循環(huán)腫瘤細胞在臨床應用中的挑戰(zhàn)*

趙建華

(江蘇省腫瘤醫(yī)院/江蘇省腫瘤防治研究所/南京醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院,江蘇省臨床檢驗中心，南京 210009)

·述評·

循環(huán)腫瘤細胞在臨床應用中的挑戰(zhàn)*

趙建華

(江蘇省腫瘤醫(yī)院/江蘇省腫瘤防治研究所/南京醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院,江蘇省臨床檢驗中心，南京 210009)

循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)的臨床應用價值已經(jīng)得到廣泛認可，尤其作為“液體活檢”的主要資源用于腫瘤精準醫(yī)療備受關注。然而，CTCs在患者血液中的含量極為稀少，靈敏度一直是CTCs檢測及應用的主要瓶頸。目前，CTCs分離、富集、體外原代培養(yǎng)技術，獲得細胞的生物學特性研究及其臨床應用價值都還在不斷探索和發(fā)展中，對它們的深層次和全方位的分析將有助于指導并推動CTCs的臨床應用。

循環(huán)腫瘤細胞；精準醫(yī)療；生物學特征

腫瘤轉(zhuǎn)移是癌癥患者死亡的主要原因。由于大部分遠端轉(zhuǎn)移都是通過血液循環(huán)完成的，因此血液中存在的腫瘤細胞，即循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)，被認為是腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移的關鍵因素[1]。然而，CTCs在患者血液中的含量非常稀少，一般每106個白細胞中僅夾雜1個至幾個CTCs，靈敏度一直是CTCs檢測及其應用的主要障礙。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)一項CTCs分離與檢測技術能全面滿足臨床需求，CTCs分離、富集、體外原代培養(yǎng)、分子表觀遺傳特征的研究及其臨床應用價值都還在不斷探索和發(fā)展中，對它們的深層次和全方位的分析將有助于指導并推動CTCs的臨床轉(zhuǎn)化及應用。

1 CTCs分離技術仍在不斷完善

目前臨床上主要是通過CTCs的計數(shù)來預測腫瘤患者的復發(fā)、轉(zhuǎn)移和生存?，F(xiàn)階段普遍使用的CTCs分離技術大致分為兩類：基于細胞表面蛋白質(zhì)表達的生物分離技術和基于腫瘤細胞物理學特點的物理分離技術。第一類技術中，以CellSearch平臺為代表的陽性磁分離法使用最早且較廣泛。其原理為上皮來源的腫瘤細胞表面廣泛表達上皮細胞粘附因子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)，該類技術能基于EpCAM免疫磁性捕獲上皮性CTCs；但CTCs中存在著發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)而丟失EpCAM的亞群，這類CTCs已被證明在乳腺癌發(fā)病過程中具有更高的轉(zhuǎn)移效率和預后警示作用[2]。為了克服該缺陷，陰性磁分離法應運而生，它不依賴于CTCs的表型，可通過去除血液中白細胞而實現(xiàn)所有類型CTCs的檢測。但該技術的CTCs回收純度低且會出現(xiàn)假信號。第二類CTCs分離技術主要基于腫瘤細胞與血細胞在大小和/或形變能力上的差異，采用過濾或離心法富集CTCs。然而，尚無證據(jù)表明CTCs一定就是直徑較大的或剛性強的細胞，磁性分離法獲得的CTCs大小各異也證明了這一點，因此，該類方法雖簡便易行但可信度和臨床應用價值還有待驗證。無論采用何種技術，CTCs的計數(shù)在判斷各類癌癥的復發(fā)轉(zhuǎn)移和早期診斷上還需建立統(tǒng)一的標準，并且發(fā)展新的CTCs分離技術應同時進行系統(tǒng)的方法學比較，以提高其敏感性、特異性和有效性。

2 腫瘤精準治療給CTCs的分離技術提出了更高的要求

精準治療的焦點是根據(jù)腫瘤細胞所呈現(xiàn)的分子特點(如基因突變和特定基因或蛋白質(zhì)表達等)選擇相應的分子靶向治療藥物以獲得最佳療效。但腫瘤細胞具有高度異質(zhì)性，治療前需要對患者的腫瘤細胞進行異質(zhì)性鑒定。然而，組織樣本獲取困難、瘤內(nèi)癌細胞高度異質(zhì)性及無法跟蹤檢測限制了其臨床應用。“液體活檢”成為理想的選擇，且與其他液體活檢材料(例如ctDNA和外泌體等)相比，CTCs具有更為突出的優(yōu)勢[3]。正如哈佛醫(yī)學院Toner教授在《Science》雜志中指出：“完整的細胞具有巨大的價值；可以研究DNA、RNA、信號分子、磷酸化模式、表觀遺傳學，還可以通過培養(yǎng)這些細胞，測試藥物敏感性，真正走向個性化醫(yī)學”。目前主要有2個技術障礙使得CTCs的應用還難以真正在臨床上展開：一是使用當前技術純化CTCs后，樣品中依然含有大量白細胞，CTCs的含量僅在0.1%～1%之間，難以通過測序技術(因基因測序要求樣品中腫瘤細胞比例不低于10%～20%)準確鑒定其中的相關基因突變靶點；二是分離具有完整活性的CTCs還存在技術瓶頸。目前的CTCs分離技術包括多步的化學和物理操作過程，導致純化后的CTCs無法繼續(xù)培養(yǎng)而獲得足夠的數(shù)量用于高通量基因突變檢測和藥物篩查。盡管微流控芯片分離技術(CTC Chip)可獲得CTCs的含量高達50%[4]，但其過程對CTCs的活性及生物學功能有影響；隨后報道的CTC iChip技術盡管解決了CTCs活性不足的問題[5]，但CTCs純化后的含量依然很低，難以直接用于靶基因突變檢測。盡管如此，從CTCs的回收率和細胞活性上看，微流控芯片技術比其他分離技術具有突出的優(yōu)勢。有理由相信，基于微流控芯片的多技術組合將可能成為新一代高效能CTCs分離技術的發(fā)展方向；在此基礎之上的大規(guī)模臨床驗證將全面推動CTCs在腫瘤精準治療中的臨床應用。

3 CTCs的臨床應用離不開其本身的生物學功能與分子特性研究

目前主要集中在2個方向：一是發(fā)生EMT的CTCs；二是具有腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)特性的CTCs。在轉(zhuǎn)移過程中，絕大部分CTCs會在機體免疫作用下發(fā)生凋亡,僅少數(shù)可存活下來形成轉(zhuǎn)移灶。因而對CTCs進行簡單計數(shù)而沒有進一步的分子特性鑒定完全可能導致錯誤的臨床判斷和診治[6]；同時由于目前CTCs分離技術在建立過程中都是通過不同病例組來進行臨床應用驗證，亦無標準化方案，導致CTCs的分選計數(shù)難以進行方法學比較，也無法在各種類別的腫瘤中形成統(tǒng)一的定量判定標準。近來的研究結(jié)果顯示，基于分子特性鑒定以檢測少數(shù)更具存活力和侵襲性的CTCs比單獨CTCs計數(shù)更有價值[7-8]，這可能也為CTCs在臨床應用中的標準化提供了一條可行之路。

4 與CTCs相關的一些基本臨床應用問題

與CTCs相關的某些臨床應用問題尚有待闡明，才能全面發(fā)揮CTCs的“液體活檢”功能。目前的焦點主要包括以下4個方面：

4.1 CTCs檢測是否能用于腫瘤的早期診斷？ 目前CTCs的存在與腫瘤發(fā)生與發(fā)展之間的關系還處于研究探索階段。已有文獻證實，腫瘤原發(fā)灶形成前CTCs就已經(jīng)存在[9]，提示CTCs具有用于腫瘤早期診斷的潛力。但腫瘤早期階段的CTCs檢出率極低，這給臨床常規(guī)應用帶來了巨大挑戰(zhàn)。綜合文獻，這一問題可能通過采取一些不同的策略逐步解決：首先，血液中的CTCs在時間和空間分布上是變化的，嚴格把控血液樣品的采集部位及采樣時間非常關鍵；其次，CTCs在血液中的數(shù)量極少，發(fā)展更敏感更特異的CTCs分離與檢測技術也至關重要。

4.2 發(fā)生EMT的CTCs與臨床的相關性如何？ EMT的發(fā)生與腫瘤細胞的CSCs特性有關[10]。由于CSCs被認為是腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和復發(fā)的根源，發(fā)生EMT的CTCs可能成為腫瘤遠端轉(zhuǎn)移的起源。然而，發(fā)生EMT的CTCs處于“冬眠”狀態(tài)，無法增殖形成轉(zhuǎn)移灶[10]。因此，這類CTCs與腫瘤轉(zhuǎn)移及預后的相關性還需要進行大規(guī)模的臨床驗證，尋找新的特異性標志物以鑒別最終能形成轉(zhuǎn)移灶的CTCs，已成為最迫切的需求。此外，CTCs的EMT特性鑒定目前還主要集中在晚期患者，如果能在早期患者中找到證據(jù)表明這類CTCs的存在且與患者后續(xù)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移密切相關，則能拓展CTCs的另一個重要功能，即在術前判斷患者發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性以優(yōu)化手術方案。

4.3 CTCs的特性鑒定是否有助于預測腫瘤發(fā)生遠端轉(zhuǎn)移的部位？ 腫瘤細胞能從原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶組織的不同部位脫落入血形成CTCs，這些細胞具有高度異質(zhì)性，向遠端部位轉(zhuǎn)移的潛能和組織/器官選擇性也不相同[11]。因此，理論上來說，CTCs中存在具有組織特異性的CTCs亞群。目前這方面的研究尚未見報道。相信，隨著CTCs分子特性研究的深入，這些具有選擇轉(zhuǎn)移性的CTCs亞群將可能為我們提供各種腫瘤的轉(zhuǎn)移路線圖譜。如果能夠?qū)崿F(xiàn)該目標，將進一步拓展CTCs的新功能，即有助于定位新的微小轉(zhuǎn)移灶，提高臨床監(jiān)測患者復發(fā)的效率。

4.4 CTCs的基因分型與表型鑒定能否用于指導腫瘤的精準治療？ 液態(tài)活檢由于具備無創(chuàng)檢測腫瘤狀況的獨特優(yōu)勢，正逐漸成為“精準醫(yī)療”代表性檢測手段，同時也極大推動了產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的進程。其中，通過CTCs檢測非小細胞肺癌EGFR基因突變和乳腺癌表皮生長因子-2(HER2)表達已成功用于相應的靶向治療[12-13]。因此，CTCs的基因分型與表型鑒定用于指導腫瘤精準治療是發(fā)展趨勢。然而，與化療藥物一樣，患者對靶向藥物的響應也并非是持久性的；隨著治療的進行，腫瘤驅(qū)動基因突變譜將會發(fā)生變化，耐藥的實時監(jiān)測及其治療方案的持續(xù)調(diào)整優(yōu)化對患者的療效及預后至關重要，但組織活檢無法承擔這一責任。CTCs檢測優(yōu)點在于不僅能通過總體和分類計數(shù)對腫瘤進展進行實時監(jiān)測；而且還能對完整腫瘤細胞進行實時鑒定并展開細胞功能研究，在單細胞水平研究分析腫瘤細胞群體異質(zhì)性及其與治療進展的相關性。當然這些都需要高靈敏度的CTCs分離、富集與檢測技術、體外原代培養(yǎng)技術、以及單細胞研究技術的發(fā)展和支撐。

5 小結(jié)及展望

CTCs的臨床應用不僅面臨技術上的問題，還存在大量的實際應用問題有待解決。一個好的CTCs分離技術應當同時具有以下4個方面的優(yōu)勢：其一，能夠獲得足量的CTCs，這是其臨床應用可靠性的重要前提；其二，分離出的CTCs具有足夠的純度，這是準確鑒定其基因型和表型用于腫瘤精準治療的技術前提；其三，獲得的CTCs具有完整的活性，能夠繼續(xù)培養(yǎng)獲得足夠的數(shù)量，以用于大規(guī)模的藥物篩查和基因鑒定；其四，能夠分離出全部類型的CTCs，這為其臨床應用的有效性提供保障。為此，需要通過大規(guī)模的臨床試驗解決CTCs在應用過程中存在的問題，并對其定量和鑒定依據(jù)進行標準化，才能為臨床診療提供全面而有價值的指導。

[1]Alix-Panabières C, Pantel K.Challenges in circulating tumour cell research[J]. Nat Rev Cancer，2014，14(9):623-631.

[2]Yu M, Bardia A, Wittner BS,etal. Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition[J]. Science， 2013，339(6119):580-584.

[3]Gold B, Cankovic M, Furtado LV,etal. Do circulating tumor cells, exosomes, and circulating tumor nucleic acids have clinical utility? A report of the association for molecular pathology[J]. J Mol Diagn，2015，17(3):209-224.

[4]Nagrath S, Sequist LV, Maheswaran S,etal. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology[J]. Nature，2007，450(7173):1235-1239.

[5]Sarioglu AF, Aceto N, Kojic N,etal. A microfluidic device for label-free, physical capture of circulating tumor cell clusters[J]. Nat Methods，2015，12(7):685-691.

[6]Plaks V, Koopman CD, Werb Z. Circulating tumor cells[J]. Science， 2013，341(6151):1186-1188.

[7]Messaritakis I, Stoltidis D, Kotsakis A,etal. TTF-1- and/or CD56-positive Circulating Tumor Cells in patients with small cell lung cancer (SCLC)[J]. Sci Rep，2017，7:45351.

[8]Fang C, Fan C, Wang C,etal. CD133+CD54+CD44+ circulating tumor cells as a biomarker of treatment selection and liver metastasis in patients with colorectal cancer[J]. Oncotarget，2016，7(47):77389-77403.

[9]Rhim AD, Mirek ET, Aiello NM,etal. EMT and dissemination precede pancreatic tumor formation[J]. Cell，2012，148(1-2):349-361.

[10]Manjili MH.Tumor dormancy and relapse: from a natural byproduct of evolution to a disease state[J]. Cancer Res，2017，77(10):2564-2569.

[11]Wan L, Pantel K, Kang Y. Tumor metastasis: moving new biological insights into the clinic[J]. Nat Med，2013，19(11):1450-1464.

[12]Ross K, Pailler E, Faugeroux V,etal.The potential diagnostic power of circulating tumor cell analysis for non-small-cell lung cancer[J]. Expert Rev Mol Diagn，2015，15(12):1605-1629.

[13]Wallwiener M, Hartkopf AD, Riethdorf S,etal.The impact of HER2 phenotype of circulating tumor cells in metastatic breast cancer: a retrospective study in 107 patients[J]. BMC Cancer，2015，15:403.

(本文編輯：許曉蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.01

江蘇省重點研發(fā)(社會發(fā)展)計劃基金(BE2015078)。

趙建華，1964年生，女，研究員，碩士，E-mail:Jhzhao2838@sina.com。

Q291

A

2017-06-28)