深圳地區(qū)103例非小細(xì)胞肺癌患者EGFR基因突變分析*

王禮法 劉愛勝 余樹林 施俊柱 程文德 劉小君

·臨床檢驗(yàn)·

深圳地區(qū)103例非小細(xì)胞肺癌患者EGFR基因突變分析*

王禮法 劉愛勝 余樹林 施俊柱 程文德 劉小君

目的 了解深圳地區(qū)非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突變情況，為NSCLC患者藥物靶向治療提供科學(xué)依據(jù)。方法 收集2013年3月~2015年11月深圳地區(qū)3家三級區(qū)屬醫(yī)院的103例NSCLC肺癌組織，分別提取DNA，采用突變特異性擴(kuò)增系統(tǒng)（ARMS）擴(kuò)增檢測EGFR基因外顯子18、19、20及2l的突變情況，并統(tǒng)計分析EGFR基因突變率。結(jié)果 103例NSCLC患者中EGFR基因總突變率為38.8%（40/103），其中第18、19、20及21外顯子突變分別占總突變的2.5%（1/40）、35.0%（14/40）、5.0%（2/40）及57.5%（23/40）；腺癌患者EGFR基因突變率為48.7%（37/76），高于非腺癌患者的11.1%（3/27），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=25.617，P<0.01）；不吸煙的NSCLC患者EGFR基因突變率為56.1%（32/57），明顯高于吸煙患者的17.4%（8/46），差異有統(tǒng)計意義（χ2=20.195，P<0.01）；女性患者突變率為52.4%（22/42），高于男性患者的29.5%（18/61），差異有統(tǒng)計意義（χ2=5.127，P<0.05）；≤56歲的NSCLC患者EGFR基因突變率為39.5%（17/43），>56歲的患者為38.3%（23/60），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.618，P>0.05）。結(jié)論 深圳地區(qū)NSCLC患者EGFR基因突變主要以21外顯子為主，其次為19外顯子；腺癌、女性及不吸煙NSCLC患者EGFR基因突變率較高，可接受EGFR-TKIs治療。

非小細(xì)胞肺癌 表皮生長因子受體 基因突變

NSCLC患者EGFR基因突變主要存在于第18~21外顯子上[1]。不同種族、同一種族不同地域EGFR的突變種類和突變頻率都存在很大差異。已有研究表明，中國不同地區(qū)人群EGFR基因突變狀態(tài)存在差異，如云南地區(qū)EGFR基因突變主要集中在l9外顯子，21外顯子突變罕見，而上海地區(qū)19和21外顯子的突變發(fā)生率基本相同[2]。但目前為止，未見深圳地區(qū)大樣本EGFR基因突變的分析報道。為此，本研究對深圳地區(qū)103例NSCLC患者EGFR基因突變情況進(jìn)行調(diào)查，探討EGFR突變與患者性別、吸煙史、組織學(xué)類型等臨床特征的關(guān)系，以期為深圳地區(qū)NSCLC患者的藥物靶向治療提供參考依據(jù)。

對象與方法

1 對象 收集2013年3月~2015年11月深圳地區(qū)3家三級區(qū)屬醫(yī)院呼吸和危重癥醫(yī)學(xué)科診治的NSCLC患者103例，其中男性61例，女性42例；年齡37～82歲，平均年齡56±17.6歲；≤56歲43例，>56歲60例；有吸煙史46例，其中男性40例，女性6例；無吸煙史57例，其中男性21例，女性36例。

2 方法

2.1 NSCLC病理類型：收集超聲支氣管鏡（EBUS）、支氣管鏡、內(nèi)科胸腔鏡活檢和經(jīng)CT、B超引導(dǎo)下穿刺活檢原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶組織標(biāo)本。所有腫瘤組織標(biāo)本切片后，均經(jīng)HE染色，由2名病理科醫(yī)生確診為NSCLC。采用 WHO肺癌分類及診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，并由2位病理醫(yī)生確診，其中腺癌（ 腺癌和腺鱗癌）76例、非腺癌（ 鱗癌26例、大細(xì)胞癌1例）27例。所有NSCLC患者術(shù)前未接受過放化療和EGFR-TKI等抗腫瘤治療。

2.2 標(biāo)本采集：活檢標(biāo)本采用中性福爾馬林溶液固定石蠟包埋，經(jīng)病理科醫(yī)生評估并選取腫瘤細(xì)胞>50%的石蠟組織，切取8 μm厚的石蠟切片5~10片，置于無菌EP試管內(nèi)。

2.3 DNA提?。好恳粯?biāo)本從石蠟包埋的腫瘤組織中切取8 μm厚切片，取5~10片置于1.5 ml Eppendorf管，加適量二甲苯脫蠟，然后加入適量乙醇洗脫二甲苯，室溫或37℃晾干，直到乙醇完全蒸干；加入180 μl Buffer ATL，再加入2 μl蛋白酶K，震蕩混勻；56℃消化過夜，直至樣品完全裂解；90℃孵化1 h，等溫度降到室溫，快速離心收集管壁上的液體；加入200 μlBuffer AL混勻，再加入200 μl無水乙醇充分混勻震蕩后，快速離心收集管壁上的液體；將上清液小心轉(zhuǎn)移到QIAamp吸附柱中，8 000 r/min離心1 min，將QIAamp吸附柱置于新的2 ml收集管；小心打開蓋子，加入500 μlBuffer AW1，8 000 r/min離心1 min，倒掉廢液，加入500 μl Buffer AW2，8 000 r/min離心1 min，倒掉廢液，將QIAamp吸附柱放置于干凈的2 ml收集管，14 000 r/min空管離心3 min；將QIAamp 吸附柱置于新的1.5 ml離心管中，將100 μl Buffer ATE加至QIAamp吸附柱中心，蓋上蓋子，室溫孵育5 min后，14 000 r/min離心1 min，收集產(chǎn)物置–20℃冰箱保存。

2.4 提取DNA量的檢測：DNA收集產(chǎn)物稀釋200倍后應(yīng)用美國賽默飛公司Thermo Scientific Nano Drop2000 超微量分光光度計，分別檢測260 nm和280 nm處OD值，DNA含量為：260 nm OD值×10（μg/μl）。

2.5 提取DNA質(zhì)的檢測：DNA產(chǎn)物260 nm OD值/280 nm OD值應(yīng)在1.8~2.0。

2.6 實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增：采用擴(kuò)增耐受突變系統(tǒng)（ARMS）[4]擴(kuò)增EGFR基因18、19、20及21外顯子。具體操作方法按人類EGFR基因突變檢測試劑盒（蘇州為真生物醫(yī)藥科技有限公司）說明進(jìn)行。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)定各突變陰、陽性對照孔及空白對照孔，反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：95℃ 5 min；95℃20 s，57℃ 32 s，循環(huán)5次；95℃ 20 s，60℃ 35 s，循環(huán)40次。

3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以 P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 NSCLC患者EGFR基因突變情況 103例NSCLC

患者肺癌組織標(biāo)本中EGFR基因總突變率為38.8%（40/103），其中18、19、20及21外顯子突變分別占總突變的2.5%（1/40）、35.0%（14/40）、5.0%（2/40）及57.5%（23/40）。

2 不同病理類型 NSCLC患者EGFR基因突變情況 腺癌（包括腺癌和腺鱗癌）的突變率48.7%（37/76）高于非腺癌（包括鱗癌和大細(xì)胞癌）的11.1%（3/27），其中女性腺癌患者的EGFR基因突變率為64.5%（20/31），明顯高于男性腺癌患者的37.8%（17/45）；女性鱗癌患者EGFR基因突變率為22.2%（2/9），明顯高于男性鱗癌患者的5.9%（1/17），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=11.964~25.617，P<0.05~0.01）。

3 吸煙與不吸煙NSCLC患者EGFR基因突變率 不吸煙NSCLC患者EGFR基因突變率為56.1%（32/57），明顯高于吸煙者的17.4%（8/46），其中男性不吸煙NSCLC患者為61.9%（13/21），高于吸煙患者的12.5%（5/40）；女性不吸煙患者為58.3%（21/36），高于吸煙患者的16.7%（1/6），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=9.162~27.601，P<0.05~0.01）。

4 不同性別NSCLC患者EGFR基因突變率 女性EGFR基因突變的發(fā)生率52.4%（22/42），顯著高于男性的29.5%（18/61），突變率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.127，P<0.05）。

5 不同年齡段NSCLC患者EGFR基因突變率≤56歲的NSCLC患者EGFR基因突變率為39.5%（17/43），>56歲的患者為38.3%（23/60），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.618，P>0.05）。

討 論

肺癌是全球發(fā)病和致死率最高的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要類型，約占85% ~90%，每年可導(dǎo)致超過100人死亡[5，6]。肺癌確診時大多已屬中晚期，傳統(tǒng)的化療藥物療效有限。目前，針對腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的小分子酪氨酸酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）類靶向藥物，如吉非替尼（Gefitinib）、厄洛替尼（Erlotinib）已被廣泛應(yīng)

用于NSCLC治療[7]，并顯示出良好的治療效果，在肺癌的個體化治療中具有里程碑式的意義[8]。研究顯示TKIs治療晚期NSCLC的療效受到EGFR基因突變狀態(tài)的影響，只有EGFR基因?yàn)橥蛔冃偷幕颊卟拍軓脑擃惏邢蛩幬锏闹委熤蝎@益[9]。因此，EGFR基因突變狀態(tài)可作為能否采用 EGFR酪氨酸酶抑制劑的重要依據(jù)。

根據(jù)國內(nèi)有關(guān)文獻(xiàn)報道，中國不同種族及同一種族不同地區(qū)的NSCLC患者EGFR突變存在明顯差異。本研究結(jié)果顯示，深圳地區(qū)NSCLC患者EGFR基因總突變率為38.8%，高于趙瑾等[10]報道湖南地區(qū)的35.3%和盧天龍等[11]報道青海地區(qū)31.3%，低于鄭軍等[12]報道湖南地區(qū)45.8%和劉安等[13]報道蚌埠地區(qū)的43.8%，明顯高于王劍蓉等報道江蘇地區(qū)的28.37%[14]，而與林群英等[15]報道莆田地區(qū)的37.7%和唐艷萍等[16]報道廣西地區(qū)的40.1%相一致，進(jìn)一步證實(shí)我國不同地區(qū)NSCLC患者EGFR基因突變存在差異，原因目前尚不明了，需進(jìn)一步深入研究，可能與不同地區(qū)人群的遺傳背景、生活環(huán)境和發(fā)病機(jī)制的差異等因素有關(guān)。

腫瘤的EGFR突變體最主要出現(xiàn)在EGFR酪氨酸激酶編碼區(qū)，集中在18~21外顯子，占突變類型的90%以上，多為框內(nèi)缺失性突變或替代突變[17，18]。不同地區(qū)NSCLC患者EGFR基因突變的類型存在很大差異，如北京和上海地區(qū)EGFR基因第l9和21外顯子突變占總突變率的比例相近，約45%；廣東地區(qū)EGFR突變以第l9外顯子為主，突變占59.1%，21外顯子突變占27.3%；云南地區(qū)19外顯子突變占36.2%，外顯子21突變罕見，僅為1.72%；臺灣地區(qū)EGFR突變以第21外顯子為主，占總突變的76%。本研究結(jié)果顯示，深圳地區(qū)NSCLC患者EGFR基因突變主要以21外顯子為主，其次為19外顯子，突變率分別為57.5%和35.0%，說明深圳地區(qū)NSCLC患者對TKIs藥物治療有一定的敏感性，但18和20外顯子也出現(xiàn)了2.5%和5.0%的EGFR基因突變率，說明深圳地區(qū)已有極小部分NSCLC患者對吉非替尼和厄羅替尼產(chǎn)生了抗性。因此，深圳地區(qū)NSCLC患者使用TKIs藥物治療前進(jìn)行EGFR基因突變情況檢測非常必要。

本研究結(jié)果顯示，腺癌患者EGFR基因突變率為48.7%，高于非腺癌的11.1%；不同年齡段NSCLC患者EGFR基因突變率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但女性EGFR基因突變率為52.4%，明顯高于男性的29.5%，不吸煙者56.1%明顯高于吸煙者的17.4%，不同性別吸煙NSCLC患者EGFR基因突變率也存在一定的差異性。因此，NSCLC患者在應(yīng)用TKIs靶向藥物治療前進(jìn)行EGFR基因突變狀態(tài)檢測，對指導(dǎo)及獲得更佳的治療具有重要的臨床意義。

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Analysis of EGFR Gene Mutation in 103 Patients with Non-small Cell Lung Cancer in Shenzhen

WANG Li-fa，LIU Ai-sheng，YU Shu-lin，et al.
Micro Inspection Department of Shenzhen Luohu District，the Center of Disease Control and Prevention，Guangdong 518020

Objective To understand non-small cell lung cancer（NSCLC）epidermal growth factor receptor（EGFR） mutations in Shenzhen，and to provide a basis for target therapy of NSCLC patients. Methods collected from March 2013 to November 2015 in shenzhen area three level 3 district hospital，One hundred and three cases of NSCLC cancer tissues were collected in 3 hospitals from 2013 to 2015，and DNA was extracted followed by detections of EGFR gene mutation in exon 18，19，20 and 2l using mutations specific amplification system （ARMS） amplification. Results All of 103 cases of NSCLC showed an EGFR gene mutation rate of 38.8% （40/103），among them 18，19，20 and 21 exon mutations rates were 2.5%（1/40），35.0%（14/40），5.0%（2/40），and 57.5%（23/40），respectively. EGFR mutation rate was 48.7% （37/76）in patients with adenocarcinoma，higher than 11.1%（3/27）in the patients with nonadenocarcinoma.（χ2=25.617，P<0.01）. EGFR mutation rate in NSCLC patients of nonsmookers was 56.1% （32/57），significantly higher than the smooker patients（ 17.4%，8/46） （χ2=20.195，P<0.01）. The mutation rate in female patients was 52.4%（22/42），higher than that of the male （29.5%，18/61）（χ2=5.127，P<0.05）. The patients below 56 years exhibited an EGFR mutation rate of 39.5% （17/43），compared to those over 56 years （38.3%，23/60）（χ2=0.618，P>0.618）.Conclusion EGFR mutations in NSCLC patients are mainly composed of exon 21，followed by exon19. Adenocarcinoma，femal，and nonsmoker patients seem to be the risk factors of EGFR gene mutation.

Non-small cell lung cancer Epidermal growth factor receptor Gene mutations

R734.2 R34

A

1671-2587（2017）03-0248-03

2016-11-11）

（本文編輯：王敏）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.03.012

*本課題受廣東省深圳市龍華新區(qū)科技創(chuàng)新項(xiàng)目（No.2015-0924A103085）資助

518020 廣東省深圳市羅湖區(qū)疾病預(yù)防控制中心微檢科（王禮法）；深圳市龍華新區(qū)人民醫(yī)院（劉愛勝，余樹林）；深圳市龍華新區(qū)中心醫(yī)院（施俊柱，程文德）；深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（劉小君）

王禮法（1982–），男，主管技師，學(xué)士，主要從事分子生物學(xué)及微生物工作，（E-mail）wanglifa321@163.com。