固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)與提取酚類生物活性化合物的研究進(jìn)展

何玲霞 張 蕾 許曉玲*

(1. 溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325035；2.浙江省模式生物技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325035)

固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)與提取酚類生物活性化合物的研究進(jìn)展

何玲霞1張 蕾1許曉玲1*

(1. 溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325035；2.浙江省模式生物技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325035)

固態(tài)發(fā)酵(SSF)是一種三相多相的發(fā)酵方法，包括固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)相，其為微生物培養(yǎng)的生物過(guò)程和產(chǎn)品的發(fā)展提供了潛在的優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)，生物活性化合物在食品工業(yè)、化學(xué)工業(yè)和制藥工業(yè)中的潛在應(yīng)用，從天然化合物中生產(chǎn)或提取生物活性化合物的生物生產(chǎn)研究越來(lái)越廣泛。在這種情況下，固態(tài)發(fā)酵已引起很大的重視，因?yàn)檫@種生物過(guò)程可有效地轉(zhuǎn)換廉價(jià)的農(nóng)工業(yè)廢渣、植物和各種各樣有價(jià)值的化合物，其中包括酚類生物活性化合物。本文就通過(guò)SFF從天然化合物中生產(chǎn)和提取酚類生物活性化合物的過(guò)程中，SSF的系統(tǒng)設(shè)置、變量、底物和微生物的種類對(duì)產(chǎn)品的影響作一綜述。

固態(tài)發(fā)酵；農(nóng)工業(yè)廢渣；植物；生物活性化合物；酚類化合物

1 生物活性化合物

生物活性化合物是存在于天然植物或食物中的微量或少量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。最常見(jiàn)的生物活性化合物包括次級(jí)代謝產(chǎn)物和酚類化合物[1]。其中，次級(jí)代謝產(chǎn)物如抗生素、真菌霉素、生物堿、食物級(jí)色素、植物生長(zhǎng)因子等，酚類化合物包括黃酮、酚酸、單寧以及其他物質(zhì)。黃酮類化合物廣泛存在于植物酚類化合物中。類黃酮化合物是以黃酮(2-苯基色原酮)為母核而衍生的一類黃色色素，如黃酮醇、黃酮、黃烷酮、黃烷醇、異黃酮和花青素。與黃酮類一樣，酚酸也是酚類化合物中的一個(gè)重要組成部分。酚酸廣泛的存在于植物和食物中，根據(jù)其結(jié)構(gòu)的不同而分為兩大類：即羥基酸和羥基羧酸。

在過(guò)去的幾年中，生物活性化合物已被廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，生物活性化合物可有效的改善人體健康，如預(yù)防疾病的發(fā)生，減少某些退行性疾病(癌癥和糖尿病)的發(fā)生[2]，降低心血管疾病的潛在危險(xiǎn)因素[3]，抗氧化，抗突變，抗過(guò)敏，抗炎和抗菌[4]。由于這些特質(zhì)，研究者們將利用水果、蔬菜、植物、農(nóng)業(yè)和農(nóng)用工業(yè)廢渣等作為其底物來(lái)研究酚類生物活性化合物。

通常情況下，采用熱回流系統(tǒng)有機(jī)溶劑固—液提取法從天然化合物中提取生物活性化合物[5]。然而，近年來(lái)已研發(fā)了一些新的提取技術(shù)，包括超臨界流體、高壓工藝、微波輔助萃取和超聲輔助萃取等[6]。通過(guò)發(fā)酵提取或生產(chǎn)生物活性化合物也是一個(gè)備受關(guān)注的技術(shù)，因?yàn)樗讷@得高質(zhì)量和高活性提取物的同時(shí)還能去除任何毒性相關(guān)的有機(jī)溶劑。在這個(gè)過(guò)程中，生物活性化合物作為微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物而獲得[7]。

本文提出了發(fā)酵提取和生產(chǎn)酚類生物活性化合物的新理念，從而進(jìn)一步加深對(duì)固態(tài)發(fā)酵技術(shù)的了解。總結(jié)并討論SFF技術(shù)的目前研究進(jìn)展，以及微生物、固態(tài)基質(zhì)和培養(yǎng)條件對(duì)酚類化合物形成的影響。

2 固態(tài)發(fā)酵(SFF)

發(fā)酵過(guò)程可分成兩個(gè)系統(tǒng)：即深層發(fā)酵(SMF)和固態(tài)發(fā)酵(SSF)。其中，深層發(fā)酵是基于微生物在含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的液體介質(zhì)中培養(yǎng)的方法；固態(tài)發(fā)酵是微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成在沒(méi)有或基本上沒(méi)有游離水的固態(tài)基質(zhì)上的發(fā)酵方式，然而固態(tài)基質(zhì)中必須含有充足營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)支持微生物的生長(zhǎng)和代謝[8]。典型的液體深層發(fā)酵(SMF)的含水量超過(guò)95%，而固態(tài)發(fā)酵的水含量往往在40%和80%之間。在20世紀(jì)初至40年代，SSF已被用來(lái)生產(chǎn)酶和青霉素。近年來(lái)，研究者們發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于SMF來(lái)說(shuō)，SSF具有高產(chǎn)量和高產(chǎn)率等特點(diǎn)。此外，由于SSF可將低成本的農(nóng)業(yè)和農(nóng)工業(yè)殘?jiān)鳛榈孜?，其投資和操作費(fèi)用均低于SMF。SSF的低含水量也是影響其經(jīng)濟(jì)性的一個(gè)重要指標(biāo)，主要是因?yàn)榈秃靠梢钥s小發(fā)酵規(guī)模，減少下游加工步驟，減少攪拌次數(shù)和降低成本等[8]。SSF培養(yǎng)的主要缺點(diǎn)是由于熱傳導(dǎo)和同體底物基質(zhì)而引起發(fā)酵不均勻問(wèn)題[9]。然而，研究者已通過(guò)生物反應(yīng)器的應(yīng)用從而克服這些困難。

SSF發(fā)酵的高效率使得更多的生物活性化合物將通過(guò)該技術(shù)來(lái)生產(chǎn)[10]。表1例舉了SSF的生物活性次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量高于SMF的幾個(gè)例子。除了高產(chǎn)量外，由于SSF發(fā)酵過(guò)程一般不需要無(wú)菌操作，因此，SSF具有耗時(shí)少和成本低等特點(diǎn)。

表1固態(tài)發(fā)酵次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量高于液體

2.1 影響固態(tài)發(fā)酵成功的因素 SSF發(fā)酵技術(shù)的成功必須考慮幾個(gè)重要的因素，包括選擇一個(gè)合適的微生物和固態(tài)基質(zhì)。真菌、酵母和細(xì)菌均可以作為SSF技術(shù)的微生物菌株。其中，由于發(fā)酵培養(yǎng)基的低含水量，真菌和酵母是最常用的微生物。然而，SSF技術(shù)中微生物的選擇最終取決于所要生產(chǎn)的最終產(chǎn)物。絲狀真菌具有生產(chǎn)生物活性化合物的巨大潛力，因此，它們是應(yīng)用最廣泛的微生物[11]。

選擇合適的固態(tài)基質(zhì)是固態(tài)發(fā)酵中又一個(gè)非常重要的步驟。大多數(shù)次級(jí)代謝產(chǎn)物都可以通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)幕|(zhì)或混合物基質(zhì)從而提高其產(chǎn)量。作為一個(gè)整體，載體材料必須具有有利于微生物發(fā)酵和低成本等特性。具有這些特征的物質(zhì)均可以從農(nóng)業(yè)和農(nóng)工業(yè)中殘留的天然化合物中獲取。此外，使用這些殘?jiān)鳛镾SF的碳源也減少了發(fā)酵的成本和避免環(huán)境污染等問(wèn)題，有利于國(guó)家經(jīng)濟(jì)發(fā)展。這些殘留物包括咖啡果肉和皮、甘蔗、舌蘭蔗渣、果漿和皮、玉米穗軸等，均可被用作載體和/或通過(guò)SSF來(lái)生產(chǎn)有價(jià)值的化合物，比如酶[12]、有機(jī)酸[13]、抗生素[14]、香料和香味化合物[15]、生物活性化合物[16]。表2總結(jié)了SSF中常用的微生物和固態(tài)基質(zhì)。

表2 不同微生物和固相支持的固態(tài)發(fā)酵的近期研究

影響SFF發(fā)酵過(guò)程中的重要變量包括原料的預(yù)處理，底物的顆粒大小、培養(yǎng)基成分、補(bǔ)料、SSF培養(yǎng)基的無(wú)菌狀態(tài)、水分含量、水活性(aw)、接種物密度、溫度、pH、攪拌速度和通氣量等[17]。其中，水分含量和aw在SSF發(fā)酵過(guò)程的起重要作用。通常，固態(tài)基質(zhì)的含水量一般在30%-85%左右。較低會(huì)誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生孢子；較高會(huì)降低系統(tǒng)的孔隙率，從而限制氧的轉(zhuǎn)移并增加細(xì)菌污染的概率[18]。根據(jù)Raimbault[19]的研究結(jié)果顯示，微生物對(duì)水分的需求，可以更好地在體現(xiàn)在aw而不是固態(tài)基質(zhì)中水的含量。aw表示微生物生長(zhǎng)可用或可吸收的水分，并影響生物量生長(zhǎng)、代謝和傳質(zhì)過(guò)程。

研究者可以通過(guò)建立發(fā)酵過(guò)程的相關(guān)變量參數(shù)尋找最合適的發(fā)酵條件，從而提高產(chǎn)率。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案是一種用最少的實(shí)驗(yàn)獲得最佳實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的一種方法。近年來(lái)，使用統(tǒng)計(jì)分析軟件建立最佳SSF發(fā)酵條件使產(chǎn)物最大化已取得一定的成效。這些工程包括：酶的生產(chǎn)、如α淀粉酶、菊粉酶、植酸酶、蛋白酶、木聚糖酶[、漆酶、生物表面活性劑]和有機(jī)酸如檸檬酸。

最后，在SSF過(guò)程中選擇最合適的下游工序?qū)λ玫降漠a(chǎn)物也很重要。SSF的產(chǎn)物可以通過(guò)溶劑(水或其他溶劑的混合物)萃取法從固態(tài)發(fā)酵中回收得到。溶劑的種類及其濃度，溶劑與固體基質(zhì)的比例以及 pH值是影響產(chǎn)品的提取的重要變量。此外，由于代謝產(chǎn)物在培養(yǎng)過(guò)程中擴(kuò)散到整個(gè)固態(tài)基質(zhì)中，可能需要長(zhǎng)時(shí)間提取以完成產(chǎn)品的回收。純化的成本取決于所獲得的提取物的質(zhì)量。特別是用于醫(yī)藥和保健行業(yè)的次級(jí)代謝產(chǎn)物，由于其純度需要特定要求必須采用特定的純化策略。

3 SSF生產(chǎn)酚類生物活性化合物

3.1 增加食物中酚的含量 酚類化合物，也稱為多酚，被認(rèn)為是天然的抗氧化劑，也是食物中生物活性化合物的重要組成部分[20]。這些化合物廣泛存在于所有的植物中，但它們的種類和含量極大程度上取決于植物的遺傳因素和環(huán)境條件。

在過(guò)去幾年中，SSF已用來(lái)作為增加某些食物中酚類化合物含量的一種技術(shù)，從而提高它們的抗氧化活性。例如，黑豆由于含有大豆異黃酮、維生素E、皂甙、類胡蘿卜素和花青素而具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)，利用SSF技術(shù)發(fā)酵不同的食品級(jí)絲狀真菌(尤其是Aspergillus sp.和Rhizopus sp.)，可增強(qiáng)黑豆的抗氧化性，其原因可能是由于增加了苯酚和花色苷的含量[21]。然而，黑豆的抗氧化性根據(jù)所使用的微生物的不同而不同。同理，SFF用少孢根酶發(fā)酵所得的草豌豆種子，由于抗自由基的增加而導(dǎo)致酚類化合物含量的增加[22]。兩種不同的絲狀真菌(Aspergillus oryzae 和 Aspergillus awamori))用SSF發(fā)酵技術(shù)可有效地提高酚的含量和小麥糧食的抗氧化性。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后的小麥與未發(fā)酵的小麥相比，其抗氧化性更高，成為更健康的輔食[23]。通過(guò)SSF發(fā)酵Trichoderma harzianum得到的大豆產(chǎn)品與未發(fā)酵的產(chǎn)品相比，具有更強(qiáng)的抗氧化活性，可能是由于SSF發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了更多的酚酸、黃酮苷元、異黃酮和自由羥基[24]。通過(guò)SSF 發(fā)酵Cordyceps sinensis可改善陳米的化學(xué)成分及其生物活性[25]。

3.2 從農(nóng)工業(yè)殘?jiān)猩a(chǎn)和提取酚類生物活性化合物 SSF技術(shù)另一個(gè)有價(jià)值的應(yīng)用是從農(nóng)工業(yè)殘留物中生產(chǎn)或提取酚類生物活性化合物。這些殘留物包括種子、果皮、殼、果渣等。由于這些材料可提供大量的廉價(jià)可再生原料以生產(chǎn)高價(jià)值的化合物，受到越來(lái)越多的關(guān)注。因此，它們中的某些物質(zhì)已被用作SSF發(fā)酵過(guò)程中的固態(tài)基質(zhì)從而生產(chǎn)不同的酚類生物活性化合物[26]。例如，石榴廢料中含有大量的酚類化合物，包括花青素、可水解的單寧和木脂素[27]。這些酚類化合物具有抗氧化、抗炎和抗癌等活性。最近的研究發(fā)現(xiàn)，石榴殼可作為SSF發(fā)酵黑曲霉GH1生產(chǎn)鞣花酸的固態(tài)基質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)源[28]。從經(jīng)濟(jì)角度來(lái)看，每噸石榴殼可生產(chǎn)8kg的鞣花酸，具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益。蔓越莓果渣也是生產(chǎn)鞣花酸和其它酚類化合物的來(lái)源之一?？捎行г黾喻坊ㄋ岬暮?，同時(shí)也是生產(chǎn)生物活性化合物不錯(cuò)的選擇。

農(nóng)業(yè)或林業(yè)垃圾包括谷類和蔬菜殘?jiān)?，如稻草、蔗渣、秸稈、穗軸、殼等，都是由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成的木質(zhì)纖維素材料。這些材料中的木質(zhì)素部分包含許多酚成分，主要是酸、香豆、丁香、香草和對(duì)羥基，這些都可以通過(guò)SSF來(lái)回收。

3.3 從植物中生產(chǎn)和提取酚類生物活性化合物 植物被用來(lái)生產(chǎn)各種各樣的具有生物活性的化合物，且它們被廣泛應(yīng)用于健康和食物領(lǐng)域。這些化合物含有大量的黃酮、酚酸、木酚素、烷醇、甾醇、芥子油苷等[29]。植物被認(rèn)為是生產(chǎn)具有巨大營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和治療效果的酚類化合物的來(lái)源之一[30]。在這些化合物中，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了其抗氧化活性與酚類化合物相關(guān)，這表明酚類化合物可能是其抗氧化的主要原因[30]。酚類化合物廣泛分布于植物中，其中葉子和莖中含量最高。這些化合物被認(rèn)為是天然的防御物質(zhì)，且它們的濃度由受以下幾個(gè)因素影響，包括生理變化、環(huán)境條件、地理變異、遺傳因素和植物的進(jìn)化[31]。植物的生物多樣性為其酚類生物活性化合物的開(kāi)發(fā)研究及生物屬性的研究奠定了基礎(chǔ)[32]。例如：墨西哥許多植物已被應(yīng)用于SSF工藝中，最常見(jiàn)的包括Larrea tridentata、Flourensia cernua等。使用有機(jī)溶劑從Larrea tridentata中提取的物質(zhì)具有抗氧化和抗真菌活性。

4 小結(jié)與展望

近年來(lái)，SSF在各個(gè)領(lǐng)域都得到了很大的發(fā)展，它是一種具有巨大應(yīng)用潛力的從天然化合物中生產(chǎn)或提取生物活性化合物的清潔技術(shù)。SFF是一個(gè)環(huán)境友好型技術(shù)，具有可利用性，低成本和獲得不同酚類生物活性化合物等特性，同時(shí)也可以使農(nóng)工業(yè)廢渣的得到再利用。SSF的另一個(gè)應(yīng)用是增加食物中酚類生物活性化合物的含量。雖然目前SSF潛力巨大，但相對(duì)于液體發(fā)酵來(lái)說(shuō)，SSF在傳質(zhì)和傳熱等方面仍有待進(jìn)一步的研究與完善。

[1] H?lker U, H?fer M, Lenz J. Biotechnological advances of laboratory-scale solid-state fermentation with fungi[J]. Appl Microbiol Biotechnol 2004, 64:175-86.

[2]Conforti F, Menichini F, Formisano C, et al. Comparative chemical composition, free radical-scavenging and cytotoxic properties of essential oils of six Stachys species from different regions of the Mediterranean Area[J]. Food Chem 2009, 116:898-905.

[3]Jiménez JP, Serrano J, Tabernero M, et al. Effects of grape antioxidant dietary fiber in cardiovascular disease risk factors[J]. Nutrition 2008, 24:646-53.

[4]Ham SS, Kim SH, Moon SY, et al. Antimutagenic effects of subfractions of Chaga mushroom (Inonotus obliquus) extract[J]. Mutat Res Gen Toxicol En 2009, 672:55-9.

[5]Martins S, Aguilar CN. Kinetic study of nordihydroguaiaretic acid recovery from Larrea tridentata by microwave-assisted extraction[J]. J Chem Technol Biotechnol 2010, 85:1142-7.

[6]Markom M, Hasan M, Daud WRW, et al. Extraction of hydrolysable tannins from Phyllanthus niruri Linn: effects of solvents and extraction methods[J].Sep Purif Technol 2007, 52:487-96.

[7]Nigam PS, Pandey A. Solid-state fermentation technology for bioconversion of biomass and agricultural residues[J]. Netherlands: Springer 2009,197-221.

[8]Pandey A. Solid state fermentation[J]. Biochem Eng J 2003, 13:81-4.

[9]Di Luccio M, Capra F, Ribeiro NP, et al. Effect of temperature, moisture, and carbon supplementation on lipase production by solidstate fermentation of soy cake by Penicillium simplicissimum[J]. Appl Biochem Biotechnol 2004, 113:173-80.

[10]Nigam PS, Gupta N, Anthwal A. Pre-treatment of agro-industrial residues[J]. Netherlands: Springer 2009, 13-33.

[11]Aguilar CN, Aguilera-Carbo A, Robledo A, et al. Production of antioxidants nutraceuticals by solid-state cultures of pomegranate (Punica granatum) peel and creosote bush (Larrea tridentata) leaves[J]. Food Technol Biotechnol 2008, 46:218-22.

[12]Guimar es LHS, Somera AF, Terenzi HF, et al. Production of β-fructofuranosidases by Aspergillus niveus using agroindustrial residues as carbon sources: Characterization of an intracellular enzyme accumulated in the presence of glucose[J]. Process Biochem 2009, 44:237-41.

[13]John RP, Nampoothiri KM, Pandey A. Solid-state fermentation for L-lactic acid production from agro wastes using Lactobacillus delbrueckii[J]. Process Biochem 2006,41:759-63.

[14]Ellaiah P, Srinivasulu B, Adinarayana K. Optimisation studies on neomycin production by a mutant strain of Streptomyces marinensis in solid state fermentation[J]. Process Biochem 2004, 39:529-34.

[15]Rossi SC, Vandenberghe LPS, Pereira BMP, et al. Improving fruity aroma production by fungi in SSF using citric pulp[J]. Food Res Int 2009, 42:484-6.

[16]Hernández JS, Aguilera-Carbó AF, Rodríguez Herrera R, et al. Kinetic production of the antioxidant ellagic acid by fungal solid state culture. Proceedings of the 10th international chemical and biological engineering conference[J]. Portugal: CHEMPOR 2008, 1849-54.

[17]Philippoussis AN. Production of mushrooms using agro-industrial residues as substrates[J]. Netherlands: Springer 2009, 163-96.

[18]Pérez-Guerra N, Torrado-Agrasar A, López-Marias C, et al. Main characteristics and applications of solid substrate fermentation[J]. Electron J Environ Agric Food Chem 2003, 2:343-50.

[19]Raimbault M. General and microbiological aspects of solid substrate fermentation[J]. Electron J Biotechnol 1998, 1:174-88.

[20]Due?as M, Fernández D, Hernández T, et al. Bioactive phenolic compounds of cowpeas[J]. J Sci Food Agr 2005, 85:297-304.

[21]Lee IH, Hung YH, Chou CC. Solid-state fermentation with fungi to enhance the antioxidative activity, total phenolic and anthocyanin contents of black bean[J]. Int J Food Microbiol 2008, 121:150-6.

[22]Starzynska-Janiszewska A, Stodolak B, Jamróz M. Antioxidant properties of extracts from fermented and cooked seeds of Polish cultivars of Lathyrus sativus[J]. Food Chem 2008, 109:285-92.

[23]Bhanja T, Kumari A, Banerjee R. Enrichment of phenolics and free radical scavenging property of wheat koji prepared with two filamentous fungi[J]. Bioresour Technol 2009, 100:2861-6.

[24]Singh HB, Singh BN, Singh SP, et al. Solid-state cultivation of Trichoderma harzianum NBRI-1055 for modulating natural antioxidants in soybean seed matrix[J]. Bioresour Technol 2010, 101:6444-53.

[25]Zhang Z, Lei Z, Lu Y, et al. Chemical composition and bioactivity changes in stale rice after fermentation with Cordyceps sinensis[J]. J Biosci Bioeng 2008, 106:188-93.

[26]Robledo A, Aguilera-Carbó A, Rodríguez R, et al. Ellagic acid production by Aspergillus niger in solid state fermentation of pomegranate residues[J]. J Ind Microbiol Biotech 2008, 35:507-13.

[27]Cuccioloni M, Mozzicafreddo M, Sparapani L, et al. Pomegranate fruit components modulate human thrombin[J]. Fitoterapia 2009, 80:301-5.

[28]Naveena BM, Sen AR, Vaithiyanathan S, et al. Comparative efficacy of pomegranate juice, pomegranate rind powder extract and BHT as antioxidants in cooked chicken patties[J]. Meat Sci 2008, 80:1304-8.

[29]Hooper L, Cassidy A. A review of the health care potential of bioactive compounds[J]. J Sci Food Agric 2006, 86:1805-13.

[30] Trouillas P, Calliste CA, Allais DP, et al. Antioxidant, antiinflammatory and antiproliferative properties of sixteen water plant extracts used in the Limousin countryside as herbal teas[J]. Food Chem 2003, 80:399-407.

[31]Figueiredo AC, Barroso JG, Pedro LG, et al. Factors affecting secondary metabolite production in plants: volatile components and essential oils[J]. Flavour Frag J 2008, 23:213-26.

[32] Shetty K, McCue P. Phenolic antioxidant biosynthesis in plants for functional foodapplication: integration of systems biology and biotechno logical approaches[J]. Food Biotechnol 2003, 17:67-97.

10.3969/j.issn.2095-9559.2017.01.100

2095—9559(2017)01—2884—04

2016-06-14

*通訊作者：許曉玲