單糖甲基化GC/MS片段定性分析方法

廖洪梅

在對(duì)多糖樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析時(shí)，甲基化方法是一種常用的、非常重要的方法，它可以提供單糖組成和鏈接方式等信息。通常情況下，會(huì)利用質(zhì)譜分析手段對(duì)甲基化衍生物進(jìn)行研究，而氣相質(zhì)譜（GC/MS）由于價(jià)格相對(duì)低廉和完備的數(shù)據(jù)庫(kù)較其他形式的質(zhì)譜在這方面得到了更廣泛的應(yīng)用。多糖樣品經(jīng)過(guò)甲基化、乙?；退夂?，在離子源的裂解效應(yīng)下會(huì)產(chǎn)生諸多的離子片段（或稱(chēng)碎片離子），根據(jù)這些離子片段的質(zhì)核比和豐度等信息可以對(duì)多糖的連接單元進(jìn)行定性分析，為分析多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)提供重要的信息[1]。

構(gòu)成多糖的單糖殘基較常見(jiàn)的有六碳糖、五碳糖、脫氧六碳糖等。由于不少單糖殘基互為同分異構(gòu)體，在甲基化和乙?；幚砗螅苌锪呀猱a(chǎn)生的離子片段極為相似；即便是在單糖殘基不為同分異構(gòu)體的情況下也存在裂解片段相互匹配度較高的情況。這些情況對(duì)定性工作造成了很大的干擾，因此僅依靠數(shù)據(jù)庫(kù)自動(dòng)檢索的定性信息已經(jīng)不能滿(mǎn)足對(duì)多糖中單糖殘基定性分析的需要，應(yīng)依據(jù)理論和經(jīng)驗(yàn)補(bǔ)充定性方法以提高未知物與目標(biāo)物比對(duì)的準(zhǔn)確度。

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC/MS），電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～500。配有NIST或WILLY譜庫(kù)。

1.2 試驗(yàn)條件和方法

純化的多糖樣品經(jīng)甲基化完全后，水解并乙酰化；此衍生化樣品即可進(jìn)行GC/MS分析。具體的試驗(yàn)條件（如采用的甲基化、乙?；椒ǎ┘皻庀嗌V條件的設(shè)定等可根據(jù)試驗(yàn)要求、試驗(yàn)效果自行選擇、確定，試驗(yàn)方法的不同對(duì)最終定性分析不產(chǎn)生影響[2]，但是要嚴(yán)格控制甲基化、乙酰化反應(yīng)不完全產(chǎn)生的副產(chǎn)物對(duì)試驗(yàn)的干擾。

2 結(jié)果與討論

2.1 裂解原理分析

多糖樣品中的單糖殘基一般要在分析前轉(zhuǎn)化成為部分甲基化乙?；a(chǎn)物，在轉(zhuǎn)化過(guò)程中自由羥基被甲基化形成甲氧基，非自由羥基則被乙?；?。

甲氧基分子中的氧原子由于相連甲基的推電子效應(yīng)，非常容易失去電子，在離子源射出的高能電子的攻擊下會(huì)失去一個(gè)電子，衍生化單糖分子成為奇電子離子，失去一個(gè)電子的氧原子則成為游離基中心或電荷中心。下面單糖甲基化產(chǎn)物的裂解過(guò)程以非還原末端葡萄糖 Glc（1→）甲基化產(chǎn)物為例闡述。

2.1.1 游離基中心誘導(dǎo)的α斷裂

如圖1所示，在C3位的甲氧基游離基中心的誘導(dǎo)下，C2與C3之間的鍵斷裂，一個(gè)電子轉(zhuǎn)移與游離基中心未成對(duì)的電子配對(duì)，形成新鍵，并隨之產(chǎn)生一個(gè)較穩(wěn)定的偶電子碎片離子m/z 205。同樣的反應(yīng)原理，C2或C4位甲氧基的氧原子也可以誘發(fā)α斷裂，分別形成較穩(wěn)定的偶電子碎片離子m/z 118（注：C1位以氘標(biāo)記）和 m/z161（見(jiàn)圖 2）。m/z 118，m/z 161和m/z 205被稱(chēng)為母碎片離子，它們反映了分子的裂解途徑。

圖1 α斷裂產(chǎn)生m/z 205，m/z 118示意圖

有些母碎片離子會(huì)進(jìn)一步發(fā)生消除反應(yīng)（elimination reaction ，re），產(chǎn)生次級(jí)碎片離子和穩(wěn)定的中性分子；次級(jí)碎片離子可以再發(fā)生一次消除反應(yīng)生成三級(jí)離子和中性分子。新生成的離子比其前體離子穩(wěn)定，促進(jìn)了反應(yīng)的進(jìn)行。圖2中偶電子碎片離子m/z 161可以通過(guò)丟失一個(gè)甲醇生成m/z 129離子，也可以通過(guò)丟失一個(gè)乙酸分子產(chǎn)生m/z 101離子。同樣，m/z 205離子可以丟失一個(gè)乙酸分子產(chǎn)生m/z145離子。m/z 129可進(jìn)一步產(chǎn)生m/z 87離子和乙烯酮分子，m/z 101可消除一分子的甲醛產(chǎn)生三級(jí)離子 m/z 71，m/z145離子在失去一分子甲醇后會(huì)形成 m/z 113離子碎片，由于m/z 113片段的產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致過(guò)多的雙鍵，所以豐度一般很小。

圖2 α斷裂及消除反應(yīng)示意圖

2.1.2 電荷中心誘導(dǎo)的i斷裂

如下圖3所示，在C2位甲氧基中氧原子所帶正電荷的誘導(dǎo)下，一對(duì)電子完全被正電荷所吸引，造成C2、C3之間的鍵斷裂和電荷的轉(zhuǎn)移，并隨之產(chǎn)生一個(gè)較穩(wěn)定的偶電子碎片離子m/z 205；若i斷裂由C4位的甲氧基誘導(dǎo)，則會(huì)產(chǎn)生m/z 162離子（注：C1位以氘標(biāo)記），斷裂之后都會(huì)隨之產(chǎn)生一個(gè)正電荷從碳原子轉(zhuǎn)移到氧原子的過(guò)程，這種形式的離子會(huì)更穩(wěn)定。在正電荷轉(zhuǎn)移后，母片段離子會(huì)發(fā)生消除反應(yīng)繼而產(chǎn)生次級(jí)離子 m/z 102、m/z 145。三級(jí)碎片離子的產(chǎn)生途徑與α斷裂的相同。若i斷裂由C3位的甲氧基誘導(dǎo)，則會(huì)產(chǎn)生m/z 118離子。

圖3 i斷裂及消除反應(yīng)示意圖

2.1.3 α斷裂與i斷裂的競(jìng)爭(zhēng)

對(duì)于奇電子離子形式的衍生化單糖分子來(lái)說(shuō)，α斷裂要比電荷誘導(dǎo)的i斷裂有更大的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，反映到質(zhì)譜圖中則是α斷裂產(chǎn)生的離子片段具有更大的豐度。如在衍生化Glc（1→3）分子中，同樣是C4位甲氧基誘導(dǎo)的斷裂，α斷裂產(chǎn)生的母離子m/z161及次級(jí)離子m/z 101、m/z 129的豐度就明顯大于i斷裂產(chǎn)生的m/z 189離子的豐度。因此在分析甲基化單糖分子的裂解片段時(shí)，主要考慮α斷裂途徑下產(chǎn)生的母離子片段及其次級(jí)、三級(jí)離子片段。

2.1.4 其他途徑

除了α斷裂與i斷裂外，甲基化單糖分子還可能通過(guò)一些次要的反應(yīng)途徑裂解，其中比較常見(jiàn)的是氫重排反應(yīng)和消除反應(yīng)（奇電子離子分子產(chǎn)生奇電子母片段離子）。正是由于裂解過(guò)程中反應(yīng)機(jī)理的復(fù)雜性和反應(yīng)途徑的隨機(jī)性，導(dǎo)致了同一分子的GC/MS離子片段譜圖之間具有一定的差異性，對(duì)物質(zhì)的定性產(chǎn)生了干擾。

2.2 不同連接方式糖殘基的主要裂解片段[4]

多糖分子中常見(jiàn)中性單糖殘基有五碳糖、六碳糖、脫氧六碳糖等類(lèi)別，每類(lèi)糖殘基都由若干同分異構(gòu)體組成，雖然它們的構(gòu)象不同，但是在甲基化和乙?；螽a(chǎn)生的裂解片段卻基本相同，故表1-3中僅以不同的鏈接方式區(qū)分并按照離子片段的性質(zhì)進(jìn)行了分類(lèi)總結(jié)。

2.2.1 甲基化六碳糖的主要裂解片段

在多糖分子中，主要存在三種六碳糖：葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）和甘露糖（Man），表1對(duì)甲基化六碳糖在不同連接方式下通過(guò)主要裂解途徑產(chǎn)生的離子片段進(jìn)行了歸納總結(jié)。

2.2.2 甲基化五碳糖殘基的主要裂解片段

在多糖分子中，存在三種主要的五碳糖：阿拉伯糖（Ara）、核糖（Rib）和木糖（Xyl），這Ara和Xyl在多糖分子中常以呋喃式或吡喃式兩種形式存在，Rib主要以呋喃形式存在。表2對(duì)甲基化五碳糖在不同連接方式下通過(guò)主要裂解途徑產(chǎn)生的離子片段進(jìn)行了歸納總結(jié)：

表1 甲基化六碳糖的主要裂解片

表2 甲基化化五碳糖的主要裂解片段

2.2.2 甲基化脫氧六碳糖殘基的主要裂解片段

在多糖分子中常見(jiàn)的脫氧糖為六碳脫氧糖，主要為鼠李糖（Rha）、巖藻糖（Fuc），表3對(duì)甲基化脫氧六碳糖在不同連接方式下通過(guò)主要裂解途徑產(chǎn)生的離子片段進(jìn)行了歸納總結(jié)。

表3 甲基化Rha和Fuc的主要裂解片段

2.3 不同類(lèi)型離子片段應(yīng)采用的比對(duì)方法

通常情況下，GC/MS分析產(chǎn)生的結(jié)果可以通過(guò)配套工作站中的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行自動(dòng)比對(duì)，比對(duì)結(jié)果是通過(guò)未知物與目標(biāo)物離子片段的豐度和質(zhì)核比的匹配程度形成的。這種方法在簡(jiǎn)單有機(jī)物的分析上準(zhǔn)確度比較高，而在分析多糖各組分單糖的甲基化衍生物時(shí)卻出現(xiàn)了較大的偏差，如果僅依據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)自動(dòng)比對(duì)的結(jié)果進(jìn)行定性分析，甚至?xí)a(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)論。在利用甲基化單糖裂解后形成的多種離子片段進(jìn)行定性分析時(shí)，應(yīng)根據(jù)碎片離子不同的類(lèi)型采用不同的比對(duì)方法，有些片段要重點(diǎn)考慮豐度的匹配度，而有些則只需考慮質(zhì)核比的匹配度，有些則需要兩者綜合評(píng)價(jià)。

2.3.1 母碎片離子

母碎片離子是分子第一次斷裂產(chǎn)生的，它們顯示了分子裂解的重要信息，由于母片段大多還會(huì)進(jìn)一步的裂解形成二級(jí)片段甚至更高級(jí)別的片段，所以除了 m/z87，m/z117等這些不再裂解的母片段外，豐度的大小往往會(huì)由于儀器或?qū)嶒?yàn)條件的變化而有所不同，故豐度的匹配度可以不加考慮；相反，母片段的質(zhì)核比的匹配度卻很重要。由于母片段的產(chǎn)生反映了分子的裂解方式，母片段不同則表明未知物與目標(biāo)物的裂解方式不同，即未知物與目標(biāo)物非同一分子，一定要 100%匹配，才能對(duì)未知物進(jìn)行初步認(rèn)定。應(yīng)當(dāng)特別注意的是，有些母片段離子的豐度較低，如m/z233、m/z261等，在進(jìn)行未知物與目標(biāo)物的比對(duì)時(shí)容易被忽略而造成誤判。

2.3.2 次級(jí)碎片離子

母碎片離子會(huì)按照比較固定的幾種模式進(jìn)一步裂解，形成次級(jí)碎片離子以及更高級(jí)片段，優(yōu)勢(shì)裂解途徑產(chǎn)生的次級(jí)片段將有較高的豐度，若次級(jí)片段質(zhì)核比相同但豐度差別較大則意味著是由不同的裂解途徑產(chǎn)生的。因此在比對(duì)這類(lèi)片段時(shí)，要在質(zhì)核比匹配的前提下考慮豐度的匹配度。如m/z129是很多單糖衍生物裂解后都會(huì)產(chǎn)生的次級(jí)片段，但是在有的產(chǎn)物片段中豐度很高如 Glc（1→）中，在有的產(chǎn)物片段如Glc（1→4）中豐度則不大，所以在做比對(duì)時(shí)應(yīng)區(qū)別對(duì)待，不能只考慮質(zhì)核比的匹配程度。

2.3.3 高級(jí)碎片離子

高級(jí)碎片離子是指次級(jí)裂解片段進(jìn)一步裂解產(chǎn)生的三級(jí)或三級(jí)以上裂解片段，這些片段的質(zhì)核比大多不大，在對(duì)比中的作用主要是對(duì)推導(dǎo)的裂解方式進(jìn)行驗(yàn)證。由于離子片段在裂解過(guò)程中會(huì)有多種裂解途徑并會(huì)受到偶然因素的影響，所以不同的實(shí)驗(yàn)條件下產(chǎn)生的高級(jí)裂解片段往往會(huì)在質(zhì)核比和豐度上有所差異，比對(duì)這類(lèi)片段時(shí)，在豐度和質(zhì)核比的匹配度上都可不做太高要求，只要主要的、豐度較高的高級(jí)碎片離子能夠匹配即可認(rèn)定（詳見(jiàn)表 1-3），沒(méi)有必要要求未知物和目標(biāo)物的每個(gè)高級(jí)片段都有對(duì)應(yīng)。

2.3.4 特征碎片離子（特征片段）

某些一級(jí)裂解片段（母碎片離子）的作用比較特殊，可以看作某類(lèi)單糖甲基化衍生物的標(biāo)志性片段，它們對(duì)未知物的正確定性有著極為重要的指示作用；特征母碎片離子裂解產(chǎn)生的典型的次級(jí)裂解片段，利用它們與母特征片段的相互印證關(guān)系可以提高判斷的準(zhǔn)確性，所以依然具有標(biāo)志性意義，故在表中也進(jìn)行了標(biāo)記（詳見(jiàn)表1～3中以星號(hào)標(biāo)記的離子片段）。

特征片段對(duì)正確定性的意義可以通過(guò)下面的例子說(shuō)明：非還原末端Ara和Glc產(chǎn)生的裂解片段中有90%以上的片段無(wú)論是在質(zhì)核比還是在豐度上都非常相似，在數(shù)據(jù)庫(kù)中相互的匹配度很高，區(qū)別是非還原末端 Glc的裂解片段中具有特征片段m/z205，而非還原末端Ara的裂解片段中則不含有此片段。如果在比對(duì)中忽略了特征離子片段進(jìn)行定性，將會(huì)造成極大的困擾，甚至誤判。

3 結(jié)論

在利用 GC/MS對(duì)多糖鏈接方式及鏈接單元進(jìn)行分析時(shí)，可利用保留時(shí)間和隨機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)未知物擬對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物進(jìn)行初步篩選。將匹配度較高的數(shù)個(gè)疑似目標(biāo)物的離子片段分類(lèi)，將其特征片段與未知物的片段質(zhì)核比進(jìn)行比對(duì)，若未知物裂解片段中含有某一目標(biāo)物所有的特征片段，則可進(jìn)行下一輪比對(duì)；若不能完全匹配，則說(shuō)明未知物與目標(biāo)物無(wú)對(duì)應(yīng)關(guān)系。將特征片段匹配的疑似目標(biāo)物的母碎片離子與未知物的離子片段的質(zhì)核比進(jìn)行比對(duì)，完全匹配者再比對(duì)它們之間次級(jí)碎片離子的質(zhì)核比及豐度的匹配度。經(jīng)過(guò)這樣三步篩選后，符合度最高的則為未知物應(yīng)該對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物。

當(dāng)然，GC/MS不是多糖結(jié)構(gòu)分析的唯一手段，對(duì)多糖鏈接單元分析的最終結(jié)果還應(yīng)綜合考慮組分分析、紅外光譜分析、核磁共振分析等分析手段的結(jié)果并進(jìn)行適當(dāng)?shù)男拚?，以提高判定的?zhǔn)確性。

[1] 周鵬,謝明勇,聶少平.茶多糖 TGC結(jié)構(gòu)特征 [J].中國(guó)科學(xué)(C輯:生命科學(xué)),2004,34（2）:178-185.

[2] 張惟杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M].杭州:浙江大學(xué)出版社,1997:11-198.