寨卡病毒及其疫苗研究

田德橋，陳薇

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071

寨卡病毒及其疫苗研究

田德橋，陳薇

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071

陳薇 博士，研究員，博士生導(dǎo)師，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所所長，專業(yè)技術(shù)少將，全國人大代表、全國婦聯(lián)執(zhí)委。長期從事生物防御和生物高技術(shù)研究，領(lǐng)銜的“生物危害防控”國家重點領(lǐng)域創(chuàng)新團隊，在SARS、炭疽、埃博拉等重大疫情防控中，作出了突出貢獻。研發(fā)出世界首個2014基因型埃博拉疫苗，完成了在非洲塞拉利昂的臨床試驗，被評為“2015年度科技創(chuàng)新人物”。兼任全軍生物技術(shù)專業(yè)委員會主任委員、中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會生物安全分會主任委員。在Lancet、Nature Nanotechnology等國際知名期刊發(fā)表多篇學(xué)術(shù)論文。獲“中國十大杰出青年”、“求是”杰出青年獎、中國青年女科學(xué)家獎，入選國家百千萬人才工程、“萬人計劃”領(lǐng)軍人才。

寨卡病毒與黃熱病毒、登革熱病毒、日本腦炎病毒、西尼羅病毒等都屬于蚊媒傳播的黃病毒屬病毒。寨卡病毒分離于1947年，但由于分布區(qū)域有限，所致寨卡熱癥狀較輕，很長一段時間并沒有引起太多的關(guān)注。最近一些年，特別是2015年后，巴西的寨卡疫情暴發(fā)及其與新生兒小頭畸形的關(guān)聯(lián)，引起了全球越來越多的關(guān)注。疫苗是應(yīng)對寨卡疫情的重要手段，目前全球有30余個機構(gòu)在進行寨卡病毒疫苗的研發(fā)。本文綜述了寨卡病毒的生物學(xué)、流行病學(xué)、臨床特征以及當(dāng)前不同類型寨卡病毒疫苗研發(fā)現(xiàn)狀，同時對其他幾種黃病毒屬病毒批準和臨床階段疫苗情況進行了概述，以為相關(guān)研究人員提供參考。

寨卡病毒，黃熱病毒，登革熱病毒，日本腦炎病毒，疫苗

寨卡病毒 (Zika virus) 和黃熱病毒(Yellow fever virus)、登革熱病毒 (Dengue viruses)、日本腦炎病毒 (Japanese encephalitis virus)和西尼羅病毒 (West Nile virus) 等都屬于蚊媒傳播的黃病毒屬病毒。雖然1947年就分離到病毒，但寨卡病毒之前并沒有引起太多的關(guān)注，這一方面是由于其發(fā)病癥狀較輕微，再有是分布區(qū)域有限。但根據(jù)世界衛(wèi)生組織 (WHO)公布的數(shù)據(jù)，自2007年以來，截至2016年11月2日，有73個國家或地區(qū)發(fā)生蚊媒傳播的寨卡病毒感染，26個國家或地區(qū)存在與寨卡病毒感染相關(guān)的新生兒小頭畸形，19個國家或地區(qū)存在與寨卡病毒感染相關(guān)的格林巴利綜合征病例數(shù)增加[1]。根據(jù)泛美衛(wèi)生組織 (PAHO) 的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，截至2016年11月2日，美洲地區(qū)2015到 2016年間的寨卡病毒本地感染疑似病例數(shù)51.5萬例，確診病例16.8萬例[2]。世界衛(wèi)生組織2016年2月1日宣布寨卡病毒為全球緊急公共衛(wèi)生事件。并且，寨卡病毒所致寨卡熱有進一步全球蔓延的趨勢。2016年11月，《柳葉刀·傳染病》期刊刊登的一項研究列出了 8個寨卡病毒傳播風(fēng)險最大的亞洲和非洲國家，印度和中國排在前兩位[3]。

疫苗是感染性疾病應(yīng)對至關(guān)重要的一種手段，近些年包括SARS、H1N1流感、埃博拉出血熱等新發(fā)和再發(fā)傳染病疫情發(fā)生后，全球很多機構(gòu)都開展了相應(yīng)的疫苗研發(fā)，寨卡病毒也不例外。當(dāng)前全球有近30個研究機構(gòu)正在進行寨卡病毒疫苗研發(fā)。寨卡病毒疫苗研發(fā)是一項具有挑戰(zhàn)性的工作，黃病毒屬的其他幾種病毒有些已有批準的疫苗，有些雖進行了多年的研發(fā)，但尚沒有批準的人用疫苗。

本文在對寨卡病毒生物學(xué)特征、流行情況及臨床特征概述的基礎(chǔ)上，重點分析了當(dāng)前全球寨卡疫苗研發(fā)現(xiàn)狀，并對其他幾種黃病毒屬病毒疫苗的研發(fā)歷史與現(xiàn)狀進行了綜述。

1 Zika病毒概述

1.1 生物學(xué)

寨卡病毒按病毒學(xué)分類屬于黃病毒科(Flaviviridae) 的黃病毒屬 (Flavivirus)。黃病毒科病毒主要感染哺乳類動物，為單股線型RNA，包括 3個病毒屬：黃病毒屬、瘟病毒屬(Pestivirus) 和丙型肝炎病毒屬 (Hepacivirus)。黃病毒屬包括黃熱病毒、登革熱病毒、日本腦炎病毒、西尼羅病毒、蜱傳腦炎病毒 (Tick-borne encephalitis viruses)和寨卡病毒等。

黃熱病毒分布于南美洲和非洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)，由埃及伊蚊Aedes aegypti傳播。世界衛(wèi)生組織估計黃熱病毒每年導(dǎo)致20萬病例，3萬人死亡，其中大多數(shù)在非洲[4]。

登革熱病毒分布于亞洲、太平洋、美洲、非洲的至少 100多個國家，由埃及伊蚊和白紋伊蚊Aedes albopictus傳播，有4種血清型?，F(xiàn)在全球大約25億人口生活在登革熱流行區(qū)域。世界衛(wèi)生組織估計每年有5 000萬到1億的感染者，導(dǎo)致2.2萬人死亡。

日本腦炎病毒分布于亞洲和西太平洋地區(qū)，三帶喙庫蚊Culex tritaeniorhynchus是主要傳播媒介。日本腦炎每年可導(dǎo)致大約67 900病例，20 400人死亡[4]。

蜱傳腦炎病毒在自然界的一些哺乳動物，尤其是嚙齒動物間傳播，蜱蟲為傳播媒介。蜱傳腦炎病毒包括3種基因型：歐洲型 (TBEV-Eu)，分布于整個歐洲地區(qū)；遠東型 (TBEV-Fe)，分布于中國、日本和俄羅斯東部；西伯利亞型(TBEV-Si)，分布于西伯利亞和俄羅斯的一些地區(qū)。蜱傳腦炎在全球每年大約有6 000至12 000的報告病例，各型的病死率分別為 TBEV-Fe≥20%，TBEV-Si 6%–8%，TBEV-Eu 1%–2%[4]。

西尼羅病毒廣泛分布于非洲、歐洲、亞洲、澳大利亞和美洲地區(qū)，主要通過庫蚊傳播，可感染人和馬等。在美國，1999到2012年間，有3.7萬西尼羅病毒病例發(fā)生，其中1 549人死亡，病死率為4.2%[5]。

寨卡病毒1947年在烏干達的猴體內(nèi)分離，1948年從同一地區(qū)的非洲伊蚊 Aedes africanus分離到病毒[6]。2007年之前，雖然寨卡病毒分布于非洲和亞洲的一些地區(qū)，但在全球范圍內(nèi)僅有14例報道病例，其中13例自然感染，1例實驗室感染[6]。

寨卡病毒是有包膜的球狀病毒，屬于蚊媒傳播的黃病毒屬病毒，斯龐德溫尼病毒血清群。伊蚊的很多型具有潛在傳播寨卡病毒的能力，但埃及伊蚊和白紋伊蚊由于分布區(qū)域廣受到廣泛關(guān)注[6]。

寨卡病毒和其他黃病毒一樣，為單股正鏈RNA，長 11 kb，基因組編碼一個開放讀碼框(Open reading frame, ORF)，包括3種結(jié)構(gòu)單位和7種非結(jié)構(gòu)蛋白 (圖1)[6-7]。黃病毒結(jié)構(gòu)蛋白包括核衣殼蛋白C、包膜糖蛋白E和prM/M，E蛋白與病毒進入、組裝、出芽有關(guān)，是中和抗體首要的目標蛋白，幾乎所有針對黃病毒屬病毒的疫苗都包括 E抗原[4]。非結(jié)構(gòu)蛋白 (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5) 參與病毒的復(fù)制、組裝等[7]。NS1蛋白是寨卡病毒一個重要的致病因子[8]。

黃病毒屬病毒通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進入細胞，形成內(nèi)體，此后病毒膜與內(nèi)體發(fā)生 pH依賴的膜融合。病毒基因組釋放入細胞質(zhì)，在宿主細胞翻譯系統(tǒng)作用下進行蛋白翻譯。病毒基因組編碼多聚蛋白 (大約 3 400個氨基酸)。多聚蛋白被宿主蛋白酶和病毒編碼的 NS2B/NS3蛋白酶切割成 3個結(jié)構(gòu)蛋白和 7個非結(jié)構(gòu)蛋白。病毒非結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒復(fù)制。在病毒出芽前，prM蛋白被細胞絲氨酸酶切割，成為M蛋白。感染性病毒顆粒通過胞吐作用釋放[7](圖2)。研究表明磷脂酰絲氨酸受體AXL是寨卡病毒進入細胞過程中一種重要的受體[9]。

圖1 黃病毒屬病毒基因組結(jié)構(gòu)[6-7]Fig. 1 Genome structure of Flavivirus[6-7].

圖2 黃病毒屬病毒生命周期[7]Fig. 2 Life cycle of Flavivirus[7].

基于蛋白質(zhì)和核酸序列分析，寨卡病毒至少包括兩個主要的遺傳譜系：非洲譜系和亞洲譜系[10]。寨卡病毒被認為主要在自然界中的非人靈長類和蚊媒之間叢林傳播，人偶爾感染，也可在人群之間傳播[6]。寨卡病毒主要通過感染的蚊媒叮咬在人群中傳播，但也存在性傳播、母嬰傳播、輸血傳播的可能性[11]。

1.2 流行情況

寨卡病毒首先分離于 1947年烏干達的獼猴，1948年從非洲伊蚊分離到病毒。隨后在非洲、印度和東南亞地區(qū)人群中檢測到寨卡病毒抗體[12]。人感染寨卡病毒首先發(fā)現(xiàn)于1953年的尼日利亞。1966年首次在亞洲馬來西亞的埃及伊蚊分離到寨卡病毒。

在非洲和亞洲以外，2007年首次在西太平洋的Yap島暴發(fā)了寨卡疫情。在這次暴發(fā)中，有49例確診和59例疑似的寨卡病毒感染病例[13]。Yap島的寨卡疫情暴發(fā)之后，在東南亞地區(qū)有寨卡病毒感染零星病例，如2010年在柬埔寨、2012年在菲律賓發(fā)現(xiàn)寨卡病毒感染病例。

2013年10月，在法屬波利尼西亞群島暴發(fā)寨卡疫情。一年時間內(nèi)，有1.9萬疑似病例[14]。序列分析表明在波利尼西亞的寨卡病毒與 2010年在柬埔寨，2007年在Yap島的病毒序列類似，屬于亞洲譜系。隨后的序列分析表明，其較Yap島的病毒株，更加接近于在東南亞的病毒株[6]。本次疫情感染了當(dāng)?shù)?66%的居民。并且，2013年11月到2014年2月間有42例格林巴利綜合征的發(fā)生，而在整個2012年只有3例[14]。

此后，寨卡病毒在南太平洋地區(qū)傳播。最早證實的寨卡病毒在美洲出現(xiàn)于2014年末，在巴西東北部，并在巴西迅速傳播[15]。進化分析表明，導(dǎo)致該暴發(fā)的病毒株來源于南太平洋地區(qū)，屬于亞洲譜系[16]。到2016年6月，在美洲地區(qū)有超過35個國家報道了寨卡病毒的地區(qū)傳播[17]。

1.3 臨床特征

寨卡病毒感染癥狀較輕，一般在感染6 d后發(fā)病，95%的感染者在11 d內(nèi)發(fā)病[12]。在Yap島報告的31例確診病例中，主要癥狀包括：斑丘疹 (90%)、發(fā)熱 (65%)、關(guān)節(jié)痛或關(guān)節(jié)炎(65%)、非化膿性結(jié)膜炎 (55%)、肌痛 (48%)、頭痛 (45%)、眼窩疼痛 (39%)、水腫 (19%)和嘔吐 (10%) 等[13]。

在波利尼西亞的感染者大約出現(xiàn)70例格林巴利綜合征[18]，其他一些嚴重癥狀包括腦膜腦炎、脊髓炎等。在波利尼西亞，寨卡疫情暴發(fā)期間，格林巴利的發(fā)生率為2.4×10–4[14]，而美國每年的發(fā)生率為1.8×10–5[19]。

另外，巴西的寨卡疫情暴發(fā)與新生兒小頭畸形病例數(shù)增加相關(guān)聯(lián)，較之前增加了20倍[20]。從寨卡病毒出現(xiàn)到2016年5月7日，在巴西有7 438例疑似小頭畸形病例報告，而在暴發(fā)前每年的病例數(shù)少于200例[21]。動物模型研究進一步證實了小頭畸形與寨卡病毒感染的關(guān)聯(lián)[22-23]。

2 Zika疫苗研究進展

疫苗是應(yīng)對寨卡疫情的重要手段。目前，全球有近30個研究機構(gòu)在進行寨卡疫苗的研發(fā)(表1)。

2.1 滅活疫苗

病毒類滅活疫苗是一種經(jīng)典的疫苗形式，也是一種易于快速研發(fā)和制備的有效疫苗。過去的經(jīng)驗表明，一旦有病毒性傳染病發(fā)生時，人

們在考慮研發(fā)病毒疫苗時，優(yōu)先選擇的是滅活疫苗[24]。病毒類滅活疫苗是指病毒經(jīng)適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM行批量培養(yǎng)、滅活和處理之后制備而成的。

表1 寨卡病毒疫苗研發(fā)現(xiàn)狀Table 1 Zika virus vaccine research and development

日本腦炎病毒分離于1935年，第一種日本腦炎疫苗是一種鼠腦來源的滅活疫苗，1954年在日本研發(fā)[4]。鼠腦來源疫苗在韓國、印度、中國、泰國、越南等地生產(chǎn)[4]。由于鼠腦細胞疫苗潛在的安全問題，細胞培養(yǎng)的疫苗被研發(fā)。2009年，兩種Vero細胞來源的滅活疫苗被批準。其中IXIARO由奧地利Intercell AG公司 (現(xiàn)屬于法國 Valneva SE公司) 研發(fā)，JEBIKV由日本BIKEN公司研發(fā)[4]。另外一種Vero細胞來源的滅活疫苗ENCEVAC由日本Kaketsuken研究所研發(fā)，2011年獲得批準[4]。

蜱傳腦炎病毒在1937年被分離。第一個蜱傳腦炎疫苗FSME-IMMUN由奧地利Baxter AG公司研發(fā)，是雞胚細胞來源的滅活疫苗，在奧地利 1976年被批準[4]。FSME-IMMUN主要針對TBEV-Eu[4]。Encepur由Chiron Behring公司研發(fā)，現(xiàn)屬于瑞士諾華公司，為雞胚細胞來源的滅活疫苗，疫苗株來源于TBEV-Eu，1991年批準，主要針對 TBEV-Eu[4]。另外兩種疫苗在俄羅斯和前蘇聯(lián)一些共和國使用。TBE-Moscow由俄羅斯脊髓灰質(zhì)炎和腦炎研究所研發(fā)，也是一種雞胚來源的滅活疫苗，針對TBEV-Fe，1982年批準。EnceVir由俄羅斯Microgen公司研發(fā)，同樣是雞胚來源的滅活疫苗，2001年批準，針對TBEV-Fe[4]。

登革熱病毒 4價滅活疫苗由葛蘭素史克(GSK) 以及美國華爾特里德陸軍研究所(WRAIR) 聯(lián)合研發(fā)，病毒在Vero細胞培養(yǎng)，在美國和波多黎各完成了Ⅰ期臨床試驗[4]。

第 1種批準的獸用西尼羅病毒疫苗 WEST NILE-INNOVATOR是一種滅活疫苗，由美國Dodge Animal Health研發(fā)，2001年批準。

雞蛋培養(yǎng)來源的黃熱病毒減毒活疫苗存在一定的副作用。為此，Vero細胞來源的滅活疫苗被研發(fā)。XRX-001是一種黃熱病毒滅活疫苗，由美國Xcellerex公司研發(fā)，Vero細胞培養(yǎng)，β丙內(nèi)酯滅活，該疫苗完成了Ⅰ期臨床試驗[25]。

華爾特里德陸軍研究所基于其他黃病毒屬病毒滅活疫苗的研發(fā)經(jīng)驗和技術(shù)進行了寨卡病毒滅活疫苗研究。病毒株P(guān)RVABC59來源于波多黎各。在小鼠試驗中，小鼠接受疫苗的單次肌肉和皮下注射。經(jīng)檢測，肌肉注射的小鼠較皮下注射的小鼠抗體滴度高。在疫苗接種4周后的攻毒試驗中，肌肉注射的小鼠100%觀察到保護作用，皮下注射組有 2只小鼠存在低水平的病毒血癥[26]。在非人靈長類動物實驗中，滅活疫苗免疫了8只恒河猴，在0和4周分別進行皮下疫苗接種，所有的受試恒河猴均產(chǎn)生了特異性的抗體。在寨卡病毒攻毒試驗中，免疫的恒河猴全部產(chǎn)生了保護作用，在血液、尿液等中未檢測到病毒[27]。2016年7月，法國賽諾菲·巴斯德公司與華爾特里德陸軍研究所達成一項合作研發(fā)協(xié)議，開發(fā)寨卡病毒滅活疫苗。該滅活疫苗Ⅰ期臨床試驗計劃在2016年年底進行。

法國Valneva公司2016年7月宣布其正在研發(fā)一種滅活的針對寨卡病毒的疫苗，其使用與日本腦炎疫苗相同的研發(fā)平臺。Valneva公司的日本腦炎滅活疫苗已經(jīng)被美國 FDA、歐盟等批準。

2016年9月，美國衛(wèi)生與公眾服務(wù)部 (HHS)資助日本武田 (Takeda) 公司在美國伊利諾伊州的子公司1 980萬美元進行寨卡疫苗的研發(fā)，用于在美國的使用。該疫苗是一種滅活疫苗，含有佐劑。Takeda是日本最大的制藥公司，具有登革熱病毒、基孔肯亞病毒、諾瓦克病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒和大流行流感病毒的疫苗研發(fā)基礎(chǔ)。

Bharat Biotech 位于印度的海得拉巴(Hyderabad)，其開展了包括滅活疫苗在內(nèi)的寨卡病毒疫苗研究。

巴西免疫生物技術(shù)研究所 (Bio-Manguinhos)屬于奧斯瓦爾多·克魯斯基金會 (Oswaldo Cruz Foundation，F(xiàn)iocruz)，成立于1976年，致力于發(fā)展疫苗和生物制品。2001年，該研究所通過了世界衛(wèi)生組織作為其提供黃熱疫苗的預(yù)認證。Bio-Manguinhos正在開展寨卡病毒滅活疫苗的研究。

Instituto Butantan是巴西免疫生物制品研發(fā)、生產(chǎn)的一個主要機構(gòu)，其正在開展寨卡病毒滅活疫苗研究。

美國NewLink公司2005年成立，2014年其與默克公司合作進行了埃博拉疫苗的研究。NewLink計劃進行寨卡病毒滅活疫苗的研發(fā)。

2.2 減毒活疫苗

減毒活疫苗是病毒疫苗研發(fā)的一個重要方向。防病效果較好的痘苗 (天花疫苗)、麻疹疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗以及腮腺炎、風(fēng)疹、水痘等疫苗均屬于減毒活疫苗。減毒活疫苗接種次數(shù)少，獲得的免疫力較持久[24]。

黃熱病毒1927年分離，此后開始疫苗的研發(fā)[4]。研究人員在英國 (1928年)、巴西 (1929年) 和法國 (1931年) 等進行了滅活疫苗的一些嘗試，但均不能產(chǎn)生足夠的保護作用。17D疫苗是黃熱病毒減毒活疫苗，從加納的一名患者分離獲得，該病毒株在鼠胚組織傳代18代，雞胚組織傳代58代，去除腦和神經(jīng)組織的雞胚傳代100代，在176代被命名為17D。1937年，17D疫苗開始在人體進行試驗。當(dāng)前，17D疫苗有3個亞株用于疫苗生產(chǎn)，17D-204疫苗幾乎在全球各個國家使用，17DD疫苗在巴西使用，德國的羅伯特科赫研究所在20世紀 80年代建立了 17D-204的 1個新的病毒種，被稱為17D-213[28]。17D-204疫苗在法國、塞內(nèi)加爾、美國、荷蘭、英國、德國、印度和中國生產(chǎn)，17DD疫苗在巴西和哥倫比亞生產(chǎn)，17D-213疫苗在尼日利亞和俄羅斯生產(chǎn)[28]。我國批準的黃熱病毒減毒活疫苗由北京天壇生物制品股份有限公司生產(chǎn)，毒種源自17D-204株。

1988年，一種減毒的日本腦炎 (乙型腦炎)疫苗在中國研發(fā)成功，其替代了1968年以來使用的地鼠腎來源的滅活疫苗[4]。該疫苗株病毒SA14-14-2的母株SA14是1954年從西安一種庫蚊幼蟲分離得到的，在小鼠腦內(nèi)傳代11代，在地鼠腎細胞傳代 100代，以及在小鼠腹腔、乳鼠皮下傳代等獲得。對 SA14-14-2弱毒株和強毒株的基因分析顯示，兩者之間存在 57-66個核苷酸差別，導(dǎo)致24-31個氨基酸發(fā)生改變，其中以外膜E蛋白突變率最高，有8個氨基酸發(fā)生了突變。經(jīng)試驗證實該 8個氨基酸突變與毒力減弱密切相關(guān)。該乙型腦炎減毒活疫苗1989年獲新藥證書并由成都生物制品研究所生產(chǎn)。該疫苗除在國內(nèi)大規(guī)模應(yīng)用外，近年來已出口到韓國、尼泊爾、印度和泰國等國。大量人群應(yīng)用后表明疫苗十分安全[24]。該疫苗于2013年10月9日通過了世界衛(wèi)生組織的預(yù)認證。

對于登革熱病毒，之前存在的針對一種血清型的抗體可以加重另外一種血清型登革熱病毒感染的癥狀，這種機制稱為抗體依賴的感染增強效應(yīng) (Antibody-dependent enhancement, ADE)[29]。流行病學(xué)研究表明首次感染一種登革熱病毒血清型后，再感染另外一種血清型后的嚴重病理反應(yīng)是首次感染的15-80倍[4]。因此有效的登革熱疫苗應(yīng)當(dāng)是 4價疫苗。第1種進入臨床試驗的 4價登革熱疫苗是一種傳統(tǒng)的減毒疫苗，由泰國瑪希隆大學(xué) (Mahidol University)研發(fā)，后授權(quán)給賽諾菲·巴斯德公司。其在狗和猴的腎臟細胞進行傳代減毒。另一種傳統(tǒng)的減毒活疫苗由美國華爾特里德陸軍研究所研發(fā)，授權(quán)給葛蘭素史克公司，在狗腎細胞和猴肺細胞傳代減毒。這些疫苗單價使用時可以產(chǎn)生很好的免疫效果，但是當(dāng)這些疫苗 4價使用時，之間的干擾是面臨的一個巨大問題[4]。因此，賽諾菲·巴斯德的疫苗Ⅱ期臨床試驗終止[4]。葛蘭素史克的疫苗當(dāng)前處于Ⅱ期臨床試驗階段。

目前，對于寨卡病毒疫苗沒有傳統(tǒng)的減毒活疫苗研發(fā)報道。

2.3 嵌合病毒疫苗

基因工程技術(shù)可以發(fā)展嵌合病毒疫苗，如賽諾菲·巴斯德公司針對登革熱的 Dengvaxia疫苗，其包括登革熱各種血清型來源的prM/E基因，替代黃熱病毒疫苗株YFV-17D的相應(yīng)基因[30]。賽諾菲·巴斯德公司的嵌合病毒登革熱疫苗三期臨床實驗在拉丁美洲的巴西、哥倫比亞、墨西哥、洪都拉斯、波多黎各等地以及亞洲的印度尼西亞、馬來西亞、菲律賓、泰國、越南等地進行。2015年，墨西哥和菲律賓先后批準了該疫苗，使其成為全球第 1個批準的登革熱疫苗。截至2016年6月，該疫苗已經(jīng)被墨西哥、菲律賓、巴西、薩爾瓦多、哥斯達黎加等5個國家批準，世界衛(wèi)生組織也推薦在登革熱流行地區(qū)使用該疫苗。另外一種登革熱嵌合病毒 4價疫苗DENVax由美國CDC、美國Viragen公司、日本Takeda公司聯(lián)合研發(fā)，其使用減毒的2型登革熱病毒株作為疫苗骨架，其他登革熱血清型的prM/E基因代替登革熱2型減毒株的相應(yīng)基因[4]。該疫苗的Ⅱ期臨床試驗在波多黎各、哥倫比亞、新加坡和泰國進行。

日本腦炎嵌合病毒疫苗由賽諾菲·巴斯德公司研發(fā)，其包含日本腦炎病毒的 prM/E基因，替代了黃熱病毒疫苗株YFV-17D的相應(yīng)基因，用Vero細胞培養(yǎng)。2010年，該疫苗在澳大利亞和泰國獲得批準[4]。

賽諾菲·巴斯德公司基于黃熱病毒疫苗株YFV-17D研發(fā)的西尼羅病毒嵌合病毒疫苗表達西尼羅病毒的prM/E基因[31]，完成了Ⅱ期臨床試驗。美國過敏與感染性疾病研究所 (NIAID)研發(fā)的西尼羅病毒嵌合病毒疫苗基于 4型登革熱病毒骨架，表達西尼羅病毒prM和E蛋白，完成了Ⅰ期臨床試驗[5]。

NIAID與巴西的Butantan研究所合作，正在研發(fā)一種寨卡病毒減毒活疫苗，其基于嵌合疫苗技術(shù)，將寨卡病毒保護性抗原嵌合入登革熱病毒疫苗株。

2.4 核酸疫苗

核酸疫苗是指使用能夠表達抗原的基因本身，即核酸制成的疫苗。核酸疫苗的顯著特點是疫苗制劑的主要成分不是基因表達產(chǎn)物，而是基因本身[24]。目前已有常規(guī)技術(shù)很難研制的3種獸用DNA疫苗上市，包括2005年美國農(nóng)業(yè)部批準的輝瑞公司下屬的 Fort Dodge Animal Health公司研發(fā)的西尼羅病毒DNA疫苗等[24]。

美國海軍醫(yī)學(xué)研究中心和Vical Inc公司聯(lián)合研發(fā)的 D1ME100是一種包含登革熱病毒prM/E基因的單價登革熱DNA疫苗，已完成了Ⅰ期臨床試驗。

目前，沒有批準的人用西尼羅病毒疫苗。第 1個進入臨床試驗的人用西尼羅病毒疫苗是一種DNA疫苗，其編碼西尼羅病毒的 prM和Env蛋白，由加利福尼亞Vical公司和NIAID聯(lián)合研發(fā)，開展了Ⅰ期臨床試驗[32]。

美國 Inovio公司和韓國 Gene One Life Science公司合作開發(fā)寨卡病毒 DNA 疫苗GLS5700，其針對寨卡病毒包膜prM和E蛋白。Inovio公司2016年2月宣布該疫苗在小鼠試驗取得了很好的效果，5月宣布其在猴的實驗中取得了很好的效果，在兩劑疫苗接種后，所有的受試猴血液中均檢測到特異的抗體。該DNA疫苗在2016年6月份獲得FDA 批準進行人體試驗。在40人的臨床試驗中，主要試驗該疫苗的不同劑量，評價安全性、免疫原性。Inovio公司基于電穿孔的DNA遞送設(shè)備Cellectra將被用于疫苗接種。2016年8月29日，Inovio宣布將在波多黎各開始160人的寨卡疫苗臨床試驗。

NIAID研發(fā)的寨卡病毒DNA疫苗在小鼠和恒河猴動物試驗中表現(xiàn)出了很好的效果。該疫苗來源于巴西的寨卡病毒分離株 (BeH815744)，采用prM-Env作為疫苗抗原，但缺失了prM起始端的93個氨基酸序列，該序列在病毒自然感染過程中被切除[33]。該疫苗2016年8月開始在美國國立衛(wèi)生研究院 (NIH) 疫苗研究中心、馬里蘭大學(xué)和埃默里大學(xué)開展Ⅰ期臨床試驗。試驗包括80名18–35歲的志愿者，評價了疫苗的安全性和免疫原性。試驗結(jié)果顯示該疫苗安全且可誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)。

哈佛大學(xué)研發(fā)的寨卡病毒DNA疫苗基于巴西來源寨卡病毒株 (BeH815744)，在小鼠試驗中，小鼠接受單劑的含有寨卡病毒 prM-Env成分的DNA疫苗肌肉接種，3周后檢測到較高的抗體滴度。在免疫 4周后進行寨卡病毒攻毒試驗。疫苗接種的小鼠具有100%的保護，未發(fā)現(xiàn)病毒血癥[26]。在非人靈長類動物試驗中，該DNA疫苗免疫了12只恒河猴，疫苗在0和4周進行肌肉注射，所有受試恒河猴均檢測到特異性中和抗體。在攻毒試驗中，疫苗對所有的受試猴均產(chǎn)生保護作用[27]。

NIAID在2016年7月宣布與葛蘭素史克合作發(fā)展一種基于甲病毒的自復(fù)制寨卡病毒mRNA疫苗。DNA疫苗需要進入細胞核，而mRNA疫苗僅需要進入細胞質(zhì)。

馬薩諸塞州劍橋的Moderna Therapeutics公司研發(fā)的寨卡病毒疫苗是基于mRNA的疫苗，可以通過機體產(chǎn)生免疫原性蛋白，刺激機體的免疫系統(tǒng)。2016年9月，美國生物醫(yī)學(xué)高級研究與發(fā)展計劃局 (BARDA) 與 Moderna Therapeutics公司簽訂了820萬美元的合同，加速寨卡疫苗的研發(fā)。根據(jù)4年的合同，BARDA將支持疫苗Ⅰ期臨床試驗。如果進展順利，合同可延長到5年，包括1.255億美元支持Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗。

另外，位于美國西雅圖的感染性疾病研究所 (Infectious disease research institute) 正在開展寨卡病毒 RNA疫苗的研究，該研究得到了NIAID的資助。

2.5 載體疫苗

載體疫苗是指利用微生物作為載體，將保護性抗原基因重組到微生物載體制成的疫苗。根據(jù)在人體內(nèi)繁殖的特點，載體疫苗可分為復(fù)制型和非復(fù)制型兩類。

Meria公司 (現(xiàn)屬于賽諾菲·巴斯德公司)研發(fā)的馬用西尼羅病毒疫苗Recombitek?EquineWNV在2004年獲得批準，其通過金絲雀痘病毒表達西尼羅病毒的prM/E。

奧地利的Themis Bioscience公司正在研發(fā)麻疹病毒載體寨卡病毒疫苗，寨卡病毒相關(guān)抗原基因插入麻疹病毒基因組，麻疹病毒直接將抗原遞送到巨噬細胞和樹突狀細胞產(chǎn)生針對寨卡病毒的免疫反應(yīng)。Themis Bioscience公司有研發(fā)基孔肯雅病毒和登革熱病毒疫苗的經(jīng)驗，其麻疹疫苗載體技術(shù)平臺從巴斯德研究所獲得授權(quán)。

NIAID正在研發(fā)水泡性口炎病毒 (VSV)作為載體的寨卡病毒疫苗，NIAID用該技術(shù)研發(fā)了埃博拉疫苗。

哈佛大學(xué)進行了52型猴腺病毒載體 (Rhesus adenovirus serotype 52, RhAd 52) 寨卡病毒疫苗的研究，其在非人靈長類動物試驗取得了較好的效果，疫苗免疫了12只恒河猴，1次接種，在 2周后均檢測到特異性中和抗體，免疫4周后進行攻毒試驗，疫苗對所有的受試猴均產(chǎn)生保護作用[27]。

英國 Jenner研究所的寨卡病毒疫苗通過猿腺病毒載體 (Simian adenoviral vector) 表達寨卡病毒結(jié)構(gòu)蛋白。猿腺病毒載體疫苗較人腺病毒載體疫苗的優(yōu)勢在于針對載體的人群預(yù)存免疫較弱。另外 Jenner研究所的猿腺病毒載體寨卡病毒疫苗在人體內(nèi)不復(fù)制，其復(fù)制作用的基因被寨卡病毒的結(jié)構(gòu)蛋白所代替。

澳大利亞 Sementis公司使用復(fù)制缺陷的痘苗病毒載體平臺研發(fā)疫苗，其將病原體抗原插入到復(fù)制缺陷的痘苗病毒載體。當(dāng)前，其正在利用該技術(shù)進行寨卡病毒疫苗的研發(fā)。

美國康涅狄格大學(xué)也正在開展基于復(fù)制缺陷型痘苗病毒載體的寨卡病毒研究，該研究獲得了NIAID的資助。

2.6 亞單位疫苗

基因工程亞單位疫苗是指將基因工程表達的蛋白抗原純化后制成的疫苗。至今，正在研發(fā)的人用基因工程亞單位疫苗至少有幾十種，已研制成功并注冊上市的有基因工程乙型肝炎疫苗、基因工程人乳頭瘤疫苗和基因工程戊型肝炎疫苗等[24]。

美國夏威夷生物技術(shù)公司 (現(xiàn)屬于默克公司) 成立于1982年，位于檀香山。夏威夷生物技術(shù)公司用昆蟲細胞表達重組蛋白。當(dāng)前研發(fā)的疫苗包括西尼羅病毒疫苗、蜱傳腦炎疫苗、寨卡病毒疫苗、剛果克里米亞出血熱病毒疫苗和基孔肯雅病毒疫苗。夏威夷生物技術(shù)公司研發(fā)的登革熱疫苗通過果蠅S2細胞表達4種登革熱病毒的全長prM及80%的E蛋白，其優(yōu)點是可以減少不同型疫苗接種的干擾，該疫苗已經(jīng)完成了Ⅰ期臨床試驗[4]。其研發(fā)的西尼羅病毒亞單位疫苗由果蠅S2細胞表達，基于E蛋白，已完成Ⅰ期臨床試驗[5]。目前該公司正在進行寨卡病毒亞單位疫苗的研發(fā)。

Protein Sciences公司位于美國康涅狄格州的梅里登，使用基因工程桿狀病毒昆蟲細胞表達技術(shù)研發(fā)針對流感及其他疾病的疫苗。2013年，美國 FDA批準了其 Flublok流感疫苗。Protein Sciences公司正在與阿根廷Sinergium公司合作進行寨卡病毒疫苗研發(fā)。Sinergium公司提供 Protein Sciences公司研發(fā)生產(chǎn)資金，Sinergium公司獲得該疫苗在阿根廷商業(yè)化的權(quán)利。該疫苗為重組E蛋白疫苗。

VaxInnate公司位于美國新澤西州，進行細菌鞭毛蛋白融合蛋白疫苗研究，其可以刺激機體先天免疫系統(tǒng)。該平臺可以顯著提高疫苗的免

疫原性和有效性。該公司正在 NIAID資助下進行寨卡病毒融合蛋白疫苗研發(fā)。

2.7 病毒樣顆粒疫苗

近年來發(fā)現(xiàn)一些病毒僅表達病毒的部分結(jié)構(gòu)蛋白就可以在細胞內(nèi)裝配成病毒樣顆粒(Virus like particle, VLP)，病毒樣顆粒通常由兩個或更多的蛋白組成，為不含病毒核酸的空殼結(jié)構(gòu)，這種空殼表面有構(gòu)象依賴表位，如果單獨表達這些蛋白往往不能形成這類表位[34]。病毒樣顆粒疫苗具有模擬天然病毒的結(jié)構(gòu)，但是沒有病毒基因組，更為安全[35]。乙肝和人乳頭瘤病毒樣顆粒疫苗已經(jīng)批準，其他正在研發(fā)的病毒樣顆粒疫苗針對的病原體包括流感病毒、細小病毒和諾瓦克病毒等[35]。

美國GeoVax公司2001年成立于喬治亞州亞特蘭大，目前正在進行艾滋病疫苗的Ⅱ期臨床試驗。GeoVax公司使用改良的痘苗病毒載體平臺 (Modified vaccinia virus ankara—virus like particle，MVA-VLP) 進行疫苗研發(fā)。GeoVax研發(fā)的疫苗包括針對 HIV、埃博拉病毒、馬爾堡病毒和拉沙病毒等。2016年 2月，GeoVax宣布與喬治亞大學(xué)和CDC合作基于MVA-VLP疫苗平臺進行寨卡病毒疫苗的研發(fā)。該疫苗在被接種者的細胞表達自組裝非感染的病毒樣顆粒。

2.8 合成肽疫苗

合成肽疫苗是指將化學(xué)合成的多肽作為疫苗，這些多肽序列根據(jù)病毒的保護性抗原設(shè)計。對病毒保護性抗原的生物信息學(xué)分析，可以提供對保護性抗原結(jié)構(gòu)在分子水平上的解析[34]。

美國Replikins公司基于軟件分析技術(shù)研發(fā)寨卡病毒合成肽疫苗。合成肽疫苗可以產(chǎn)生新的、目標特異性的多肽序列，保護作用更為有效，且相對傳統(tǒng)疫苗具有較低的副作用。

另外，2016年6月，BARDA與總部位于馬里蘭州的 Emergent Biosolutions公司簽訂了2 200萬美元為期30個月的合同，進行寨卡病毒疫苗的研究，該疫苗預(yù)計在2017年進行臨床試驗。

3 展望

2015年12月，世界衛(wèi)生組織基于埃博拉疫情應(yīng)對的教訓(xùn)，組織專家討論最需加強應(yīng)對研發(fā)的病原體清單，確定了8種最危險病原體及3種次危險病原體，其中寨卡病毒為 3種次危險病原體之一。

疫苗研發(fā)是應(yīng)對感染性疾病的重要手段，但面臨巨大挑戰(zhàn)，很多新發(fā)及生物威脅病原體目前尚沒有理想的疫苗。這一方面與對病原體特點認識不是非常清楚有關(guān)，同時與一些商業(yè)公司從利潤考慮不愿全力投入研發(fā)有關(guān)[36]。另外疫苗研發(fā)需要進行詳細的安全性和有效性評估，包括大范圍人群接種的風(fēng)險和收益分析。特別是對可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病及具有神經(jīng)致畸效應(yīng)的病原體[37]。

值得慶幸的是，與登革熱疫苗不同，在小鼠的研究表明，雖然存在遺傳差異，但所有的寨卡病毒具有相同的血清型[38]。研究人員從在南美洲地區(qū)感染寨卡病毒的人群中提取血清，將其與實驗室中不同寨卡病毒株混合觀察抗體對病毒的中和作用，結(jié)果表明其可同時中和亞洲譜系以及非洲譜系的寨卡病毒株[38]。這可以避免疫苗研發(fā)中不同型疫苗同時接種相互干擾的問題。

近期，寨卡病毒中和抗體作用位點方面的一些研究進展可以為安全有效的寨卡病毒疫苗研發(fā)提供支持。研究表明，寨卡病毒 E蛋白與其他黃病毒屬病毒的同源性較高[39]。在對登革熱病毒等黃病毒屬病毒 E蛋白的研究中，發(fā)現(xiàn)其存在3個結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域I與病毒入胞的構(gòu)象變化有關(guān)，結(jié)構(gòu)域II與膜融合有關(guān)，結(jié)構(gòu)域III與病毒與細胞受體結(jié)合有關(guān)[40]。結(jié)構(gòu)域III在之前一些黃病毒屬病毒疫苗和抗體研究中被應(yīng)用[41-42]。我國科研人員研究確定了寨卡病毒 E蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)與其他黃病毒屬病毒類似，其具有明確的3個結(jié)構(gòu)域[43]。一些研究認為，寨卡病毒膜蛋白 E的結(jié)構(gòu)域 III是特異性中和抗體的結(jié)合位點，是寨卡病毒抗體和疫苗研發(fā)的重要靶點[44]。另外一些研究表明，針對寨卡病毒 E蛋白結(jié)構(gòu)域 III的抗體中和特異性高，而針對 I/II結(jié)構(gòu)域的抗體可以產(chǎn)生交叉反應(yīng)，中和特性較弱，并且可能與潛在的感染增強有關(guān)[45]。

近期一些研究表明寨卡病毒和登革熱病毒具有共同的中和表位，認為接種登革熱病毒疫苗可能會對寨卡病毒具有保護作用[46]。另外一些體外細胞實驗表明，登革熱病毒的免疫血清與寨卡病毒有交叉反應(yīng)，并且可以產(chǎn)生寨卡病毒抗體依賴的感染增強效應(yīng) (ADE)，表明登革熱病毒抗體具有潛在的增強寨卡病毒復(fù)制的作用。這對于寨卡病毒疫苗研發(fā)帶來了更為復(fù)雜的問題，需要考慮到登革熱病毒與寨卡病毒免疫血清交叉反應(yīng)的問題。包括寨卡病毒疫苗免疫后潛在促進登革熱病毒感染以及登革熱病毒疫苗免疫后潛在促進寨卡病毒感染的作用，需要進一步明確交叉反應(yīng)抗體起到保護作用還是潛在增強病毒的致病性[47-48]。一些研究人員認為登革熱在中美洲和南部美洲地區(qū)流行了超過30年，與當(dāng)前寨卡疫情暴發(fā)可能存在一定的關(guān)聯(lián)[12]。但目前尚無明確的流行病學(xué)證據(jù)表明在當(dāng)前的寨卡疫情中，登革熱病毒抗體的負面作用[49]。對于這個問題需要更為深入的動物模型試驗研究，以及流行病學(xué)研究[50]。我國廣泛接種乙腦疫苗，人群預(yù)存免疫普遍，其對寨卡病毒的感染及疫苗免疫保護作用的影響有必要深入研究。

從本文的分析可以看出能力儲備是新發(fā)傳染病疫苗研發(fā)的關(guān)鍵。當(dāng)前對于寨卡病毒疫苗進行研發(fā)的機構(gòu)，很多之前都有黃病毒屬病毒疫苗研發(fā)基礎(chǔ)或是建立了較為成熟的疫苗研發(fā)平臺?，F(xiàn)在疫苗研發(fā)手段越來越多樣化，在傳統(tǒng)疫苗研發(fā)效果不理想的情況下，必須建立起新型疫苗研發(fā)技術(shù)平臺。

基于寨卡病毒的特點以及既往黃病毒屬其他病毒疫苗的研發(fā)分析，寨卡病毒滅活疫苗、嵌合病毒疫苗應(yīng)該是很有希望獲得成功的疫苗，而載體疫苗、核酸疫苗和亞單位疫苗等的研發(fā)將會進一步推動這些疫苗類型的研發(fā)進步。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Progress in Zika virus and its vaccines

Deqiao Tian, and Wei Chen

Institute of Biotechnology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China

Like Yellow fever virus, Dengue virus, Japanese encephalitis virus and West Nile virus, Zika virus is also a mosquito-borne flavivirus. Since it was isolated in 1947, there has been little concern over Zika virus due to its limited distribution and mild symptoms. In recent years, especially since 2015, Zika virus has become a global concern because of its outbreak in Brazil and associated microcephaly. Vaccines against Zika virus, regarded as the effective measures to control Zika fever epidemic, are being developed in nearly thirty institutions worldwide. In this paper, biology, epidemiology and clinical features of Zika virus were reviewed along with current research and development of different types of Zika vaccines. In addition, several other flavivirus vaccines approved or in clinical trials were briefly introduced, to provide valuable reference for Zika vaccines researchers.

Zika virus, Yellow fever virus, Dengue virus, Japanese encephalitis virus, vaccines

Wei Chen. E-mail: cw0226@foxmail.com

10.13345/j.cjb.160361

Received: September 28, 2016; Accepted: November 8, 2016

Supported by: National Key Technologies Research and Development Emergency Program of ZIKA Epidemic Prevention and Control (2016).

“科技部寨卡疫情防控科技攻關(guān)應(yīng)急專項 (2016)”資助。

時間：2016-11-15

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