硫化氫通過p38MAPK和TGF-β1影響糖尿病小鼠心肌纖維化的研究*

丁利，宋冰，張浩強(qiáng)

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 內(nèi)分泌科，遼寧 錦州 121001）

硫化氫通過p38MAPK和TGF-β1影響糖尿病小鼠心肌纖維化的研究*

丁利1，宋冰2，張浩強(qiáng)1

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 內(nèi)分泌科，遼寧 錦州 121001）

D O I：10.3969/j.i s s n.1005-8982.2017.03.002

目的探討硫化氫（H2S）對(duì)糖尿病小鼠心肌組織中p38絲裂原活化蛋白激酶（p38M APK）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TG F-β1）及Ⅰ型膠原蛋白（C ol l agenⅠ）表達(dá)的影響，以及對(duì)糖尿病心肌纖維化的保護(hù)作用。方法18只雄性C 57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（N C組）、糖尿病對(duì)照組（ALX組）、H2S治療組（ALX+H2S組），每組6只。采用四氧嘧啶（ALX）200 m g/kg腹腔注射復(fù)制糖尿病小鼠模型；模型復(fù)制成功后，N C組和ALX組每天自由飲用自來水；ALX+H2S組自由飲用濃度為90 μm ol/L的N aH S（H2S供體）溶液。8周后取材，監(jiān)測(cè)空腹血糖、血脂；蘇木精-伊紅染色法觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化；采用W es t ern bl ot檢測(cè)p-p38M APK、TG F-β1及C oll agenⅠ蛋白表達(dá)；實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)p38M APK和TG F-β1m R N A的表達(dá)。結(jié)果與N C組比較，ALX組血糖、血脂升高（P＜0.05），心肌組織膠原表達(dá)量增加，心肌間質(zhì)出現(xiàn)明顯纖維化，p-p38M APK、TG F-β1及C ol l agenⅠ蛋白表達(dá)增高（P＜0.05），p38M APK和TG F-β1m R N A表達(dá)增加（P＜0.05）；糖尿病小鼠經(jīng)H2S干預(yù)，血糖、血脂改善（P＜0.05），心肌間質(zhì)膠原纖維明顯減少，p-p38M APK、TG F-β1及C ol l agenⅠ蛋白表達(dá)下降（P＜0.05），p38M APK和TG F-β1m R N A表達(dá)減少（P＜0.05）。結(jié)論H2S可改善糖尿病小鼠血糖、血脂及心肌纖維化，可能與調(diào)節(jié)p38M APK和TG F-β1的表達(dá)有關(guān)。

硫化氫；糖尿病心肌纖維化；p38絲裂原活化蛋白激酶；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；Ⅰ型膠原蛋白

糖尿病預(yù)計(jì)在世界最常見死亡原因中排第5位[1]。糖尿病心肌病已成為糖尿病相關(guān)發(fā)病率和死亡率的一個(gè)主要原因[2]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（Transf orm i ng growt h f act or-bet a1，TGF-β1）是一種由2條多肽鏈組成的生長(zhǎng)因子，具有多種生物活性。有研究表明，TGF-β1的異常表達(dá)和活化可能參與糖尿病心肌病的發(fā)生和發(fā)展[3]。有證據(jù)表明，TGF-β1在心肌重塑過程中發(fā)揮重要作用，特別是在心肌纖維化中[4]。有研究顯示，在糖尿病腎病中，活化的p38絲裂原活化蛋白激酶（p38-m i t ogen-act i vat ed prot ei n ki nase，p38M APK）可以進(jìn)入到細(xì)胞核，調(diào)控下游代表性致纖維化因子——TGF-β1的表達(dá)及其生物效應(yīng)[5]，最終促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積而形成腎纖維化[6]。硫化氫（hydrogen sul f i de，H2S）可以抑制TGF-β1信號(hào)[7]，且有證據(jù)表明，在各種纖維化相關(guān)疾病中，H2S具有保護(hù)和抗炎作用[8-10]。本實(shí)驗(yàn)欲通過觀察糖尿病小鼠心肌中p38M APK和TGF-β1表達(dá)的變化，探討H2S對(duì)糖尿病心肌纖維化，以及p38M APK和TGF-β1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性C57BL/6J小鼠18只，3周齡，體重11～13 g，購于北京華阜康公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量許可證號(hào)：SCXX（京）[2009-0015]，動(dòng)物飼養(yǎng)在溫度（20～25℃）和濕度（50%～55%）恒定的環(huán)境中，12 h晝/夜循環(huán)照明（7∶00～19∶00）。定期消毒，可以自由獲得水和食物。涉及動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)均按美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的照料和使用指南》要求進(jìn)行。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 四氧嘧啶（Al l oxan，ALX）購于大連美侖科技公司，硫氫化鈉（NaH S）（H2S供體）購于美國(guó)Si gm a公司，脫脂奶粉、TGF-β1和Col l agenⅠ兔抗小鼠抗體購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司，p-p38M APK、β-act i n兔抗小鼠抗體、辣根過氧化物酶（horseradi sh peroxi dase，H RP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購于北京博奧森公司，細(xì)胞核/漿蛋白抽提試劑盒購于弗德生物科技有限公司，聚氰基丙烯酸正丁酯（bi ci nchoni ni c aci d，BCA）蛋白定量試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本TaKaRa公司，定量聚合酶鏈反應(yīng)（pol ym erase chai n react i on，PCR）試劑盒購于韓國(guó)Bi oneer公司，實(shí)時(shí)PCR引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

雅培安妥超越血糖儀購于美國(guó)Abbot t公司，日立全自動(dòng)化學(xué)分析儀購于北京泰林東方商貿(mào)有限公司，日立CF-16RXⅡ型高速冷凍離心機(jī)購于香港天美科技有限公司，徠卡手動(dòng)石蠟切片機(jī)購于北京中儀光科技發(fā)展有限公司，酶標(biāo)分析儀購于南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，BG-power 600電泳儀電源購于北京百晶生物技術(shù)有限公司，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chem i l um i nescence，ECL）化學(xué)發(fā)光自動(dòng)成像分析系統(tǒng)購于日本富士公司，組織勻漿機(jī)購于德國(guó)IKA公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quant i t at i ve real-t i m e pol ym erase chai n react i on，qRT-PCR）儀購于美國(guó)伯樂Bi o-rad公司；PCR擴(kuò)增儀購于美國(guó)伯樂Bi o-rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及糖尿病模型的復(fù)制 動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，18只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為3組（每組6只）：正常對(duì)照組（NC組）、糖尿病對(duì)照組（ALX組）、H2S治療組（ALX+H2S組）。NC組予正常飲食，ALX組、ALX+H2S組予高脂飲食。8周后，ALX組、ALX+H2S組按體重（200 m g/kg）腹腔注射ALX復(fù)制模型，ALX分2次給藥，第1次腹腔注射120 mg/kg，間隔24 h后再次腹腔注射80 m g/kg，為防止低血糖的發(fā)生，4.5～5.0 h后予以50%葡萄糖灌胃，注射藥物72 h后于小鼠尾端斷尾取血，用血糖儀檢測(cè)小鼠禁食12 h的血糖濃度[11]，血糖濃度≥11.1 m m ol/L時(shí)判斷模型復(fù)制成功。ALX+H2S組每天自由飲用濃度為90 μm ol/L的NaH S溶液[12]，換NaH S溶液1次/d；NC組和ALX組予以自來水。實(shí)驗(yàn)持續(xù)8周。

1.3.2 蘇木精 -伊紅染色法（hem at oxyl i n-eos i n s t ai ni ng，H E）染色觀察心肌纖維組織學(xué)變化 取心肌組織，4%多聚甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋、切片后，以H E染色法染色，顯微鏡下觀察攝像。

1.3.3 W es t ern bl ot檢測(cè)p-p38M APK、TG F-β1及C ol l agenⅠ蛋白的表達(dá) 取各組小鼠左心室心肌組織，提取蛋白，采用二喹啉甲酸（bi ci nchoni ni c aci d，BCA）比色法進(jìn)行蛋白定量。配制12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠用于電泳分離蛋白，上樣前蛋白樣品95℃煮5 m i n，每孔組織蛋白上樣量相等，置于電泳緩沖液中電泳，分離目的蛋白。將目的條帶切下，60V濕轉(zhuǎn)膜2 h，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜。用三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液（t ri s buf f ered sal i ne and t ween 20，TBST）配制的5%脫脂奶粉封閉2 h，封閉后用p-p38M APK、TGF-β1及Col l agenⅠ一抗（稀釋比例為1∶100）37℃孵育1 h后4℃過夜。TBST洗膜3次，5 m i n/次，用H RP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（稀釋比例為1∶2 000），37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，5 m i n/次。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chem i l um inescence，ECL）顯色，曝光后掃描，用Im age J圖像分析軟件進(jìn)行光密度分析，以β-act i n為內(nèi)參。

1.3.4 qR T-PC R 檢 測(cè) p38M APK 和 TG F-β1m R N A的表達(dá)水平 取各組左心室心肌組織，按照試劑盒說明書用RNAi so Pl us提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，含SYBR GreenⅠ的Accu PowerR2X Green Star qPCR M ast er M i x進(jìn)行PCR反應(yīng)（見表1）。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃預(yù)變性15 m i n，85℃變性5 s， 4℃退火。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 m i n，95℃變性5s，60℃退火30 s，65～90℃中每1℃都延伸1s，共45個(gè)循環(huán)。用熔解曲線來判斷引物的特異性，用2-△△Ct法對(duì)組織p38M APK和NF-κBp65 m RNA水平進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表1 qRT-PCR引物

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間比較用單因素方差分析，檢驗(yàn)方差齊性，兩組間比較用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血糖、血脂比較

NC組、ALX組及ALX+H2S組空腹血糖（f ast i ng pl asm a gl ucose，F(xiàn)PG）、三酰甘油（Tri gl yceri des，TG）、總膽固醇（total chol est erol，TC）、低密度脂蛋白（l ow densi t y l i poprotei n，LDL）及高密度脂蛋白（hi gh densi t y l i poprot ei n，H DL）比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ALX組與NC組FPG、TG、TC、LDL、H DL比較，經(jīng)q檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q= -11.735、-14.703、-11.811、-12.347和10.883，P= 0.000），ALX組FPG、TG、TC、LDL升高，H DL降低。ALX+H2S組與ALX組FPG、TG、TC、LDL、H DL比較，經(jīng)q檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=11.025、13.019、11.703、9.562和-6.073，P=0.000），ALX+H2S組FPG、TG、TC、LDL降低，H DL升高。見表2。

表2 糖尿病小鼠的血糖、血脂變化 （n=6，m mol/L±s）

表2 糖尿病小鼠的血糖、血脂變化 （n=6，m mol/L±s）

注：1）與NC組比較，P＜0.05；2）與ALX組比較，P＜0.05

組別LDL NC組 9.71±0.13 0.46±0.08 2.65±0.08 1.32±0.05 1.50±0.09 ALX組 15.00±0.121） 1.10±0.081） 3.74±0.061） 1.02±0.041） 2.17±0.091）ALX+H2S組 10.03±0.102） 0.52±0.072） 2.66±0.062） 1.19±0.022） 1.65±0.062）F值 86.589 114.808 92.155 59.501 83.870 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000FPGTGTCH DL

2.2 各組糖尿病小鼠心肌病理形態(tài)學(xué)變化

ALX組與NC組比較，心肌細(xì)胞間隙增寬，心肌纖維排列明顯紊亂，組織膠原表達(dá)量增加，心肌間質(zhì)可見纖維化改變。ALX+H2S組與ALX組比較，細(xì)胞間隙變窄，心肌纖維排列較整齊，結(jié)構(gòu)清晰，膠原表達(dá)量減少，間質(zhì)有少量疏松結(jié)締組織。見圖1。

圖1 各組小鼠心肌組織 （H E×200）

2.3 H2S對(duì)CollagenⅠ、p-p38MAPK及TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

W est ern bl ot檢測(cè)3組小鼠Col l agenⅠ、p-p38 M APK及TGF-β1蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，各指標(biāo)在3組中的表達(dá)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與NC組比較，ALX組小鼠心肌組織Col l agenⅠ、p-p38M APK及TGF-β1蛋白表達(dá)增加（q=-16.900、-8.788和-13.386，P=0.000）。ALX+H2S組與ALX組比較，小鼠心肌組織Col l agenⅠ、p-p38M APK及TGF-β1蛋白表達(dá)減少（q=15.721、12.467和11.354，P=0.000）。見表3和圖2。

表3 糖尿病小鼠CollagenⅠ、p-p38MAPK及TGF-β1蛋白表達(dá)的變化 （n=6±s）

表3 糖尿病小鼠CollagenⅠ、p-p38MAPK及TGF-β1蛋白表達(dá)的變化 （n=6±s）

注：1）與NC組比較，P＜0.05；2）與ALX組比較，P＜0.05

組別TGF-β1NC組 1.8347±0.1926 0.7184±0.0844 0.3541±0.0512 ALX組 3.7118±0.18891）1.1474±0.08571） 0.7521±0.05171）ALX+H2S組 1.9656±0.19222）0.5388±0.09162） 0.4145±0.05152）F值 178.042 82.063 104.073 P值 0.000 0.000 0.000Col l agenⅠp-p38M APK

圖2 H2S對(duì)CollagenⅠ、p-p38MAPK及TGF-β1表達(dá)的影響

圖3 p38MAPK mRNA的相對(duì)表達(dá)

2.4 H2S對(duì)各組小鼠心肌組織中p38MAPK和TGF-β1mRNA表達(dá)的影響

2.4.1 H2S對(duì)心肌組織中p38M APK m R N A表達(dá)的影響 qRT-PCR檢測(cè)p38M APK m RNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，在各組p38M APK m RNA表達(dá)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.981，P=0.005）。與NC組比較，ALX組小鼠心肌組織中p38M APK m RNA表達(dá)增加（q=4.404，P=0.005）；與ALX組比較，ALX+ H2S組小鼠心肌組織中p38M APK m RNA表達(dá)減少（q=-5.017，P=0.002）。結(jié)果提示H2S治療抑制糖尿病小鼠心肌組織p38M APK m RNA的表達(dá)。見圖3。

2.4.2 H2S對(duì)心肌組織中TG F-β1m R N A表達(dá)的影響 qRT-PCR檢測(cè)TGF-β1m RNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，各組TGF-β1m RNA表達(dá)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=26.550，P=0.001）。與NC組比較，ALX組小鼠心肌組織中TGF-β1m RNA表達(dá)增加（q=6.966，P=0.000）；與ALX組比較，ALX+H2S組小鼠心肌組織中TGF-β1m RNA表達(dá)減少（q= -5.336，P=0.002）。結(jié)果提示H2S治療抑制糖尿病小鼠心肌組織TGF-β1m RNA表達(dá)。見圖4。

圖4 TGF-β1mRNA的相對(duì)表達(dá)

3 討論

糖尿病心肌病是獨(dú)立于冠狀動(dòng)脈疾病和高血壓，與糖尿病相關(guān)的心臟結(jié)構(gòu)和功能的相關(guān)改變[13-14]，心血管并發(fā)癥被認(rèn)為是糖尿病患者死亡的首要原因[15]，其中心肌纖維化是在許多不同的心臟疾病條件下發(fā)生的一種常見的病理過程，可以加重心肌僵硬，妨礙心室收縮和舒張功能，最終引發(fā)心力衰竭，甚至猝死[16-17]。有研究顯示，氧化苦參堿通過影響TGF-β1/p38M APK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，減弱相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)，發(fā)揮抑制心肌纖維化作用[18]。TGF-β1是TGF-β超家族的主要亞型，在心臟中由心肌成纖維細(xì)胞、成肌纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞產(chǎn)生。TGF-β1異常增高在心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[19]。TGF-β1可以刺激心肌成纖維細(xì)胞Ⅰ和Ⅲ型膠原纖維及纖聯(lián)蛋白合成增加，分解減少[3]。有研究報(bào)道，TGF-β1是胎鼠心肌成纖維細(xì)胞中膠原產(chǎn)生的強(qiáng)有效的刺激物，且由TGF-β1刺激產(chǎn)生的膠原產(chǎn)物在新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞中大幅高于新生大鼠肺成纖維細(xì)胞[20]。

H2S是一種新型氣體信號(hào)分子，一些研究發(fā)現(xiàn)，H2S在心血管疾病中發(fā)揮多種生物作用[21]，可以改善左心室功能，減輕心肌肥厚和心肌纖維化[14]。在本實(shí)驗(yàn)中，通過H E染色可觀察到經(jīng)H2S治療的糖尿病小鼠，心肌間質(zhì)纖維化明顯減輕。研究發(fā)現(xiàn)，在鏈脲佐菌素處理的糖尿病大鼠中，血漿和心肌組織中H2S水平下降，且每天給予NaH S后可使H2S水平恢復(fù)正常[14]。有研究表明，在四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化模型中，外源性H2S抑制TGF-β1表達(dá)，改善肝纖維化[22]。在輸尿管梗阻引起的腎臟纖維化模型中，H2S的抗纖維化作用與TGF-β1信號(hào)通路下調(diào)有關(guān)，從而減少炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激[7]。

本研究顯示，在糖尿病小鼠心肌中p38M APK和TGF-β1無論在m RNA水平，還是在蛋白水平都有所提高，經(jīng)外源性H2S治療后p38M APK、TGF-β1及Col l agenⅠ表達(dá)減少，膠原重塑得以改善，進(jìn)而改善心肌纖維化。對(duì)于糖尿病引起的心肌纖維化，H2S可能是一種潛在的治療方法。H2S對(duì)糖尿病模型的心肌損傷具有保護(hù)作用，并可抑制糖尿病模型的腎小管間質(zhì)纖維化，但H2S是否與糖尿病心肌病中心肌纖維化的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，以及其是否通過TGF-β1/p38 M APK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響糖尿病小鼠心肌纖維化，尚不十分清楚，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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（童穎丹 編輯）

Hydrogen sulfide influences myocardial fibrosis in diabetic mice by p38MAPK and TGF-β1*

Li Ding1,Bing Song2,Hao-qiang Zhang1
(1.Graduate School,Jinzhou Medical University,Jinzhou,Liaoning 121001,China; 2.Department of Endocrinology,the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University,Jinzhou,Liaoning 121001,China)

ObjectiveTo study the effect of exogenous hydrogen sulfide (H2S)on the expressions of p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)and transforming growth factor-beta1 (TGF-β1)and on the protection of diabetic myocardial fibrosis.MethodsEighteen male adult C57BL/6J mice were randomly divided into normal control group(NC group),diabetes mellitus group(ALX group),and diabetes mellitus treated with H2S group(ALX+H2S group)with six mice in each group.The diabetic mouse model was established by intraperitoneal injection(i.p.)of 200 mg/kg ALX.The mice in the normal control and ALX groups drank tap water freely everyday.The mice of the ALX+H2S group freely drank NaHS (H2S donor)solution at a concentration of 90 μmol/L.After 8 weeks,fasting blood glucose and serum lipid were tested.The pathological changes of myocardial fibers were observed by HE staining.The expressions of p-p38MAPK,TGF-β1and collagenⅠwere detected using Western blot.The expressions of p38MAPK mRNA and TGF-β1mRNA were tested byqRT-PCR.ResultsCompared with the NC group,the fasting blood glucose and serum lipid increased (P＜0.05),the expression of collagen in myocardium increased and there was apparent myocardial interstitial fibrosis;the expressions of p-p38MAPK and TGF-β1proteins and collagenⅠ increased(P＜0.05),the mRNA expressions of p38MAPK and TGF-β1increased(P＜0.05)in the ALX group.After the intervention of H2S,the fasting blood glucose and serum lipid were improved(P＜0.05),the collagen fibers in the myocardial interstitium apparently decreased,the protein expressions of p-p38MAPK,TGF-β1and collagenⅠwere decreased(P＜0.05),the mRNA expressions of p38MAPK and TGF-β1were decreased (P＜0.05).ConclusionsH2S can ameliorate fasting blood glucose,serum lipid and myocardial fibrosis in diabetic mice,which might be related to the regulation of p38MAPK and TGF-β1expressions.

hydrogen sulfide;diabetic myocardial fibrosis;p38 mitogen-activated protein kinase;transforming growth factor-beta1;collagenⅠ

1005-8982（2017）03-0007-06

R 587.1

A

2016-08-01

遼寧省自然科學(xué)基金（No：201602308）；遼寧省博士啟動(dòng)課題（No：20131067）

宋冰，E-m ai l：songbi ng1978@163.com；Tel：0416-4673872