美國CLSI M52和CNAS指南關于商品化微生物鑒定系統(tǒng)及藥敏試驗系統(tǒng)驗證方法的比較*

黃鈺竹，王薇，趙海建，王治國(.北京醫(yī)院國家老年醫(yī)學中心，衛(wèi)生部臨床檢驗中心/北京市臨床檢驗工程技術研究中心，北京 00730；2.北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院，北京 00730)

·專題筆談·

美國CLSI M52和CNAS指南關于商品化微生物鑒定系統(tǒng)及藥敏試驗系統(tǒng)驗證方法的比較*

黃鈺竹1,2，王薇1，趙海建1，王治國1,2
(1.北京醫(yī)院國家老年醫(yī)學中心，衛(wèi)生部臨床檢驗中心/北京市臨床檢驗工程技術研究中心，北京 100730；2.北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院，北京 100730)

美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI)在2015年發(fā)布了文件M52-商品化微生物鑒定及藥敏試驗系統(tǒng)的驗證研究，旨在為執(zhí)行驗證研究的實驗室提供指導性建議。在實驗室將商品化微生物鑒定系統(tǒng)和藥敏試驗系統(tǒng)應用到常規(guī)檢測之前，應對未加修改而使用的已確認的檢驗程序進行獨立驗證。該文將CLSI文件M52和中國合格評定國家認可委員會(CNAS)指南中關于商品化微生物鑒定系統(tǒng)及藥敏試驗系統(tǒng)的驗證方法進行比較，結合國內臨床微生物實驗室的部分情況，分析對比兩者之間的差異，以供國內臨床微生物實驗室制定符合自身情況的驗證方案。

微生物鑒定系統(tǒng)；藥敏試驗系統(tǒng)；驗證方法；商品化

當實驗室引入商品化微生物鑒定系統(tǒng)(microbial identification system，MIS)或藥敏試驗系統(tǒng)(antimicrobial susceptibility testing system，ASTS)時，或當前使用系統(tǒng)發(fā)生重要改變時，美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI) M52文件[1]要求進行驗證研究。實驗室應從制造商或方法開發(fā)者處獲得相關信息，以確定檢驗程序的性能特征[2]。驗證研究的目的在于驗證當前系統(tǒng)是否滿足廠商規(guī)范，實驗室人員檢驗得到正確及可重復結果的能力以及實驗室是否滿足監(jiān)管要求。驗證過程證實的檢驗程序的性能指標應與檢驗結果的預期用途相關[2]。M52 提及的驗證性能指標包括正確度、精密度(重復性)、檢測結果的報告范圍以及廠商參考范圍是否適用于實驗室患者。該文件同時給出了驗證過程的具體流程，包括執(zhí)行驗證前活動、準備驗證協(xié)議、執(zhí)行驗證檢測(MIS和/或ASTS)、判斷是否滿足可接受標準、解決差異結果、記錄結果、實驗室主管審查等[1]。臨床微生物實驗室可參考其流程，結合中國合格評定國家認可委員會(China National Accreditation Service for Conformity Assessment, CNAS)指南[2-3]，制定針對各個微生物實驗室的驗證方案。

1 驗證要求

實驗室在進行驗證前，可參考CLSI文件EP23TM[4]評估實驗室相關風險，并在執(zhí)行驗證研究時，至少保證30個樣品量。CLSI M52要求廠商在驗證開始前安裝儀器、檢查系統(tǒng)能否正常運行，實驗室須針對新系統(tǒng)的使用及驗證過程的執(zhí)行培訓相關人員，并在驗證開始前用廠商推薦的質控菌株獲得可接受結果。

細菌鑒定和藥敏系統(tǒng)的驗證，應按優(yōu)先順序依次選擇標準菌株、質控菌株或其他已知菌株對商品化鑒定系統(tǒng)(包括自動、半自動、手工)每種板(條/卡/管)的鑒定/藥敏結果符合性進行驗證[2]。驗證開始前實驗室須根據(jù)分析類型及用途制定驗證方案，確定驗證計劃和可接受標準。CNAS指南GL41[2]定義定量檢測的可接受標準的方法之一是根據(jù)醫(yī)學和臨床要求確定總允許誤差，定性檢測的可接受標準可以用一致率(符合率)表達。CNAS指南CL42[3]提供了微生物鑒定和抗菌藥物敏感性試驗程序須滿足的具體要求，微生物鑒定所選擇的涂片、染色技術、培養(yǎng)基應能從樣品中分離、識別相應的病原菌，鑒定方法應符合要求；明確傷口樣品培養(yǎng)程序，深部傷口感染應至少包括樣品采集、需氧菌及厭氧菌的培養(yǎng)及鑒定；厭氧菌培養(yǎng)時間與樣品類型、診斷有關，在第一次培養(yǎng)評估之前應有足夠的培養(yǎng)時間(至少48 h)。

目前國內臨床微生物實驗室在采用新批號及新貨次的MIS和ASTS試劑時，都會采用相應的配套的質控物質(質控菌株)進行常規(guī)質控，并根據(jù)各自實驗室的工作特點和具體情況對質控頻率進行動態(tài)調整，以驗證其性能是否滿足要求，實驗室均存有每批號產品質量控制試驗合格等文件[5]。關于MIS和ASTS試劑及耗材的驗證要求，CNAS指南CL42詳細給出了具體的方案，可供實驗室參考。

2 驗證方案

2.1 樣本選擇 質控菌株的檢測僅僅是MIS和ASTS驗證的一部分，實驗室應根據(jù)檢測系統(tǒng)的類型選擇合適的菌株類型和數(shù)量。就MIS驗證過程的樣本選擇而言，CLSI M52建議根據(jù)MIS的預期用途選擇檢測菌種的類型。對于鑒定范圍廣泛的實驗室須審查實驗室所有分離菌種的分布和頻率，如此便能測定80%～90%實驗室通常分離的菌種，建議每個菌種檢測3～5株菌；對于新引入系統(tǒng)或系統(tǒng)發(fā)生變化的實驗室，每個應用(如新的生化平板)應至少檢測30株菌[1]。檢測的菌種類型應包括：經MIS鑒定的菌種、腸桿菌科中的常見菌種、不常見的病原體如非發(fā)酵菌、革蘭陽性菌、其他在特定患者人群中出現(xiàn)的菌種(如酵母菌或苛養(yǎng)菌)及MIS數(shù)據(jù)庫中的菌種。菌株可來自臨床，也可從其他途徑獲得，如商品化菌種保存處和/或能力驗證(proficiency testing，PT)調查中保存的菌株。CNAS指南GL41建議按優(yōu)先順序依次選擇標準菌株、質控菌株或其他已知菌株，試驗應覆蓋實驗室使用的全部卡片種類和/或方法。參照廠商說明書選擇菌株種類，包括臨床留樣菌株和標準/質控菌株，每種類型應至少1株，總體不少于20 株[2]。大型醫(yī)院患病群體復雜，微生物種類多，因此該類醫(yī)院應對更多的菌株進行評估，驗證菌株的選擇應考慮樣本獲取難易程度及患者等因素。

就ASTS驗證過程的樣本選擇而言，國內多數(shù)醫(yī)院的臨床微生物實驗室對藥敏系統(tǒng)的驗證僅限于使用質控菌株對已知的抗菌藥物進行敏感性測試[6]，這往往不足以保證驗證后的ASTS性能符合要求。CNAS指南給出的驗證方案是使用藥敏質控菌株和根據(jù)廠家說明書要求的藥敏卡驗證藥敏試驗系統(tǒng)性能。要求既保證藥敏試驗的準確性，又要確保耐藥菌株的檢出敏感性。CLSI M52要求進行ASTS驗證時，每藥敏板至少檢測30株菌。選擇菌株類型時還應考慮板卡類型、每個藥敏試劑的活性譜[7]、檢測范圍、敏感和非敏感表型。建議使用新鮮臨床菌株、來自實驗室的凍存菌株、質粒攜帶耐藥基因菌株，也可用來自PT調查或其他來源的菌株。檢測前，再次培養(yǎng)所有凍存菌株并保證培養(yǎng)時間的時效性(不超過24 h)。

2.2 驗證方法 CNAS指南GL41給出關于MIS的驗證方法是讓實驗室根據(jù)廠商說明書或實驗室檢測程序規(guī)定對驗證菌株進行檢測，鑒定水平一般是種。對于特殊類型的微生物(如棒狀桿菌、厭氧菌和芽胞桿菌)，可鑒定到屬水平。指南中還給出了血清學鑒定試驗的驗證方案，包括沙門菌、志賀菌、致病性大腸埃希菌等，菌株類型根據(jù)當?shù)匦l(wèi)生行政管理和實驗室具體情況選擇，每種本地區(qū)常見血清型菌株至少1株。關于ASTS的驗證，CNAS指南CL42中的方案：連續(xù)檢測20～30 d，每一組藥物/細菌的抑菌圈直徑或最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)超出參考范圍的頻率應不超過1/20或3/30；也可采用替代質控方案，即連續(xù)5 d，每天對每一組藥物/細菌重復測定3次，每次單獨制備接種物，15個數(shù)據(jù)中超出參考范圍(抑菌圈直徑或 MIC)的結果應不超過1個，若失控結果為2～3個，則如前述，再進行5 d，每天3次重復試驗，30個數(shù)據(jù)失控結果應不超過3個。以上驗證結果通過后可轉為每周使用標準菌株進行質控。若檢測頻率小于每周1次，則應在每個檢測日進行質控。用自動或半自動儀器檢測MIC時，應按照制造商要求進行質控。

CLSI M52認為精密度(重復性)和正確度是MIS和ASTS驗證過程中最重要的性能指標，驗證方法就兩個指標展開。為檢測MIS的精密度，可選用MIS完整質控數(shù)據(jù)集的一個有代表性的子集，其中應包括MIS的關鍵指示菌株和臨床菌株。最少檢測5株菌株(質控或臨床菌株)，每株菌檢測3次，同時應比較鑒定結果和非個體基質效應?？紤]ASTS的精密度時，應考慮藥敏試劑±1個稀釋度的變化(抗真菌試劑應考慮±2個稀釋度的變化)，使用有代表性的質控菌株子集和臨床菌株，至少檢測5株菌(質控或臨床菌株)，每株菌檢測3次，可在同一天或多天內進行檢測，不要求用當前系統(tǒng)檢測菌株。當評估ASTS的精密度時，至少95%的菌株檢測結果應在基本一致(essential agreement，EA)內，至少95%的質控菌株結果應在質控范圍內。

評估ASTS正確度時，首先選擇適當?shù)膮⒖挤椒ā嶒炇铱蓪⑿乱氲乃幟粼囼炏到y(tǒng)和當前或已驗證的ASTS進行比較。若當前未使用商品化的ASTS，則可用新引入的ASTS檢測已知藥敏結果的保存菌株；或者將新引入ASTS的藥敏結果與參考實驗室的檢測結果進行比較，其中參考實驗室指的是經美國臨床檢驗改進修正計劃(Clinical Laboratory Improvement Amendments，CLIA)認證的商業(yè)性實驗室或其他應用已驗證過ASTS的診斷實驗室。實驗室也可將新引入的ASTS與參考方法(如紙片擴散法或肉湯微量稀釋法)進行比較加以驗證。如果新系統(tǒng)與當前系統(tǒng)等效或更好，則認為該測試是有效的。其次分析ASTS結果時應考慮分類一致(category agreement，CA)(新系統(tǒng)和當前系統(tǒng)對敏感、中介和耐藥結果的一致性)及EA(如新系統(tǒng)的一個細菌MIC結果在舊系統(tǒng)MIC結果的一個稀釋度內；新系統(tǒng)的一個酵母菌MIC結果在舊系統(tǒng)MIC結果的2個稀釋度內)的評估?？山邮苄阅芤驝A和EA的一致性均≥90%[1]。

2.3 可接受標準 CNAS指南GL41建議用一致性(符合率)表達定性檢測結果的可接受標準，并給出了微生物鑒定的具體符合率供實驗室參考，即標準/質控菌株的符合率應為100%，臨床菌株的符合率應在90%以上，血清學鑒定試驗要求準確率100%。如若未能滿足要求，則該檢測系統(tǒng)不能通過驗證或者制造商和/或使用者須采取措施，修正后的檢測系統(tǒng)應再次進行驗證。實驗室將新的藥敏試驗系統(tǒng)應用于臨床前，須滿足質控要求，通過后在日常檢測中轉為室內控制要求。實驗室應對較大和重大偏差進行分析[2]。

CLSI M52就MIS和ASTS的質量控制和可接受標準給出了詳細的方案。一旦證明MIS可提供重復性結果，則無需對整個驗證過程進行質量控制，除非廠商說明書要求執(zhí)行。當MIS新系統(tǒng)顯示錯誤或不顯示鑒定結果時，要求在鑒定前進行額外檢測。實驗室須詳細審查MIS新系統(tǒng)的結果差異類型，若新系統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫不包括當前系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中的部分菌株，則考慮用替代方法檢測這些菌株。實驗室無需對每一菌株進行驗證，報告菌株鑒定結果時，要求額外檢測能使用戶對微生物鑒定結果的正確度滿意。

在ASTS驗證過程中，CLSI M52建議每天對新系統(tǒng)進行質量控制。如CLSI文件M02[8]和M07[9]中所述，微生物實驗室想減少ASTS的質控頻率，將頻率從每日縮減到每周，這些實驗室須使用支持該類改變的數(shù)據(jù)執(zhí)行個體化質量控制方案(individualized quality control plan，IQCP)。廠商在出售藥敏平板前，對美國食品及藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準的每臺儀器和每一藥敏試劑都建立了嚴格的標準(包括EA和生長失敗等)[10-11]。若出現(xiàn)CA和EA≥90%、總耐藥菌株的非常主要差異(very major discrepancy，VMD)或非常主要誤差(very major error，VME)率<3%[12]、總敏感菌株的主要差異或主要誤差率<3%這 3種情況之一時，則考慮ASTS已成功驗證。若檢測系統(tǒng)未滿足任何一項標準，則須進行額外測試。國內大多數(shù)微生物實驗室都建立了微生物檢驗的標準化操作程序(standard operation procedure，SOP)，其中包括微生物鑒定和藥敏試驗質量控制方案和可接受標準[5]，實驗室人員按照SOP進行日常質控工作，以保證結果在可接受范圍之內。但是我國目前沒有統(tǒng)一或公認的臨床微生物實驗室標準，多數(shù)實驗室參照CLSI文件，比如在常規(guī)狀況下，藥敏試驗系統(tǒng)質量控制的質量和頻度按M100[7]執(zhí)行。

3 小結

CLSI文件M52是以美國臨床微生物實驗室為研究中心的文件，其中部分內容反映了美國的監(jiān)管要求，將其與CNAS指南中關于商品化微生物鑒定系統(tǒng)和藥敏試驗系統(tǒng)驗證方法的內容進行對比，兩者存在較大差異。CLSI M52提供的驗證方法適用于當實驗室新引入微生物檢測系統(tǒng)，或實驗室采用新的鑒定培養(yǎng)基、藥敏試劑、數(shù)據(jù)庫、軟件或硬件而造成系統(tǒng)更新時，主要針對商品化微生物鑒定系統(tǒng)和藥敏試驗系統(tǒng)。而CNAS指南提供了包括顯微鏡檢查、分離培養(yǎng)和鑒定、藥物敏感試驗等在內的各項微生物檢驗活動的驗證要求及方案，其中CNAS指南CL42詳盡列出了關于檢驗前、中、后的具體注意事項。我國臨床微生物實驗室可參考其中的差異，結合實驗室的具體情況制定驗證方案。

[1]Clinical and Laboratory Standards Institute. Verification of commercial microbial identification and antimicrobial susceptibility testing systems[S]. CLSI guideline M52-Ed1.Wayne, PA: CLSI, 2015.

[2]中國合格評定國家認可委員會. 臨床微生物檢驗程序驗證指南[Z]. CNAS-GL41: 2016.

[3]中國合格評定國家認可委員會. 醫(yī)學實驗室質量和能力認可準則在臨床微生物學檢驗領域的應用說明[Z]. CNAS-CL42: 2012.

[4]Clinical and Laboratory Standards Institute. Laboratory quality control based on risk management; approved guideline[S]. CLSI document EP23-ATM. Wayne, PA: CLSI, 2011.

[5]熊紫薇, 王新華, 易凱, 等. 臨床微生物檢驗全面質量控制的應用體會[J]. 中國醫(yī)藥指南, 2016, 14(15)：286-287.

[6]徐月林, 李曉莉, 楊仁洪, 等. 臨床微生物實驗室藥敏紙片片間均勻性差異的實時監(jiān)測和藥敏質控試驗頻率的動態(tài)調整[J]. 中國抗生素雜志, 2016, 41(6)：478-480.

[7]Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; Twenty-fifth informational supplement[S]. CLSI document M100-S25. Wayne, PA: CLSI, 2015.

[8]Clinical and Laboratory Standards InstituteI. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests; approved standards-twelfth edition[S]. CLSI document M02-A12. Wayne, PA: CLSI, 2015.

[9]Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standards-tenth edition[S]. CLSI document M07-A10. Wayne, PA: CLSI, 2015.

[10]US Food and Drug Administration. Procedures for class II device exemptions from premarket notification, guidance for industry and CDRH staff [S]. https://www.fda.gov/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/ucm080198.htm. Accessed July 22, 2015.

[11]US Food and Drug Administration. ClassⅡspecial controls guidance document: antimicrobial susceptibility test(AST) systems: guidance for industry and FDA[S].http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm080564.htm.Accessed July 17, 2015.

[12]Jorgensen JH, Ferraro MJ. Antimicrobial susceptibility testing: a review of general principles and contemporary practices [J]. Clin Infect Dis, 2009, 49(11): 1749-1755.

(本文編輯：周萬青，劉群)

北京市自然科學基金(7143182)；北京醫(yī)院課題(BJ-2015-025)。

黃鈺竹，1995年生，女，碩士研究生，研究方向為實驗室質量管理。

王治國，E-mail:zgwang@nccl.org.cn。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.04.18

R446.5

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2017-02-06)