精品久久久人人做人人爽| bbb黄色大片| 少妇高潮的动态图| 国产欧美日韩精品亚洲av| 少妇的丰满在线观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| www.熟女人妻精品国产| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产高清有码在线观看视频| 午夜精品一区二区三区免费看| 啦啦啦免费观看视频1| 99久久综合精品五月天人人| 热99在线观看视频| 国产综合懂色| 十八禁网站免费在线| 男女那种视频在线观看| 99在线人妻在线中文字幕| 天堂网av新在线| 免费高清视频大片| 麻豆一二三区av精品| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 免费观看精品视频网站| 久久久久久大精品| 在线观看舔阴道视频| 日韩欧美免费精品| 国产精品乱码一区二三区的特点| 欧美黑人巨大hd| 成年版毛片免费区| 久久久久九九精品影院| 日韩欧美 国产精品| 午夜精品久久久久久毛片777| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲成人久久爱视频| 久久久久久九九精品二区国产| 一级作爱视频免费观看| 成人国产一区最新在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 免费看a级黄色片| 狂野欧美激情性xxxx| 久久精品国产自在天天线| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲精品成人久久久久久| 欧美极品一区二区三区四区| 久久久久久久久大av| 精品久久久久久久久久久久久| 色吧在线观看| 国产激情欧美一区二区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产精品99久久久久久久久| 欧美激情在线99| 手机成人av网站| 老鸭窝网址在线观看| 欧美最新免费一区二区三区 | 免费看十八禁软件| 亚洲精品在线美女| 成人性生交大片免费视频hd| 最好的美女福利视频网| 99在线视频只有这里精品首页| 一级黄色大片毛片| 变态另类丝袜制服| 久久九九热精品免费| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产精品一区二区三区四区久久| 色视频www国产| 麻豆久久精品国产亚洲av| 天天躁日日操中文字幕| 99久久99久久久精品蜜桃| 美女黄网站色视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 又粗又爽又猛毛片免费看| 十八禁人妻一区二区| 在线观看舔阴道视频| 免费高清视频大片| svipshipincom国产片| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 真人一进一出gif抽搐免费| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久久久久久午夜电影| 脱女人内裤的视频| 嫩草影院精品99| 内射极品少妇av片p| 久久亚洲真实| 亚洲精品在线美女| 免费在线观看成人毛片| 五月伊人婷婷丁香| 色综合婷婷激情| 叶爱在线成人免费视频播放| 一个人看视频在线观看www免费 | 久久精品国产亚洲av涩爱 | 欧美另类亚洲清纯唯美| 岛国视频午夜一区免费看| 国产av麻豆久久久久久久| 俄罗斯特黄特色一大片| 免费av不卡在线播放| 青草久久国产| 亚洲精品亚洲一区二区| 色av中文字幕| 精品乱码久久久久久99久播| 真人做人爱边吃奶动态| av视频在线观看入口| 全区人妻精品视频| 国产美女午夜福利| 3wmmmm亚洲av在线观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 欧美日韩国产亚洲二区| 成人无遮挡网站| 不卡一级毛片| 亚洲一区高清亚洲精品| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 真实男女啪啪啪动态图| 久久久国产精品麻豆| 欧美精品啪啪一区二区三区| 毛片女人毛片| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 日本精品一区二区三区蜜桃| 欧美日韩国产亚洲二区| 免费看十八禁软件| 国产三级中文精品| 成人亚洲精品av一区二区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产熟女xx| 中亚洲国语对白在线视频| 国产一区二区三区视频了| 亚洲成a人片在线一区二区| 啦啦啦免费观看视频1| 久久人妻av系列| 国产精品爽爽va在线观看网站| 成人国产综合亚洲| 午夜精品在线福利| 在线视频色国产色| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 免费在线观看亚洲国产| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 国产精品免费一区二区三区在线| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产精品 国内视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 首页视频小说图片口味搜索| 黄片小视频在线播放| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲黑人精品在线| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲avbb在线观看| 床上黄色一级片| 亚洲最大成人中文| 亚洲欧美日韩高清专用| 美女免费视频网站| 国产精品一区二区免费欧美| 超碰av人人做人人爽久久 | 日日干狠狠操夜夜爽| 中文亚洲av片在线观看爽| 免费在线观看亚洲国产| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲中文日韩欧美视频| 精品久久久久久久末码| 波多野结衣高清无吗| 国产久久久一区二区三区| 亚洲熟妇熟女久久| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产真实乱freesex| 国产一区在线观看成人免费| 精品久久久久久久久久免费视频| 欧美性感艳星| 亚洲电影在线观看av| 首页视频小说图片口味搜索| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产探花极品一区二区| 99在线视频只有这里精品首页| 美女免费视频网站| 日韩大尺度精品在线看网址| 男女之事视频高清在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 哪里可以看免费的av片| 国产精品国产高清国产av| 亚洲人成电影免费在线| 国产精品av视频在线免费观看| 国产激情欧美一区二区| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 午夜激情欧美在线| 精品人妻1区二区| 欧美成人免费av一区二区三区| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 嫩草影视91久久| bbb黄色大片| av天堂在线播放| 日本黄色片子视频| 啦啦啦免费观看视频1| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 亚洲中文日韩欧美视频| 黄色视频,在线免费观看| 天天一区二区日本电影三级| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 黄片大片在线免费观看| 国产高清视频在线播放一区| 免费在线观看亚洲国产| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲不卡免费看| 日韩欧美三级三区| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 日韩欧美在线乱码| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 成人国产综合亚洲| 欧美成人一区二区免费高清观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产成人a区在线观看| 日本a在线网址| 免费在线观看影片大全网站| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 天天添夜夜摸| 不卡一级毛片| 国产成人啪精品午夜网站| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 特大巨黑吊av在线直播| 久久久久久久午夜电影| 久久香蕉精品热| 中出人妻视频一区二区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 在线观看免费视频日本深夜| 欧美丝袜亚洲另类 | 男人舔女人下体高潮全视频| 一级毛片高清免费大全| 免费看十八禁软件| 国产成人系列免费观看| a级一级毛片免费在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲国产精品999在线| 国产探花在线观看一区二区| 嫩草影院入口| 亚洲成人精品中文字幕电影| 可以在线观看毛片的网站| 欧美黑人巨大hd| 国产三级在线视频| 成人一区二区视频在线观看| 中国美女看黄片| 美女大奶头视频| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 黄片大片在线免费观看| 色噜噜av男人的天堂激情| 99久久99久久久精品蜜桃| 久久久色成人| 国产主播在线观看一区二区| 一本综合久久免费| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 99久久精品热视频| 国产探花极品一区二区|